Name: technical applications of microelectrode array and patch clamp recordings on human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes
Uploaded: 2022-08-04T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Technical Applications of Microelectrode Array and Patch Clamp Recordings on Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes at JoVE.com

Vi takker Blake Wu for korrekturlesing av manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (NIH) R01 HL113006, R01 HL141371, R01 HL163680, R01 HL141851, U01FD005978, og NASA NNX16A069A (JCW), og AHA Postdoctoral Fellowship 872244 (GMP).

1. Utarbeidelse av medier og løsninger
<ol><li>Forbered hiPSC-CM vedlikeholdsmedium ved å blande en 10 ml flaske med 50x B27 supplement og 500 ml RPMI 1640 medium. Oppbevar mediet ved 4 °C og bruk det innen en måned. Juster middels til romtemperatur (RT) før bruk.</li>
	<li>Klargjør hiPSC-CM såmedium ved å blande 20 ml serumerstatning og 180 ml hiPSC-CM vedlikeholdsmedium (10 % fortynning, v/v). Mens nytilberedt såmedium foretrekkes, kan det lagres ved 4 ° C i ikke mer enn 2 uker. Balanser me...

<ol>
	<li>Wouters, O. J., McKee, M., Luyten, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimated+research+and+development+investment+needed+to+bring+a+new+medicine+to+market,+2009-2018.">Estimated research and development investment needed to bring a new medicine to market, 2009-2018.</a> Journal of the American Medical Association. 323 (9), 844-853 (2020).</li><li>Pang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Workshop+report:+FDA+workshop+on+improving+cardiotoxicity+assessment+with+human-relevant+platforms.">Workshop report: FDA workshop on improving cardiotoxicity assessment with human-relevant platforms.</a> Circulation Research. 125 (9), 855-867 (2019).</li><li>Mamoshina, P., Rodriguez, B., Bueno-Orovio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+broader+view+of+mechanisms+of+drug+cardiotoxicity.">Toward a broader view of mechanisms of drug cardiotoxicity.</a> Cell Reports Medicine. 2 (3), 100216 (2021).</li><li>Paik, D. T., Chandy, M., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient+and+disease-specific+induced+pluripotent+stem+cells+for+discovery+of+personalized+cardiovascular+drugs+and+therapeutics.">Patient and disease-specific induced pluripotent stem cells for discovery of personalized cardiovascular drugs and therapeutics.</a> Pharmacological Reviews. 72 (1), 320-342 (2020).</li><li>Kaese, S., Verheule, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+electrophysiology+in+mice:+a+matter+of+size.">Cardiac electrophysiology in mice: a matter of size.</a> Frontiers in Physiology. 3, 345 (2012).</li><li>Clark, W. A., Chizzonite, R. A., Everett, A. W., Rabinowitz, M., Zak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species+correlations+between+cardiac+isomyosins.+A+comparison+of+electrophoretic+and+immunological+properties.">Species correlations between cardiac isomyosins. A comparison of electrophoretic and immunological properties.</a> Journal of Biological Chemistry. 257 (10), 5449-5454 (1982).</li><li>Werfel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+circular+RNAs+in+human,+mouse,+and+rat+hearts.">Characterization of circular RNAs in human, mouse, and rat hearts.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 98, 103-107 (2016).</li><li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+generation+of+human+cardiomyocytes.">Chemically defined generation of human cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li><li>Sharma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+highly+purified+cardiomyocytes+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+using+small+molecule-modulated+differentiation+and+subsequent+glucose+starvation.">Derivation of highly purified cardiomyocytes from human induced pluripotent stem cells using small molecule-modulated differentiation and subsequent glucose starvation.</a> Journal of Visualized Experiments. (97), e52628 (2015).</li><li>Itzhaki, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+the+long+QT+syndrome+with+induced+pluripotent+stem+cells.">Modelling the long QT syndrome with induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 471 (7337), 225-229 (2011).</li><li>Lan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+calcium+handling+properties+underlie+familial+hypertrophic+cardiomyopathy+pathology+in+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells.">Abnormal calcium handling properties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in patient-specific induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 101-113 (2013).</li><li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+diastolic+dysfunction+in+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+from+hypertrophic+cardiomyopathy+patients.">Modelling diastolic dysfunction in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes from hypertrophic cardiomyopathy patients.