Name: technical applications of microelectrode array and patch clamp recordings on human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes
Uploaded: 2022-08-04T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Technical Applications of Microelectrode Array and Patch Clamp Recordings on Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes at JoVE.com

Мы благодарим Блейка Ву за корректуру рукописи. Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения (NIH) R01 HL113006, R01 HL141371, R01 HL163680, R01 HL141851, U01FD005978 и NASA NNX16A069A (JCW), а также AHA Postdoctoral Fellowship 872244 (GMP).

1. Подготовка носителей и решений
<ol><li>Подготовьте поддерживающую среду hiPSC-CM, смешав бутылку объемом 10 мл добавки 50x B27 и 500 мл среды RPMI 1640. Храните среду при температуре 4 °C и используйте ее в течение месяца. Уравновешивайте среднюю температуру до комнатной температуры (RT) перед ...

<ol>
	<li>Wouters, O. J., McKee, M., Luyten, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimated+research+and+development+investment+needed+to+bring+a+new+medicine+to+market,+2009-2018.">Estimated research and development investment needed to bring a new medicine to market, 2009-2018.</a> Journal of the American Medical Association. 323 (9), 844-853 (2020).</li><li>Pang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Workshop+report:+FDA+workshop+on+improving+cardiotoxicity+assessment+with+human-relevant+platforms.">Workshop report: FDA workshop on improving cardiotoxicity assessment with human-relevant platforms.</a> Circulation Research. 125 (9), 855-867 (2019).</li><li>Mamoshina, P., Rodriguez, B., Bueno-Orovio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+broader+view+of+mechanisms+of+drug+cardiotoxicity.">Toward a broader view of mechanisms of drug cardiotoxicity.</a> Cell Reports Medicine. 2 (3), 100216 (2021).</li><li>Paik, D. T., Chandy, M., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient+and+disease-specific+induced+pluripotent+stem+cells+for+discovery+of+personalized+cardiovascular+drugs+and+therapeutics.">Patient and disease-specific induced pluripotent stem cells for discovery of personalized cardiovascular drugs and therapeutics.</a> Pharmacological Reviews. 72 (1), 320-342 (2020).</li><li>Kaese, S., Verheule, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+electrophysiology+in+mice:+a+matter+of+size.">Cardiac electrophysiology in mice: a matter of size.</a> Frontiers in Physiology. 3, 345 (2012).</li><li>Clark, W. A., Chizzonite, R. A., Everett, A. W., Rabinowitz, M., Zak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species+correlations+between+cardiac+isomyosins.+A+comparison+of+electrophoretic+and+immunological+properties.">Species correlations between cardiac isomyosins. A comparison of electrophoretic and immunological properties.</a> Journal of Biological Chemistry. 257 (10), 5449-5454 (1982).</li><li>Werfel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+circular+RNAs+in+human,+mouse,+and+rat+hearts.">Characterization of circular RNAs in human, mouse, and rat hearts.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 98, 103-107 (2016).</li><li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+generation+of+human+cardiomyocytes.">Chemically defined generation of human cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li><li>Sharma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+highly+purified+cardiomyocytes+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+using+small+molecule-modulated+differentiation+and+subsequent+glucose+starvation.">Derivation of highly purified cardiomyocytes from human induced pluripotent stem cells using small molecule-modulated differentiation and subsequent glucose starvation.</a> Journal of Visualized Experiments. (97), e52628 (2015).</li><li>Itzhaki, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+the+long+QT+syndrome+with+induced+pluripotent+stem+cells.">Modelling the long QT syndrome with induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 471 (7337), 225-229 (2011).</li><li>Lan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+calcium+handling+properties+underlie+familial+hypertrophic+cardiomyopathy+pathology+in+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells.">Abnormal calcium handling properties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in patient-specific induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 101-113 (2013).</li><li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+diastolic+dysfunction+in+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+from+hypertrophic+cardiomyopathy+patients.">Modelling diastolic dysfunction in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes from hypertrophic cardiomyopathy patients.</a> European Heart Journal. 40 (45), 3685-3695 (2019).