Name: technical applications of microelectrode array and patch clamp recordings on human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes
Uploaded: 2022-08-04T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Technical Applications of Microelectrode Array and Patch Clamp Recordings on Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes at JoVE.com

Agradecemos a Blake Wu pela revisão do manuscrito. Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) R01 HL113006, R01 HL141371, R01 HL163680, R01 HL141851, U01FD005978 e NASA NNX16A069A (JCW), e AHA Postdoctoral Fellowship 872244 (GMP).

1. Preparação de meios e soluções
<ol><li>Prepare o meio de manutenção hiPSC-CM misturando um frasco de 10 mL de suplemento de 50x B27 e 500 mL de meio RPMI 1640. Conservar o meio a 4 °C e utilizá-lo no prazo de um mês. Equilibre a temperatura média a temperatura ambiente (RT) antes de usar.</li>
	<li>Preparar o meio de semeadura hiPSC-CM misturando 20 mL de reposição sérica e 180 mL de meio de manutenção hiPSC-CM (diluição a 10%, v/v). Embora o meio de semeadura recém-preparado seja ...

<ol>
	<li>Wouters, O. J., McKee, M., Luyten, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimated+research+and+development+investment+needed+to+bring+a+new+medicine+to+market,+2009-2018.">Estimated research and development investment needed to bring a new medicine to market, 2009-2018.</a> Journal of the American Medical Association. 323 (9), 844-853 (2020).</li><li>Pang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Workshop+report:+FDA+workshop+on+improving+cardiotoxicity+assessment+with+human-relevant+platforms.">Workshop report: FDA workshop on improving cardiotoxicity assessment with human-relevant platforms.</a> Circulation Research. 125 (9), 855-867 (2019).</li><li>Mamoshina, P., Rodriguez, B., Bueno-Orovio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+broader+view+of+mechanisms+of+drug+cardiotoxicity.">Toward a broader view of mechanisms of drug cardiotoxicity.</a> Cell Reports Medicine. 2 (3), 100216 (2021).</li><li>Paik, D. T., Chandy, M., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient+and+disease-specific+induced+pluripotent+stem+cells+for+discovery+of+personalized+cardiovascular+drugs+and+therapeutics.">Patient and disease-specific induced pluripotent stem cells for discovery of personalized cardiovascular drugs and therapeutics.</a> Pharmacological Reviews. 72 (1), 320-342 (2020).</li><li>Kaese, S., Verheule, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+electrophysiology+in+mice:+a+matter+of+size.">Cardiac electrophysiology in mice: a matter of size.</a> Frontiers in Physiology. 3, 345 (2012).</li><li>Clark, W. A., Chizzonite, R. A., Everett, A. W., Rabinowitz, M., Zak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species+correlations+between+cardiac+isomyosins.+A+comparison+of+electrophoretic+and+immunological+properties.">Species correlations between cardiac isomyosins. A comparison of electrophoretic and immunological properties.</a> Journal of Biological Chemistry. 257 (10), 5449-5454 (1982).</li><li>Werfel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+circular+RNAs+in+human,+mouse,+and+rat+hearts.">Characterization of circular RNAs in human, mouse, and rat hearts.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 98, 103-107 (2016).</li><li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+generation+of+human+cardiomyocytes.">Chemically defined generation of human cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li><li>Sharma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+highly+purified+cardiomyocytes+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+using+small+molecule-modulated+differentiation+and+subsequent+glucose+starvation.">Derivation of highly purified cardiomyocytes from human induced pluripotent stem cells using small molecule-modulated differentiation and subsequent glucose starvation.</a> Journal of Visualized Experiments. (97), e52628 (2015).</li><li>Itzhaki, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+the+long+QT+syndrome+with+induced+pluripotent+stem+cells.">Modelling the long QT syndrome with induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 471 (7337), 225-229 (2011).</li><li>Lan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+calcium+handling+properties+underlie+familial+hypertrophic+cardiomyopathy+pathology+in+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells.">Abnormal calcium handling properties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in patient-specific induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 101-113 (2013).</li><li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+diastolic+dysfunction+in+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+from+hypertrophic+cardiomyopathy+patients.">Modelling diastolic dysfunction in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes from hypertrophic cardiomyopathy patients.