</a> European Heart Journal. 40 (45), 3685-3695 (2019).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+PDGF+pathway+links+LMNA+mutation+to+dilated+cardiomyopathy.">Activation of PDGF pathway links LMNA mutation to dilated cardiomyopathy.</a> Nature. 572 (7769), 335-340 (2019).</li><li>Sun, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells+as+a+model+for+familial+dilated+cardiomyopathy.">Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy.</a> Science Translational Medicine. 4 (130), (2012).</li><li>Chen, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+PDGFRA+signaling+contributes+to+filamin+C-related+arrhythmogenic+cardiomyopathy.">Activation of PDGFRA signaling contributes to filamin C-related arrhythmogenic cardiomyopathy.</a> Science Advances. 8 (8), (2022).</li><li>Sharma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+of+tyrosine+kinase+inhibitor+cardiotoxicity+with+human+induced+pluripotent+stem+cells.">High-throughput screening of tyrosine kinase inhibitor cardiotoxicity with human induced pluripotent stem cells.</a> Science Translational Medicine. 9 (377), (2017).</li><li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+recapitulate+the+predilection+of+breast+cancer+patients+to+doxorubicin-induced+cardiotoxicity.">Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes recapitulate the predilection of breast cancer patients to doxorubicin-induced cardiotoxicity.</a> Nature Medicine. 22 (5), 547-556 (2016).</li><li>Kitani, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human-induced+pluripotent+stem+cell+model+of+trastuzumab-induced+cardiac+dysfunction+in+patients+with+breast+cancer.">Human-induced pluripotent stem cell model of trastuzumab-induced cardiac dysfunction in patients with breast cancer.</a> Circulation. 139 (21), 2451-2465 (2019).</li><li>Matsa, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+profiling+of+patient-specific+human+iPSC-cardiomyocytes+predicts+individual+drug+safety+and+efficacy+responses+in+vitro.">Transcriptome profiling of patient-specific human iPSC-cardiomyocytes predicts individual drug safety and efficacy responses in vitro.</a> Cell Stem Cell. 19 (3), 311-325 (2016).</li><li>Stillitano, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+susceptibility+to+drug-induced+long+QT+with+a+panel+of+subject-specific+induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling susceptibility to drug-induced long QT with a panel of subject-specific induced pluripotent stem cells.</a> Elife. 6, (2017).</li><li>Zhang, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+to+measure+contraction,+calcium,+and+action+potential+in+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Protocol to measure contraction, calcium, and action potential in human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> STAR Protocols. 2 (4), 100859 (2021).</li><li>Blinova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+multisite+study+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+drug+proarrhythmic+potential+assessment.">International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment.</a> Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).</li><li>Greensmith, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca+analysis:+an+Excel+based+program+for+the+analysis+of+intracellular+calcium+transients+including+multiple,+simultaneous+regression+analysis.">Ca analysis: an Excel based program for the analysis of intracellular calcium transients including multiple, simultaneous regression analysis.</a> Computer Methods and Programs in Biomedicine. 113 (1), 241-250 (2014).</li><li>Ma, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+pathogenicity+of+a+genomic+variant+of+uncertain+significance+using+CRISPR/Cas9+and+human-induced+pluripotent+stem+cells.">Determining the pathogenicity of a genomic variant of uncertain significance using CRISPR/Cas9 and human-induced pluripotent stem cells.</a> Circulation. 138 (23), 2666-2681 (2018).</li><li>Lam, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+the+transcriptome+signatures+of+calcium+channel+blockers+in+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Identifying the transcriptome signatures of calcium channel blockers in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Circulation Research. 125 (2), 212-222 (2019).</li><li>Seeger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+premature+termination+codon+mutation+in+MYBPC3+causes+hypertrophic+cardiomyopathy+via+chronic+activation+of+nonsense-mediated+decay.">A premature termination codon mutation in MYBPC3 causes hypertrophic cardiomyopathy via chronic activation of nonsense-mediated decay.</a> Circulation. 