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+PDGF+pathway+links+LMNA+mutation+to+dilated+cardiomyopathy.">Activation of PDGF pathway links LMNA mutation to dilated cardiomyopathy.</a> Nature. 572 (7769), 335-340 (2019).</li><li>Sun, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells+as+a+model+for+familial+dilated+cardiomyopathy.">Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy.</a> Science Translational Medicine. 4 (130), (2012).</li><li>Chen, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+PDGFRA+signaling+contributes+to+filamin+C-related+arrhythmogenic+cardiomyopathy.">Activation of PDGFRA signaling contributes to filamin C-related arrhythmogenic cardiomyopathy.</a> Science Advances. 8 (8), (2022).</li><li>Sharma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+of+tyrosine+kinase+inhibitor+cardiotoxicity+with+human+induced+pluripotent+stem+cells.">High-throughput screening of tyrosine kinase inhibitor cardiotoxicity with human induced pluripotent stem cells.</a> Science Translational Medicine. 9 (377), (2017).</li><li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+recapitulate+the+predilection+of+breast+cancer+patients+to+doxorubicin-induced+cardiotoxicity.">Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes recapitulate the predilection of breast cancer patients to doxorubicin-induced cardiotoxicity.</a> Nature Medicine. 22 (5), 547-556 (2016).</li><li>Kitani, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human-induced+pluripotent+stem+cell+model+of+trastuzumab-induced+cardiac+dysfunction+in+patients+with+breast+cancer.">Human-induced pluripotent stem cell model of trastuzumab-induced cardiac dysfunction in patients with breast cancer.</a> Circulation. 139 (21), 2451-2465 (2019).</li><li>Matsa, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+profiling+of+patient-specific+human+iPSC-cardiomyocytes+predicts+individual+drug+safety+and+efficacy+responses+in+vitro.">Transcriptome profiling of patient-specific human iPSC-cardiomyocytes predicts individual drug safety and efficacy responses in vitro.</a> Cell Stem Cell. 19 (3), 311-325 (2016).</li><li>Stillitano, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+susceptibility+to+drug-induced+long+QT+with+a+panel+of+subject-specific+induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling susceptibility to drug-induced long QT with a panel of subject-specific induced pluripotent stem cells.</a> Elife. 6, (2017).</li><li>Zhang, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+to+measure+contraction,+calcium,+and+action+potential+in+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Protocol to measure contraction, calcium, and action potential in human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> STAR Protocols. 2 (4), 100859 (2021).</li><li>Blinova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+multisite+study+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+drug+proarrhythmic+potential+assessment.">International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment.</a> Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).</li><li>Greensmith, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca+analysis:+an+Excel+based+program+for+the+analysis+of+intracellular+calcium+transients+including+multiple,+simultaneous+regression+analysis.">Ca analysis: an Excel based program for the analysis of intracellular calcium transients including multiple, simultaneous regression analysis.</a> Computer Methods and Programs in Biomedicine. 113 (1), 241-250 (2014).</li><li>Ma, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+pathogenicity+of+a+genomic+variant+of+uncertain+significance+using+CRISPR/Cas9+and+human-induced+pluripotent+stem+cells.">Determining the pathogenicity of a genomic variant of uncertain significance using CRISPR/Cas9 and human-induced pluripotent stem cells.</a> Circulation. 138 (23), 2666-2681 (2018).</li><li>Lam, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+the+transcriptome+signatures+of+calcium+channel+blockers+in+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Identifying the transcriptome signatures of calcium channel blockers in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Circulation Research. 125 (2), 212-222 (2019).</li><li>Seeger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+premature+termination+codon+mutation+in+MYBPC3+causes+hypertrophic+cardiomyopathy+via+chronic+activation+of+nonsense-mediated+decay.">A premature termination codon mutation in MYBPC3 causes hypertrophic cardiomyopathy via chronic activation of nonsense-mediated decay.</a> Circulation. 139 (6), 799-811 (2019).</li><li>Zhang, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cryopreservation+on+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+assessing+drug+safety+response+profiles.">Effects of cryopreservation on human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for assessing drug safety response profiles.