</a> European Heart Journal. 40 (45), 3685-3695 (2019).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+PDGF+pathway+links+LMNA+mutation+to+dilated+cardiomyopathy.">Activation of PDGF pathway links LMNA mutation to dilated cardiomyopathy.</a> Nature. 572 (7769), 335-340 (2019).</li><li>Sun, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells+as+a+model+for+familial+dilated+cardiomyopathy.">Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy.</a> Science Translational Medicine. 4 (130), (2012).</li><li>Chen, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+PDGFRA+signaling+contributes+to+filamin+C-related+arrhythmogenic+cardiomyopathy.">Activation of PDGFRA signaling contributes to filamin C-related arrhythmogenic cardiomyopathy.</a> Science Advances. 8 (8), (2022).</li><li>Sharma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+of+tyrosine+kinase+inhibitor+cardiotoxicity+with+human+induced+pluripotent+stem+cells.">High-throughput screening of tyrosine kinase inhibitor cardiotoxicity with human induced pluripotent stem cells.</a> Science Translational Medicine. 9 (377), (2017).</li><li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+recapitulate+the+predilection+of+breast+cancer+patients+to+doxorubicin-induced+cardiotoxicity.">Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes recapitulate the predilection of breast cancer patients to doxorubicin-induced cardiotoxicity.</a> Nature Medicine. 22 (5), 547-556 (2016).</li><li>Kitani, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human-induced+pluripotent+stem+cell+model+of+trastuzumab-induced+cardiac+dysfunction+in+patients+with+breast+cancer.">Human-induced pluripotent stem cell model of trastuzumab-induced cardiac dysfunction in patients with breast cancer.</a> Circulation. 139 (21), 2451-2465 (2019).</li><li>Matsa, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+profiling+of+patient-specific+human+iPSC-cardiomyocytes+predicts+individual+drug+safety+and+efficacy+responses+in+vitro.">Transcriptome profiling of patient-specific human iPSC-cardiomyocytes predicts individual drug safety and efficacy responses in vitro.</a> Cell Stem Cell. 19 (3), 311-325 (2016).</li><li>Stillitano, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+susceptibility+to+drug-induced+long+QT+with+a+panel+of+subject-specific+induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling susceptibility to drug-induced long QT with a panel of subject-specific induced pluripotent stem cells.</a> Elife. 6, (2017).</li><li>Zhang, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+to+measure+contraction,+calcium,+and+action+potential+in+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Protocol to measure contraction, calcium, and action potential in human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> STAR Protocols. 2 (4), 100859 (2021).</li><li>Blinova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+multisite+study+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+drug+proarrhythmic+potential+assessment.">International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment.</a> Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).</li><li>Greensmith, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca+analysis:+an+Excel+based+program+for+the+analysis+of+intracellular+calcium+transients+including+multiple,+simultaneous+regression+analysis.">Ca analysis: an Excel based program for the analysis of intracellular calcium transients including multiple, simultaneous regression analysis.</a> Computer Methods and Programs in Biomedicine. 113 (1), 241-250 (2014).</li><li>Ma, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+pathogenicity+of+a+genomic+variant+of+uncertain+significance+using+CRISPR/Cas9+and+human-induced+pluripotent+stem+cells.">Determining the pathogenicity of a genomic variant of uncertain significance using CRISPR/Cas9 and human-induced pluripotent stem cells.</a> Circulation. 138 (23), 2666-2681 (2018).</li><li>Lam, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+the+transcriptome+signatures+of+calcium+channel+blockers+in+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Identifying the transcriptome signatures of calcium channel blockers in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Circulation Research. 125 (2), 212-222 (2019).</li><li>Seeger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+premature+termination+codon+mutation+in+MYBPC3+causes+hypertrophic+cardiomyopathy+via+chronic+activation+of+nonsense-mediated+decay.">A premature termination codon mutation in MYBPC3 causes hypertrophic cardiomyopathy via chronic activation of nonsense-mediated decay.</a> Circulation. 