139 (6), 799-811 (2019).</li><li>Zhang, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cryopreservation+on+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+assessing+drug+safety+response+profiles.">Effects of cryopreservation on human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for assessing drug safety response profiles.</a> Stem Cell Reports. 16 (1), 168-181 (2021).</li><li>Yu, B., Zhao, S. R., Yan, C. D., Zhang, M., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconvoluting+the+cells+of+the+human+heart+with+iPSC+technology:+cell+types,+protocols,+and+uses.">Deconvoluting the cells of the human heart with iPSC technology: cell types, protocols, and uses.</a> Current Cardiology Reports. 24 (5), 487-496 (2022).</li><li>Thomas, D., Cunningham, N. J., Shenoy, S., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human-induced+pluripotent+stem+cells+in+cardiovascular+research:+current+approaches+in+cardiac+differentiation,+maturation+strategies,+and+scalable+production.">Human-induced pluripotent stem cells in cardiovascular research: current approaches in cardiac differentiation, maturation strategies, and scalable production.</a> Cardiovascular Research. 118 (1), 20-36 (2022).</li><li>Zhu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+developmental+cues+for+the+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Physical developmental cues for the maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 5 (5), 117 (2014).</li><li>Feyen, D. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+maturation+media+improve+physiological+function+of+human+iPSC-derived+cardiomyocytes.">Metabolic maturation media improve physiological function of human iPSC-derived cardiomyocytes.</a> Cell Reports. 32 (3), 107925 (2020).</li><li>Gintant, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+in+preclinical+cancer+drug+cardiotoxicity+testing:+a+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association.">Use of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in preclinical cancer drug cardiotoxicity testing: a scientific statement from the American Heart Association.</a> Circulation Research. 125 (10), 75-92 (2019).</li><li>Kussauer, S., David, R., Lemcke, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hiPSCs+Derived+cardiac+cells+for+drug+and+toxicity+screening+and+disease+modeling:+what+micro-+electrode-array+analyses+can+tell+us.">hiPSCs Derived cardiac cells for drug and toxicity screening and disease modeling: what micro- electrode-array analyses can tell us.</a> Cells. 8 (11), (2019).</li><li>Ng, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+phenotyping+of+heteromeric+human+ether-a-go-go-related+gene+potassium+channel+variants+can+discriminate+pathogenic+from+rare+benign+variants.">High-throughput phenotyping of heteromeric human ether-a-go-go-related gene potassium channel variants can discriminate pathogenic from rare benign variants.</a> Heart Rhythm. 17 (3), 492-500 (2020).</li><li>Obergrussberger, A., Friis, S., Bruggemann, A., Fertig, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+patch+clamp+in+drug+discovery:+major+breakthroughs+and+innovation+in+the+last+decade.">Automated patch clamp in drug discovery: major breakthroughs and innovation in the last decade.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 16 (1), 1-5 (2021).</li><li>Kozek, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+discovery+of+trafficking-deficient+variants+in+the+cardiac+potassium+channel+KV11.1.">High-throughput discovery of trafficking-deficient variants in the cardiac potassium channel KV11.1.</a> Heart Rhythm. 17 (12), 2180-2189 (2020).</li><li>Heyne, H. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+functional+effects+of+missense+variants+in+voltage-gated+sodium+and+calcium+channels.">Predicting functional effects of missense variants in voltage-gated sodium and calcium channels.</a> Science Translational Medicine. 12 (556), (2020).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+automated+patch-clamp+platform+for+electrophysiological+and+pharmacological+evaluation+of+hiPSC-CMs.">Establishment of an automated patch-clamp platform for electrophysiological and pharmacological evaluation of hiPSC-CMs.</a> Stem Cell Research. 41, 101662 (2019).</li><li>Li, W., Luo, X., Ulbricht, Y., Guan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blebbistatin+protects+iPSC-CMs+from+hypercontraction+and+facilitates+automated+patch-clamp+based+electrophysiological+study.">Blebbistatin protects iPSC-CMs from hypercontraction and facilitates automated patch-clamp based electrophysiological study.</a> Stem Cell Research. 56, 102565 (2021).</li><li>Milligan, C. J., M&#246;ller, C., Gamper, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Ion Channels: Methods and Protocols. , 171-187 (2013).</li></ol>