</a> Stem Cell Reports. 16 (1), 168-181 (2021).</li><li>Yu, B., Zhao, S. R., Yan, C. D., Zhang, M., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconvoluting+the+cells+of+the+human+heart+with+iPSC+technology:+cell+types,+protocols,+and+uses.">Deconvoluting the cells of the human heart with iPSC technology: cell types, protocols, and uses.</a> Current Cardiology Reports. 24 (5), 487-496 (2022).</li><li>Thomas, D., Cunningham, N. J., Shenoy, S., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human-induced+pluripotent+stem+cells+in+cardiovascular+research:+current+approaches+in+cardiac+differentiation,+maturation+strategies,+and+scalable+production.">Human-induced pluripotent stem cells in cardiovascular research: current approaches in cardiac differentiation, maturation strategies, and scalable production.</a> Cardiovascular Research. 118 (1), 20-36 (2022).</li><li>Zhu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+developmental+cues+for+the+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Physical developmental cues for the maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 5 (5), 117 (2014).</li><li>Feyen, D. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+maturation+media+improve+physiological+function+of+human+iPSC-derived+cardiomyocytes.">Metabolic maturation media improve physiological function of human iPSC-derived cardiomyocytes.</a> Cell Reports. 32 (3), 107925 (2020).</li><li>Gintant, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+in+preclinical+cancer+drug+cardiotoxicity+testing:+a+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association.">Use of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in preclinical cancer drug cardiotoxicity testing: a scientific statement from the American Heart Association.</a> Circulation Research. 125 (10), 75-92 (2019).</li><li>Kussauer, S., David, R., Lemcke, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hiPSCs+Derived+cardiac+cells+for+drug+and+toxicity+screening+and+disease+modeling:+what+micro-+electrode-array+analyses+can+tell+us.">hiPSCs Derived cardiac cells for drug and toxicity screening and disease modeling: what micro- electrode-array analyses can tell us.</a> Cells. 8 (11), (2019).</li><li>Ng, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+phenotyping+of+heteromeric+human+ether-a-go-go-related+gene+potassium+channel+variants+can+discriminate+pathogenic+from+rare+benign+variants.">High-throughput phenotyping of heteromeric human ether-a-go-go-related gene potassium channel variants can discriminate pathogenic from rare benign variants.</a> Heart Rhythm. 17 (3), 492-500 (2020).</li><li>Obergrussberger, A., Friis, S., Bruggemann, A., Fertig, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+patch+clamp+in+drug+discovery:+major+breakthroughs+and+innovation+in+the+last+decade.">Automated patch clamp in drug discovery: major breakthroughs and innovation in the last decade.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 16 (1), 1-5 (2021).</li><li>Kozek, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+discovery+of+trafficking-deficient+variants+in+the+cardiac+potassium+channel+KV11.1.">High-throughput discovery of trafficking-deficient variants in the cardiac potassium channel KV11.1.</a> Heart Rhythm. 17 (12), 2180-2189 (2020).</li><li>Heyne, H. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+functional+effects+of+missense+variants+in+voltage-gated+sodium+and+calcium+channels.">Predicting functional effects of missense variants in voltage-gated sodium and calcium channels.</a> Science Translational Medicine. 12 (556), (2020).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+automated+patch-clamp+platform+for+electrophysiological+and+pharmacological+evaluation+of+hiPSC-CMs.">Establishment of an automated patch-clamp platform for electrophysiological and pharmacological evaluation of hiPSC-CMs.</a> Stem Cell Research. 41, 101662 (2019).</li><li>Li, W., Luo, X., Ulbricht, Y., Guan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blebbistatin+protects+iPSC-CMs+from+hypercontraction+and+facilitates+automated+patch-clamp+based+electrophysiological+study.">Blebbistatin protects iPSC-CMs from hypercontraction and facilitates automated patch-clamp based electrophysiological study.</a> Stem Cell Research. 56, 102565 (2021).</li><li>Milligan, C. J., M&#246;ller, C., Gamper, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Ion Channels: Methods and Protocols. , 171-187 (2013).</li></ol>

Технология iPSC человека стала мощной платформой для моделирования заболеваний и скрининга лекарств. Здесь мы описываем подробный протокол для измерения сократимости hiPSC-CM, потенциала поля, потенциала действия и переходного периода Ca2+. Этот протокол обеспечивает комплексную хара...