139 (6), 799-811 (2019).</li><li>Zhang, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cryopreservation+on+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+assessing+drug+safety+response+profiles.">Effects of cryopreservation on human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for assessing drug safety response profiles.</a> Stem Cell Reports. 16 (1), 168-181 (2021).</li><li>Yu, B., Zhao, S. R., Yan, C. D., Zhang, M., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconvoluting+the+cells+of+the+human+heart+with+iPSC+technology:+cell+types,+protocols,+and+uses.">Deconvoluting the cells of the human heart with iPSC technology: cell types, protocols, and uses.</a> Current Cardiology Reports. 24 (5), 487-496 (2022).</li><li>Thomas, D., Cunningham, N. J., Shenoy, S., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human-induced+pluripotent+stem+cells+in+cardiovascular+research:+current+approaches+in+cardiac+differentiation,+maturation+strategies,+and+scalable+production.">Human-induced pluripotent stem cells in cardiovascular research: current approaches in cardiac differentiation, maturation strategies, and scalable production.</a> Cardiovascular Research. 118 (1), 20-36 (2022).</li><li>Zhu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+developmental+cues+for+the+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Physical developmental cues for the maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 5 (5), 117 (2014).</li><li>Feyen, D. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+maturation+media+improve+physiological+function+of+human+iPSC-derived+cardiomyocytes.">Metabolic maturation media improve physiological function of human iPSC-derived cardiomyocytes.</a> Cell Reports. 32 (3), 107925 (2020).</li><li>Gintant, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+in+preclinical+cancer+drug+cardiotoxicity+testing:+a+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association.">Use of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in preclinical cancer drug cardiotoxicity testing: a scientific statement from the American Heart Association.</a> Circulation Research. 125 (10), 75-92 (2019).</li><li>Kussauer, S., David, R., Lemcke, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hiPSCs+Derived+cardiac+cells+for+drug+and+toxicity+screening+and+disease+modeling:+what+micro-+electrode-array+analyses+can+tell+us.">hiPSCs Derived cardiac cells for drug and toxicity screening and disease modeling: what micro- electrode-array analyses can tell us.</a> Cells. 8 (11), (2019).</li><li>Ng, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+phenotyping+of+heteromeric+human+ether-a-go-go-related+gene+potassium+channel+variants+can+discriminate+pathogenic+from+rare+benign+variants.">High-throughput phenotyping of heteromeric human ether-a-go-go-related gene potassium channel variants can discriminate pathogenic from rare benign variants.</a> Heart Rhythm. 17 (3), 492-500 (2020).</li><li>Obergrussberger, A., Friis, S., Bruggemann, A., Fertig, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+patch+clamp+in+drug+discovery:+major+breakthroughs+and+innovation+in+the+last+decade.">Automated patch clamp in drug discovery: major breakthroughs and innovation in the last decade.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 16 (1), 1-5 (2021).</li><li>Kozek, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+discovery+of+trafficking-deficient+variants+in+the+cardiac+potassium+channel+KV11.1.">High-throughput discovery of trafficking-deficient variants in the cardiac potassium channel KV11.1.</a> Heart Rhythm. 17 (12), 2180-2189 (2020).</li><li>Heyne, H. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+functional+effects+of+missense+variants+in+voltage-gated+sodium+and+calcium+channels.">Predicting functional effects of missense variants in voltage-gated sodium and calcium channels.</a> Science Translational Medicine. 12 (556), (2020).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+automated+patch-clamp+platform+for+electrophysiological+and+pharmacological+evaluation+of+hiPSC-CMs.">Establishment of an automated patch-clamp platform for electrophysiological and pharmacological evaluation of hiPSC-CMs.</a> Stem Cell Research. 41, 101662 (2019).</li><li>Li, W., Luo, X., Ulbricht, Y., Guan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blebbistatin+protects+iPSC-CMs+from+hypercontraction+and+facilitates+automated+patch-clamp+based+electrophysiological+study.">Blebbistatin protects iPSC-CMs from hypercontraction and facilitates automated patch-clamp based electrophysiological study.</a> Stem Cell Research. 56, 102565 (2021).</li><li>Milligan, C. J., M&#246;ller, C., Gamper, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Ion Channels: Methods and Protocols. , 171-187 (2013).</li></ol>