Human iPSC-teknologi har dukket opp som en kraftig plattform for sykdomsmodellering og narkotikascreening. Her beskriver vi en detaljert protokoll for måling av hiPSC-CM kontraktilitet, feltpotensial, aksjonspotensial og Ca2+ transient. Denne protokollen gir en omfattende karakterisering av hiPSC-CM kontraktilitet og elektrofysiologi. Disse funksjonelle analysene har blitt brukt i flere publikasjoner fra vår gruppe 12,13,18,24,25,26,27.<su...

Narkotikautvikling er en lang og kostbar prosess. En studie av nye terapeutiske legemidler godkjent av US Food and Drug Administration (FDA) mellom 2009 og 2018 rapporterte at den estimerte mediankostnaden for kapitalisert forskning og kliniske studier var $ 985 millioner per produkt1. Legemiddelindusert kardiotoksisitet er den viktigste årsaken til legemiddelslitasje og tilbaketrekning fra markedet2. Spesielt er kardiotoksisitet rapportert blant flere klasser av terapeutiske legemidler3. Derfor er hjertesikkerhetsvurdering en avgjørende komponent i legemiddelutviklingsprosessen. Det nåværende paradigmet for hjertesikkerhetsvurdering er fortsatt svært avhengig av dyremodeller. Imidlertid blir artsforskjeller fra bruk av dyremodeller i økende grad anerkjent som en primær årsak til unøyaktige spådommer for legemiddelindusert kardiotoksisitet hos mennesker4. For eksempel varierer morfologien til hjertets handlingspotensial vesentlig mellom mennesker og mus på grunn av bidragene fra forskjellige repolariserende strømmer5. I tillegg er differensialisoformer av hjertemyosin og sirkulære RNA som kan påvirke hjertefysiologien godt dokumentert blant art 6,7. For å bygge bro over disse hullene er det viktig å etablere en pålitelig, effektiv og menneskebasert modell for preklinisk hjertesikkerhetsvurdering.
Den banebrytende oppfinnelsen av indusert pluripotent stamcelleteknologi (iPSC) har generert enestående narkotikascreening og sykdomsmodelleringsplattformer. I løpet av det siste tiåret har metoder for å generere menneskeskapte pluripotente stamcelleavledede kardiomyocytter (hiPSC-CMs) blitt godt etablert 8,9. hiPSC-CMs har tiltrukket seg stor interesse for deres potensielle anvendelser i sykdomsmodellering, legemiddelindusert kardiotoksisitetsscreening og presisjonsmedisin. For eksempel har hiPSC-CM blitt brukt til å modellere de patologiske fenotypene av hjertesykdommer forårsaket av genetisk arv, for eksempel lang QT-syndrom10, hypertrofisk kardiomyopati 11,12 og dilatert kardiomyopati13,14,15. Følgelig har viktige signalveier involvert i patogenesen av hjertesykdommer blitt identifisert, noe som kan kaste lys over potensielle terapeutiske strategier for effektiv behandling. Videre har hiPSC-CM blitt brukt til å screene legemiddelindusert kardiotoksisitet assosiert med kreftmidler, inkludert doksorubicin, trastuzumab og tyrosinkinasehemmere16,17,18; Strategier for å redusere den resulterende kardiotoksisiteten er under utredning. Endelig tillater den genetiske informasjonen som beholdes i hiPSC-CMs screening og prediksjon av legemiddelindusert kardiotoksisitet på både individ- og populasjonsnivå19,20. Samlet har hiPSC-CMs vist seg å være et uvurderlig verktøy for personlig hjertesikkerhetsprediksjon.
Det overordnede målet med denne protokollen er å etablere metoder for omfattende og effektivt å undersøke de funksjonelle egenskapene til hiPSC-CM, som er av stor betydning for å anvende hiPSC-CM mot sykdomsmodellering, legemiddelindusert kardiotoksisitetsscreening og presisjonsmedisin. Her beskriver vi en rekke funksjonelle analyser for å vurdere de funksjonelle egenskapene til hiPSC-CMs, inkludert måling av kontraktilitet, feltpotensial, handlingspotensial og kalsiumhåndtering (Ca2+) (figur 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35 mm glass bottom dish with 20 mm micro-well #1.5 cover glass</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>D35-20-1.5-N</td>
			<td>Patch clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50x B27 supplements</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>hiPSC-CM culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well culture plate</td>
			<td>E &#38; K Scientific</td>
			<td>EK-27160</td>
			<td>hiPSC-CM culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well flat clear bottom black polystyrene TC-treated microplates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3603</td>
			<td>Contraction motion measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6964</td>
			<td>Enzymatic dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axion&#39;s Integrated Studio (AxIS)</td>
			<td>Axion Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>navigator software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>BF 100-50-10,</td>
			<td>Patch clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 1 M in H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>21115</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting chamber slides</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
			<td>Cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoView 48-well MEA plates</td>
			<td>Axion Biosystems</td>
			<td>M768-tMEA-48B</td>
			<td>MEA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco/Life Technologies</td>
			<td>12634028</td>
			<td>Extracellular matrix medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-190-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td>Intracellular pipette solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPC 10 USB&#160;patch clamp amplifier</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>89-5000</td>
			<td>Patch clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2, AM, cell permeant</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>F1221</td>
			<td>Ca2+ transient measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hiPSCs</td>
			<td>Stanford Cardiovascular Institute iPSC Biobank</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>529552</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10828-028</td>
			<td>hiPSC-CM seeding medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH 8&#160;M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4494</td>
			<td>Intracellular pipette solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda DG 4</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td></td>
			<td>Ca2+ transient measurement; ultra-high-speed wavelength switching light source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna-FL automated fluorescence cell counter</td>
			<td>WISBIOMED</td>
			<td>LB-L20001</td>
			<td>Cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maestro Pro&#160;MEA system</td>
			<td>Axion Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>MEA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>Extracellular matrix medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9187</td>
			<td>Intracellular pipette solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH 10&#160;M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>72068</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements AR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127 (20% Solution in DMSO)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P3000MP</td>
			<td>Ca2+ transient measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11875-119</td>
			<td>hiPSC-CM culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sony SI8000 Cell Motion Imaging System</td>
			<td>Sony Biotechnology</td>
			<td></td>
			<td>Contraction motion measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutter Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-97</td>
			<td>Patch clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue stain</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>T10282</td>
			<td>Cell counting</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