A tecnologia iPSC humana emergiu como uma plataforma poderosa para modelagem de doenças e triagem de medicamentos. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para medir a contratilidade do hiPSC-CM, o potencial de campo, o potencial de ação e o transiente Ca2+. Este protocolo fornece uma caracterização abrangente da contratilidade e eletrofisiologia do hiPSC-CM. Esses ensaios funcionais têm sido aplicados em múltiplas publicações do nosso grupo 12,13,18,24,25,26,27.<su...

O desenvolvimento de medicamentos é um processo longo e caro. Um estudo de novos medicamentos terapêuticos aprovados pela Food and Drug Administration (FDA) dos EUA entre 2009 e 2018 relatou que o custo médio estimado de pesquisas capitalizadas e ensaios clínicos foi de US $ 985 milhões por produto1. A cardiotoxicidade induzida por drogas é a principal causa de atrito e retirada de drogas do mercado2. Notavelmente, a cardiotoxicidade é relatada entre as múltiplas classes de drogas terapêuticas3. Portanto, a avaliação da segurança cardíaca é um componente crucial durante o processo de desenvolvimento de medicamentos. O paradigma atual para a avaliação da segurança cardíaca ainda é altamente dependente de modelos animais. No entanto, as diferenças de espécies em relação ao uso de modelos animais são cada vez mais reconhecidas como a principal causa de previsões imprecisas para a cardiotoxicidade induzida por drogas em pacientes humanos4. Por exemplo, a morfologia do potencial de ação cardíaca difere substancialmente entre humanos e camundongos devido às contribuições de diferentes correntes de repolarização5. Além disso, isoformas diferenciais de miosina cardíaca e RNAs circulares que podem afetar a fisiologia cardíaca têm sido bem documentadas entre as espécies 6,7. Para preencher essas lacunas, é imperativo estabelecer um modelo confiável, eficiente e baseado em humanos para a avaliação pré-clínica da segurança cardíaca.
A invenção inovadora da tecnologia de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) gerou plataformas sem precedentes de triagem de medicamentos e modelagem de doenças. Na última década, métodos para gerar cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos (hiPSC-CMs) tornaram-se bem estabelecidos 8,9. Os CM-hiPSC têm atraído grande interesse em suas potenciais aplicações na modelagem de doenças, triagem de cardiotoxicidade induzida por drogas e medicina de precisão. Por exemplo, os CM-hiPSC têm sido utilizados para modelar os fenótipos patológicos de doenças cardíacas causadas por herança genética, como a síndrome do QT longo10, a cardiomiopatia hipertrófica 11,12 e a cardiomiopatia dilatada13,14,15. Consequentemente, foram identificadas as principais vias de sinalização implicadas na patogênese das doenças cardíacas, o que pode lançar luz sobre possíveis estratégias terapêuticas para um tratamento eficaz. Além disso, os CM-hiPSC têm sido utilizados para rastrear a cardiotoxicidade induzida por drogas associada a agentes anticancerígenos, incluindo doxorrubicina, trastuzumabe e inibidores da tirosina quinase16,17,18; estratégias para mitigar a cardiotoxicidade resultante estão sob investigação. Por fim, a informação genética retida nas CME-hiPSC permite a triagem e a predição da cardiotoxicidade induzida por fármacos tanto em nível individual quanto populacional19,20. Coletivamente, os hiPSC-CMs provaram ser uma ferramenta inestimável para a previsão personalizada da segurança cardíaca.
O objetivo geral deste protocolo é estabelecer metodologias para investigar de forma abrangente e eficiente as características funcionais dos CM-hiPSC, que são de grande importância na aplicação de CMhiPSC para modelagem de doenças, triagem de cardiotoxicidade induzida por drogas e medicina de precisão. Aqui, detalhamos uma série de ensaios funcionais para avaliar as propriedades funcionais dos CM-hiPSC, incluindo a medição da contratilidade, potencial de campo, potencial de ação e manuseio de cálcio (Ca2+) (Figura 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35 mm glass bottom dish with 20 mm micro-well #1.5 cover glass</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>D35-20-1.5-N</td>
			<td>Patch clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50x B27 supplements</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>hiPSC-CM culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well culture plate</td>
			<td>E &#38; K Scientific</td>
			<td>EK-27160</td>
			<td>hiPSC-CM culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well flat clear bottom black polystyrene TC-treated microplates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3603</td>
			<td>Contraction motion measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6964</td>
			<td>Enzymatic dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axion&#39;s Integrated Studio (AxIS)</td>
			<td>Axion Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>navigator software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>BF 100-50-10,</td>
			<td>Patch clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 1 M in H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>21115</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting chamber slides</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
			<td>Cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoView 48-well MEA plates</td>
			<td>Axion Biosystems</td>
			<td>M768-tMEA-48B</td>
			<td>MEA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco/Life Technologies</td>
			<td>12634028</td>
			<td>Extracellular matrix medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-190-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td>Intracellular pipette solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPC 10 USB&#160;patch clamp amplifier</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>89-5000</td>
			<td>Patch clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2, AM, cell permeant</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>F1221</td>
			<td>Ca2+ transient measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hiPSCs</td>
			<td>Stanford Cardiovascular Institute iPSC Biobank</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>529552</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10828-028</td>
			<td>hiPSC-CM seeding medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH 8&#160;M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4494</td>
			<td>Intracellular pipette solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda DG 4</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td></td>
			<td>Ca2+ transient measurement; ultra-high-speed wavelength switching light source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna-FL automated fluorescence cell counter</td>
			<td>WISBIOMED</td>
			<td>LB-L20001</td>
			<td>Cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maestro Pro&#160;MEA system</td>
			<td>Axion Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>MEA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>Extracellular matrix medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9187</td>
			<td>Intracellular pipette solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH 10&#160;M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>72068</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements AR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127 (20% Solution in DMSO)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P3000MP</td>
			<td>Ca2+ transient measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11875-119</td>
			<td>hiPSC-CM culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sony SI8000 Cell Motion Imaging System</td>
			<td>Sony Biotechnology</td>
			<td></td>
			<td>Contraction motion measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutter Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-97</td>
			<td>Patch clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue stain</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>T10282</td>
			<td>Cell counting</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

technical applications of microelectrode array and patch clamp recordings on human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes

A cardiotoxicidade induzida por drogas é a principal causa de atrito de drogas e retirada do mercado. Portanto, o uso de modelos adequados de avaliação de segurança cardíaca pré-clínica é uma etapa crítica durante o desenvolvimento do medicamento. Atualmente, a avaliação da segurança cardíaca ainda é altamente dependente de estudos em animais. No entanto, os modelos animais são atormentados pela baixa especificidade translacional para os seres humanos devido a diferenças específicas da espécie, particularmente em termos de características eletrofisiológicas cardíacas. Assim, há uma necessidade urgente de desenvolver um modelo confiável, eficiente e baseado em humanos para a avaliação pré-clínica da segurança cardíaca. Os cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos (hiPSC-CMs) emergiram como um modelo in vitro inestimável para triagem de cardiotoxicidade induzida por drogas e modelagem de doenças. Os CMCs hiPSC podem ser obtidos de indivíduos com diversas origens genéticas e várias condições doentes, tornando-os um substituto ideal para avaliar a cardiotoxicidade induzida por drogas individualmente. Portanto, metodologias para investigar de forma abrangente as características funcionais dos CME-hiPSC precisam ser estabelecidas. Neste protocolo, detalhamos vários ensaios funcionais que podem ser avaliados em CM-hiPSC, incluindo a medição da contratilidade, potencial de campo, potencial de ação e manuseio de cálcio. No geral, a incorporação de hiPSC-CMs na avaliação pré-clínica da segurança cardíaca tem o potencial de revolucionar o desenvolvimento de medicamentos.

Este protocolo descreve como medir o movimento de contração, o potencial de campo, o potencial de ação e o transiente Ca2+ de CM-hiPSC. Um diagrama esquemático incluindo a digestão enzimática, a semeadura celular, a manutenção e a condução do ensaio funcional é mostrado na Figura 1. A formação da monocamada hiPSC-CM é necessária para a medição do movimento de contração (Figura 2B). Um traço representativo do movimento de contraç?...