technical applications of microelectrode array and patch clamp recordings on human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes

Narkotika-indusert kardiotoksisitet er den ledende årsaken til narkotika slitasje og tilbaketrekking fra markedet. Bruk av egnede prekliniske evalueringsmodeller for hjertesikkerhet er derfor et kritisk skritt under legemiddelutvikling. For tiden er hjertesikkerhetsvurdering fortsatt svært avhengig av dyreforsøk. Dyremodeller er imidlertid plaget av dårlig translasjonsspesifisitet for mennesker på grunn av artsspesifikke forskjeller, spesielt når det gjelder hjerteelektrofysiologiske egenskaper. Det er derfor et presserende behov for å utvikle en pålitelig, effektiv og menneskebasert modell for preklinisk hjertesikkerhetsvurdering. Menneskeskapte pluripotente stamcelleavledede kardiomyocytter (hiPSC-CMs) har dukket opp som en uvurderlig in vitro-modell for legemiddelindusert kardiotoksisitetsscreening og sykdomsmodellering. hiPSC-CM kan fås fra personer med ulik genetisk bakgrunn og ulike syke tilstander, noe som gjør dem til et ideelt surrogat for å vurdere legemiddelindusert kardiotoksisitet individuelt. Derfor må metoder for å undersøke de funksjonelle egenskapene til hiPSC-CM etableres. I denne protokollen beskriver vi ulike funksjonelle analyser som kan vurderes på hiPSC-CMs, inkludert måling av kontraktilitet, feltpotensial, handlingspotensial og kalsiumhåndtering. Samlet sett har inkorporering av hiPSC-CM i preklinisk hjertesikkerhetsvurdering potensial til å revolusjonere legemiddelutvikling.

Denne protokollen beskriver hvordan man måler kontraksjonsbevegelse, feltpotensial, handlingspotensial og Ca2+ transient av hiPSC-CMs. Et skjematisk diagram inkludert enzymatisk fordøyelse, cellesåing, vedlikehold og funksjonell analyseledning er vist i figur 1. Dannelsen av hiPSC-CM-monolaget er nødvendig for måling av kontraksjonsbevegelse (figur 2B). Et representativt spor av sammentreknings-avslapningsbevegelsen til hiPSC-CM er vist i <strong...