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Technical Applications of Microelectrode Array and Patch Clamp Recordings on Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Os cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos (hiPSC-CMs) emergiram como um modelo in vitro promissor para triagem de cardiotoxicidade induzida por drogas e modelagem de doenças. Aqui, detalhamos um protocolo para medir a contratilidade e eletrofisiologia dos CM-hiPSC.

Aplicações Técnicas de Gravação de Matriz de Microeletrodos e Braçadeiras de Adesivos em Cardiomiócitos Derivados de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas por Humanos

Drug-induced cardiotoxicity is the leading cause of drug attrition and withdrawal from the market. Therefore, using appropriate preclinical cardiac safety ...

A avaliação da segurança cardíaca é um componente crucial durante o processo de desenvolvimento de medicamentos. Os cardiomiócitos derivados de iPSC humanos provaram ser um modelo confiável, eficiente e baseado em humanos para avaliação pré-clínica da segurança cardíaca. Estabelecemos metodologias para investigar de forma abrangente a característica funcional dos cardiomiócitos derivados de iPSC humanos, que são de modelagem de doenças realmente importantes, triagem de cardiotoxicidade induzida por drogas e medicina de precisão.A crescente incorporação de cardiomiócitos derivados de iPSC humanos no processo padrão de avaliações de segurança pré-clínicas tem o potencial de melhorar a precisão da previsão de toxicidade dos compostos de um candidato. Comece por cultivar os cardiomiócitos derivados de iPSC humanos por pelo menos 10 dias antes de fazer a medição. Ligue o controlador de temperatura e defina-o a 37 graus Celsius.Ligue o microscópio, a câmera e o suprimento de dióxido de carbono. Encha a camisa de água do suporte da placa com uma quantidade apropriada de água deionizada estéril. Coloque a placa de 96 poços no suporte da placa e incube as células por pelo menos cinco minutos.Abra o software de visualização e, em seguida, defina a taxa de fotogramas da câmara para 75 fotogramas por segundo e a resolução do vídeo ou da imagem para 1024 x 1024 píxeis. Aplique as funções de foco automático e brilho automático, grave vídeos e imagens de cardiomiócitos derivados de iPSC humanos. Coloque cuidadosamente uma gota de oito microlitros de solução de revestimento de matriz celular extra sobre a área do eletrodo de gravação de cada poço das placas de matriz de microeletrodos de 48 poços.Em seguida, adicione três mililitros de água desionizada estéril à área ao redor dos poços para evitar a evaporação da solução de revestimento. Usando uma ponta de pipeta de 200 microlitros, remova a maior parte do meio da matriz celular extra da superfície do poço dentro da mesma fileira ou coluna sem tocar nos eletrodos. Semee 50.000 células por poço em uma gota de oito microlitros de meio de semeadura sobre a área do eletrodo de gravação.Repita até que todos os poços tenham sido banhados com células. Em seguida, incube as placas de matriz de microeletrodos em uma incubadora de cultura de células umidificadas. Adicione lentamente 150 microlitros de meio de semeadura a cada poço das placas de matriz de microeletrodos.No dia 10 pós-plaqueamento, verifique a densidade de batimento espontâneo humano iPSC CM monocamada sob um microscópio. Coloque a placa de matriz de microeletrodos de 48 poços no instrumento de gravação. Certifique-se de que a temperatura é de 37 graus Celsius e dióxido de carbono é de 5%Abra o software do navegador.Na janela de configuração experimental, selecione a configuração cardíaca em tempo real e os registros de potencial de campo. Aplique configurações de batida espontâneas ou coladas. Nos parâmetros de detecção de batimento, defina o limite de detecção para 300 micro volts, o período mínimo de batimento para 250 milissegundos e o período máximo de batimento para cinco segundos.Selecione regressão polinomial para o cálculo da duração potencial do campo. Verifique se o sinal de atividade elétrica basal está maduro e estável e adquira as atividades cardíacas basais por um a três minutos. Realizar a gravação 10 dias pós-plaqueamento.Substitua o meio de manutenção iPSC CM humano pela solução de tyrode e permita que as células se aclimatem por 15 minutos. Insira os sensores de temperatura na câmara e coloque o prato de 35 milímetros dentro. Ajuste a temperatura para 37 graus Celsius.Puxe as micropipetas dos capilares de vidro borossilicato usando um puxador de micropipeta. Encha as micropipetas com a solução intracelular e insira-as no suporte ligado à fase principal do amplificador de braçadeira de patch. Abra o software de aquisição, carregue o protocolo de gravação do potencial de ação e selecione a configuração da braçadeira de tensão.Insira a micropipeta na solução de banho e selecione CMs iPSC humanos únicos apropriados. Ajuste e abaixe a posição da micropipeta ao lado da célula selecionada usando um micromanipulador. Quando a ponta da pipeta for inserida na solução de banho, verifique a resistência da pipeta no monitor do osciloscópio.Posicione a pipeta perto da célula e os pulsos de corrente diminuirão ligeiramente para refletir a crescente resistência à vedação. Aplique uma sucção suave com pressão negativa para aumentar a resistência. Isso formará um gigaseal.Em seguida, aplique a função de vedação. Aplique sucção adicional para quebrar a membrana para obter uma configuração de gravação de célula inteira. Neste ponto, mude do modo de pinça de tensão para o modo de braçadeira de corrente ou nenhuma injeção de corrente usando o diálogo do amplificador.Pressione o botão de gravação para gerar e salvar os arquivos de gravação em potencial de ação. Realizar a medição do transiente de cálcio pelo menos 10 dias após o plaqueamento. Prepare a solução de tiro fresco e a solução de carregamento Fura-2 AM.Aspirar o meio de manutenção iPSC CM humano e lavar as câmaras com a solução de tiro duas vezes. Aplicar 100 microlitros de solução de carregamento Fura-2 AM e incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente. Substitua a solução de carregamento de Fura-2 AM pela solução de tyrode e incube por pelo menos cinco minutos para desesterificação completa de Fura-2 AM. Adicione uma gota de óleo de imersão na objetiva de imersão em óleo 40x de um microscópio de epifluorescência invertida.Coloque a câmara celular no adaptador de estágio do microscópio. Instale os fios do controlador de temperatura na câmara de banho e configure-o para 37 graus Celsius. Instale os eletrodos de estimulação de campo elétrico e defina os pulsos em 0,5 hertz com uma duração de 20 milissegundos.Ligue a fonte de luz de comutação de comprimento de onda de ultra alta velocidade e defina-a para o modo de comutação rápida de 340 nanômetros e 380 nanômetros. Aplique um tempo de exposição de 20 milissegundos para ambos os comprimentos de onda e um tempo de gravação de 20 segundos. Grave o vídeo refletindo as mudanças em tempo real do transiente de cálcio, exporte os dados para uma planilha para análise.A monocamada de cardiomiócitos derivados de iPSC humano foi utilizada para a mensuração do movimento de contração. A análise de um traço do movimento de relaxamento da contração usando o software analisador detectou o início das contrações, o pico de contração, o fim da contração, o pico de relaxamento e o fim do relaxamento. A cobertura total da monocamada de cardiomiócitos derivados de iPSC humano foi observada em todos os eletrodos dentro das placas de matriz de microeletrodos.As formas de onda maduras registradas por cada eletrodo refletiram o potencial do campo cardíaco com características identificáveis. Após a análise, obtiveram-se o período de batimento, a duração do potencial de campo e a amplitude do pico. Registros de pinça de remendo de células inteiras no modo de pinçamento atual registraram os potenciais de ação espontânea de cardiomiócitos únicos.Após a análise, vários parâmetros, incluindo a amplitude, o potencial diastólico máximo e a duração do potencial de ação foram obtidos. Após a análise da imagem de cálcio, obteve-se a relação F340 por F380 ao longo do tempo e plotaram-se vestígios brutos de transientes de cálcio estimulados. Além disso, parâmetros como amplitude, cálcio diastólico e tau de decaimento de cálcio foram obtidos.É importante usar os cardiomiócitos derivados da iPSC humana que estão em boas condições de batimento, bem como garantir a alta pureza dos cardiomiócitos derivados da iPSC humana. Este protocolo inclui quatro técnicas específicas para estudar a funcionalidade dos cardiomiócitos derivados da iPSC humana, outra configuração ou o estudo automático das correntes iônicas cardíacas que desempenham um papel crucial no coração