Watch this Scientific Journal Video about Technical Applications of Microelectrode Array and Patch Clamp Recordings on Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes at JoVE.com

Technical Applications of Microelectrode Array and Patch Clamp Recordings on Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Menneskeskapte pluripotente stamcelleavledede kardiomyocytter (hiPSC-CMs) har dukket opp som en lovende in vitro-modell for legemiddelindusert kardiotoksisitetsscreening og sykdomsmodellering. Her beskriver vi en protokoll for måling av kontraktilitet og elektrofysiologi av hiPSC-CM.

Tekniske anvendelser av mikroelektrodematrise og patchklemmeopptak på humaninduserte pluripotente stamcelleavledede kardiomyocytter

Drug-induced cardiotoxicity is the leading cause of drug attrition and withdrawal from the market. Therefore, using appropriate preclinical cardiac safety ...

Hjertesikkerhetsvurdering er en avgjørende komponent i legemiddelutviklingsprosessen. Humane iPSC-avledede kardiomyocytter har vist seg å være en pålitelig, effektiv og menneskebasert modell for preklinisk hjertesikkerhetsvurdering. Vi har etablert metoder for omfattende å undersøke den funksjonelle egenskapen til humane iPSC-avledede kardiomyocytter, som er av virkelig viktig sykdomsmodellering, legemiddelindusert kardiotoksisitetsscreening og presisjonsmedisin.Den økende inkorporeringen av humane iPSC-avledede kardiomyocytter i standard prekliniske sikkerhetsevalueringsprosess har potensial til å forbedre nøyaktigheten av toksisitetsprediksjon av kandidatens forbindelser. Begynn med å dyrke de humane iPSC-avledede kardiomyocytter i minst 10 dager før målingen tas. Slå på temperaturregulatoren og sett den på 37 grader celsius.Slå på mikroskopet, kameraet og karbondioksidforsyningen. Fyll vannkappen på plateholderen med en passende mengde sterilt avionisert vann. Plasser 96-brønnplaten på plateholderen, og inkuber cellene i minst fem minutter.Åpne visningsprogramvaren, og sett deretter kameraets bildefrekvens til 75 bilder per sekund, og video- eller bildeoppløsningen til 1024 x 1024 piksler. Bruk autofokus og automatisk lysstyrkefunksjoner, ta opp videoer og bilder av humane iPSC-avledede kardiomyocytter. Plasser forsiktig en åtte mikroliter dråpe med ekstra cellulær matrisebeleggløsning over opptakselektrodeområdet til hver brønn i de 48 brønnmikroelektrodematriseplatene.Tilsett deretter tre milliliter sterilt avionisert vann til området rundt brønnene for å forhindre fordampning av beleggløsning. Bruk en 200 mikroliter pipettespiss til å fjerne det meste av det ekstra cellulære matriksmediet fra brønnoverflaten i samme enkelt rad eller kolonne uten å berøre elektrodene. Frø 50.000 celler per brønn i en åtte mikroliter dråpe av såmedium over opptakselektrodeområdet.Gjenta til alle brønnene er belagt med celler. Inkuber deretter mikroelektrodematriseplatene i en fuktet cellekulturinkubator. Tilsett sakte 150 mikroliter såmedium til hver brønn i mikroelektrodeplatene.På dag 10 etter plating, kontroller tettheten av spontan juling av humant iPSC CM-monolag under et mikroskop. Plasser 48-brønns mikroelektrodematriseplaten i opptaksinstrumentet. Sørg for at temperaturen er 37 grader celsius og karbondioksid er 5% Åpne navigatorprogramvaren.I det eksperimentelle oppsettvinduet velger du hjertekonfigurasjon i sanntid og feltpotensialopptak. Bruk spontane eller lim inn bankende konfigurasjoner. I beatdeteksjonsparametere setter du deteksjonsterskelen til 300 mikrovolt, minimum slagperiode til 250 millisekunder og maksimal slagperiode til fem sekunder.Velg polynomregresjon for beregning av potensiell varighet for feltpotensial. Kontroller om det elektriske aktivitetssignalet ved baseline er modent og stabilt, og skaff deg hjerteaktivitetene ved baseline i ett til tre minutter. Utfør opptaket 10 dager etter plating.Bytt ut det humane iPSC CM vedlikeholdsmediet med tyrodes løsning, og la cellene akklimatisere