Research

JoVE Journal

Medicine

Formation of Human Prostate Epithelium Using Tissue Recombination of Rodent Urogenital Sinus Mesenchyme and Human Stem Cells

Formação de Epithelium próstata humano utilizando Tissue Recombinação de Rodent Urogenital Mesênquima Sinus e células-tronco humanas

Progress in prostate cancer research is severely  limited by the availability of human-derived and hormone-na&iuml;ve model systems,  which limit our ...

Medicina

Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

Isolamento e caracterização funcional de Ventricular Humano cardiomiócitos a partir de amostras cirúrgicas frescos

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...

Tissue-simulating Phantoms for Assessing Potential Near-infrared Fluorescence Imaging Applications in Breast Cancer Surgery

Phantoms Tissue-simulação para avaliação de potenciais aplicações de fluorescência de imagem infravermelho próximo na cirurgia do câncer de mama

Inaccuracies in intraoperative tumor localization and evaluation of surgical margin status result in suboptimal outcome of breast-conserving surgery ...

Multi-electrode Array Recordings of Human Epileptic Postoperative Cortical Tissue

Multieletrodos Recordings Matriz de Human epiléptica pós-operatória Cortical Tissue

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Muscular Dystrophy Patients: Efficient Integration-free Reprogramming of Urine Derived Cells

Geração de pluripotentes induzidas células-tronco de distrofia muscular pacientes: Reprogramação livre de integração eficiente de urina células derivadas

Dystrophic cardiomyopathy is a poorly understood consequence of muscular dystrophy. Generating induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) from patients with ...

Rapid and Efficient Generation of Recombinant Human Pluripotent Stem Cells by Recombinase-mediated Cassette Exchange in the AAVS1 Locus

Rapid and Efficient Generation of Recombinant Human Pluripotent Stem Cells by Recombinase-mediated Cassette Exchange in the AAVS1 Locus

Geração rápida e eficiente de células-tronco pluripotentes Recombinante Humana pela recombinase mediada troca cassete no<em&gt; AAVS1</em&gt; Locus

Even with the revolution of gene-targeting technologies led by CRISPR-Cas9, genetic modification of human pluripotent stem cells&#160;(hPSCs)&#160;is ...

Targeted and Selective Treatment of Pluripotent Stem Cell-derived Teratomas Using External Beam Radiation in a Small-animal Model

Tratamento orientado e seletivo de Teratomas células-tronco derivadas de pluripotentes usando radiação de feixe externo em um modelo animal de pequeno

The growing number of victims of &#34;stem cell tourism,&#34; the unregulated transplantation of stem cells worldwide, has raised concerns about the ...

Sarcomere Shortening of Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes using Fluorescent-Tagged Sarcomere Proteins.

Encurtamento sarcomere de Cardiomiócitos Derivados de Células-Tronco Pluripotentes usando Proteínas Sarcomere marcadas por fluorescentes.

Pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (PSC-CMs) can be produced from both embryonic and induced pluripotent stem (ES/iPS) cells. These cells ...

Directed Induction of Retinal Organoids from Human Pluripotent Stem Cells

Indução Dirigida de Organoides da Retina a partir de Células-Tronco Pluripotentes Humanas

Retinal cell transplantation is a promising therapeutic approach, which could restore the retinal architecture and stabilize or even improve the visual ...

Microelectrode Array Recording of Sinoatrial Node Firing Rate to Identify Intrinsic Cardiac Pacemaking Defects in Mice

Microelectrode Array Gravação da Taxa de Disparo de Nó Sinoatrial para identificar defeitos intrínsecos de marcação cardíaca em camundongos

The sinoatrial node (SAN), located in the right atrium, contains the pacemaker cells of the heart, and dysfunction of this region can cause tachycardia or ...