seg i 15 minutter. Sett temperatursensorene i kammeret, og sett 35 millimeter parabolen inni. Juster temperaturen til 37 grader celsius.Trekk mikropipettene fra borosilikatglasskapillærene ved hjelp av en mikropipetteavtrekker. Fyll mikropipettene med den intracellulære løsningen, og sett dem inn i holderen som er koblet til hodetrinnet til klemmeforsterkeren. Åpne anskaffelsesprogramvaren, last inn opptaksprotokollen for handlingspotensial, og velg spenningsklemmekonfigurasjonen.Sett mikropipetten inn i badeløsningen, og velg passende iPSC-CM-er for ett menneske. Juster og senk posisjonen til mikropipetten ved siden av den valgte cellen ved hjelp av en mikromanipulator. Når pipettespissen settes inn i badeløsningen, må du kontrollere pipettemotstanden på oscilloskopmonitoren.Plasser pipetten nær cellen, og strømpulsene vil avta litt for å gjenspeile den økende tetningsmotstanden. Påfør forsiktig sug med undertrykk for å øke motstanden. Dette vil danne en gigaseal.Påfør deretter tetningsfunksjonen. Påfør ekstra sug for å bryte membranen for å få en hel celleopptakskonfigurasjon. På dette tidspunktet bytter du fra spenningsklemmemodus til gjeldende klemmemodus, eller ingen strøminjeksjon ved hjelp av forsterkerdialogen.Trykk på opptaksknappen for å generere og lagre handlingspotensialopptaksfilene. Utfør kalsiumtransientmåling minst 10 dager etter plettering. Forbered fersk tyrodes løsning og Fura-2 AM lasteløsning.Aspirer det menneskelige iPSC CM vedlikeholdsmediet, og vask kamrene med tyrodes løsning to ganger. Påfør 100 mikroliter Fura-2 AM lasteløsning og inkuber i 10 minutter ved romtemperatur. Bytt ut Fura-2 AM-lasteløsningen med tyrodes løsning og rug i minst fem minutter for fullstendig deesterifisering av Fura-2 AM. Legg til en dråpe nedsenkningsolje på 40x oljenedsenkningsmålet for et omvendt epifluorescensmikroskop.Plasser cellekammeret i mikroskopets sceneadapter. Monter temperaturregulatorledningene til badekammeret, og sett det til 37 grader celsius. Installer de elektriske feltstimuleringselektrodene, og sett pulsene på 0,5 hertz med en varighet på 20 millisekunder.Slå på lyskilden med ultrahøy hastighets bølgelengde, og sett den til 340 nanometer og 380 nanometer hurtigbrytermodus. Bruk en eksponeringstid på 20 millisekunder for begge bølgelengder, og en opptakstid på 20 sekunder. Ta opp videoen som reflekterer sanntidsendringer av kalsiumtransient, eksporter dataene til et regneark for analyse.Human iPSC avledet kardiomyocytter monolag ble brukt for sammentrekning bevegelse måling. Analyse av et spor av sammentrekningsavslappingsbevegelsen ved hjelp av analysatorprogramvaren oppdaget sammentrekningene starter, sammentrekningstopp, sammentrekningsslutt, avslapningstopp og avslapningsslutt. Full dekning av det humane iPSC-avledede kardiomyocyttmonolaget ble observert på alle elektrodene i mikroelektrodematriseplatene.De modne bølgeformene registrert av hver elektrode reflekterte hjertefeltpotensialet med identifiserbare egenskaper. Etter analyse ble beatperiode, feltpotensialvarighet og spikeamplitude oppnådd. Opptak av hele cellepatchklemmer i gjeldende klemmemodus registrerte de spontane aksjonspotensialene til enkeltkardiomyocytter.Etter analyse ble det oppnådd flere parametere, inkludert amplitude, maks diastolisk potensial og virkningspotensialvarighet. Etter analyse av kalsiumavbildning ble F340 ved F380-forhold over tid oppnådd, og rå spor av stimulerte kalsiumtransienter ble plottet. I tillegg ble parametere som amplitude, diastolisk kalsium og kalsiumforfall tau oppnådd.Det er viktig å bruke de humane iPSC-avledede kardiomyocytter som har gode slagforhold, samt å sikre høy renhet av de humane iPSC-avledede kardiomyocytter. Denne protokollen inneholder fire spesifikke teknikker for å studere human iPSC-avledet kardiomyocyttfunksjonalitet, annen konfigurasjon eller automatisk om man skal studere hjerteioniske strømmer som spiller en avgjørende rolle i hjertet.

Research

JoVE Journal

Medicine

Formation of Human Prostate Epithelium Using Tissue Recombination of Rodent Urogenital Sinus Mesenchyme and Human Stem Cells

Dannelse av human prostata Epitel hjelp Tissue rekombinasjon av gnager Urogenitale Sinus mesenchyme og menneskelige stamceller

Progress in prostate cancer research is severely  limited by the availability of human-derived and hormone-na&iuml;ve model systems,  which limit our ...

Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

Isolasjon og Funksjonell karakterisering av menneskelig Ventrikulær Cardiomyocytes fra Fresh Kirurgiske Samples

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...

Tissue-simulating Phantoms for Assessing Potential Near-infrared Fluorescence Imaging Applications in Breast Cancer Surgery

Tissue-simulere Phantoms for Assessing Potensielle nær-infrarødt fluorescens bildebehandlingsprogrammer i Breast Cancer Surgery

Inaccuracies in intraoperative tumor localization and evaluation of surgical margin status result in suboptimal outcome of breast-conserving surgery ...

Multi-electrode Array Recordings of Human Epileptic Postoperative Cortical Tissue

Multi-elektrode Array Recordings of Human Epileptiske Postoperativ Kortikal Tissue

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Muscular Dystrophy Patients: Efficient Integration-free Reprogramming of Urine Derived Cells

Generasjon av Induced Pluripotent Stamceller fra muskeldystrofi Pasienter: Effektiv integrasjon fritt Omprogrammering av urin Avledet Cells

Dystrophic cardiomyopathy is a poorly understood consequence of muscular dystrophy. Generating induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) from patients with ...

Rapid and Efficient Generation of Recombinant Human Pluripotent Stem Cells by Recombinase-mediated Cassette Exchange in the AAVS1 Locus

Rapid and Efficient Generation of Recombinant Human Pluripotent Stem Cells by Recombinase-mediated Cassette Exchange in the AAVS1 Locus

Rask og effektiv produksjon av rekombinant humant Pluripotent stamceller ved rekombinase-mediert Cassette Exchange i den<em&gt; AAVS1</em&gt; Locus

Even with the revolution of gene-targeting technologies led by CRISPR-Cas9, genetic modification of human pluripotent stem cells&#160;(hPSCs)&#160;is ...

Targeted and Selective Treatment of Pluripotent Stem Cell-derived Teratomas Using External Beam Radiation in a Small-animal Model

Målrettet og selektiv behandling av Pluripotent Stamcelle-avledet Teratomas bruke ekstern stråle stråling i en liten-dyr modell

The growing number of victims of &#34;stem cell tourism,&#34; the unregulated transplantation of stem cells worldwide, has raised concerns about the ...

Sarcomere Shortening of Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes using Fluorescent-Tagged Sarcomere Proteins.

Sarcomere Forkortelse av Pluripotente stamcelleavledede kardiomyocytter ved hjelp av fluorescerende taggede sarcomere-proteiner.

Pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (PSC-CMs) can be produced from both embryonic and induced pluripotent stem (ES/iPS) cells. These cells ...

Directed Induction of Retinal Organoids from Human Pluripotent Stem Cells

Rettet induksjon av retinale organoider fra humane pluripotente stamceller

Retinal cell transplantation is a promising therapeutic approach, which could restore the retinal architecture and stabilize or even improve the visual ...

Microelectrode Array Recording of Sinoatrial Node Firing Rate to Identify Intrinsic Cardiac Pacemaking Defects in Mice

Microelectrode Array Recording av sinoatrial node avfyringshastighet for å identifisere iboende hjerte pacemaking defekter hos mus

The sinoatrial node (SAN), located in the right atrium, contains the pacemaker cells of the heart, and dysfunction of this region can cause tachycardia or ...