Разработка лекарств является длительным и дорогостоящим процессом. Исследование новых терапевтических препаратов, одобренных Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) в период с 2009 по 2018 год, показало, что средняя стоимость капитализированных исследований и клинических испытаний составила 985 миллионов долларов США за продукт1. Медикаментозная кардиотоксичность является основной причиной истощения и изъятия лекарств с рынка2. Примечательно, что кардиотоксичность сообщается среди нескольких классов терапевтических препаратов3. Поэтому оценка сердечной безопасности является важным компонентом в процессе разработки препарата. Нынешняя парадигма оценки сердечной безопасности по-прежнему сильно зависит от животных моделей. Тем не менее, видовые различия от использования животных моделей все чаще признаются в качестве основной причины неточных прогнозов лекарственно-индуцированной кардиотоксичности у пациентов с человеческими заболеваниями4. Например, морфология потенциала сердечного действия существенно различается между людьми и мышами из-за вклада различных реполяризующих токов5. Кроме того, дифференциальные изоформы сердечного миозина и круговых РНК, которые могут влиять на физиологию сердца, были хорошо задокументированы среди видов 6,7. Чтобы восполнить эти пробелы, необходимо создать надежную, эффективную и основанную на человеке модель доклинической оценки сердечной безопасности.
Новаторское изобретение технологии индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC) создало беспрецедентные платформы для скрининга лекарств и моделирования заболеваний. За последнее десятилетие методы получения индуцированных человеком плюрипотентных кардиомиоцитов, полученных из стволовых клеток (hiPSC-CMs), стали хорошо известными 8,9. hiPSC-CMs привлекли большой интерес к их потенциальному применению в моделировании заболеваний, скрининге кардиотоксичности, вызванном лекарственными средствами, и прецизионной медицине. Например, hiPSC-CM были использованы для моделирования патологических фенотипов сердечных заболеваний, вызванных генетическим наследованием, таких как синдром удлиненного интервала QT10, гипертрофическая кардиомиопатия 11,12 и дилатационная кардиомиопатия 13,14,15. Следовательно, были выявлены ключевые сигнальные пути, участвующие в патогенезе сердечных заболеваний, которые могут пролить свет на потенциальные терапевтические стратегии эффективного лечения. Кроме того, hiPSC-CMs использовались для скрининга лекарственно-индуцированной кардиотоксичности, связанной с противоопухолевыми агентами, включая доксорубицин, трастузумаб и ингибиторы тирозинкиназы 16,17,18; изучаются стратегии смягчения результирующей кардиотоксичности. Наконец, генетическая информация, хранящаяся в hiPSC-CM, позволяет проводить скрининг и прогнозировать медикаментозную кардиотоксичность как на индивидуальном, так и на популяционном уровнях19,20. В совокупности hiPSC-CM оказались бесценным инструментом для персонализированного прогнозирования сердечной безопасности.
Общей целью этого протокола является разработка методологий для всестороннего и эффективного исследования функциональных характеристик hiPSC-CMs, которые имеют большое значение для применения hiPSC-CM для моделирования заболеваний, скрининга кардиотоксичности, вызванного лекарственными средствами, и прецизионной медицины. Здесь мы подробно описываем массив функциональных анализов для оценки функциональных свойств hiPSC-CM, включая измерение сократимости, потенциала поля, потенциала действия и обработки кальция (Ca2+) (рисунок 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35 mm glass bottom dish with 20 mm micro-well #1.5 cover glass</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>D35-20-1.5-N</td>
			<td>Patch clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50x B27 supplements</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>hiPSC-CM culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well culture plate</td>
			<td>E &#38; K Scientific</td>
			<td>EK-27160</td>
			<td>hiPSC-CM culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well flat clear bottom black polystyrene TC-treated microplates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3603</td>
			<td>Contraction motion measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6964</td>
			<td>Enzymatic dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axion&#39;s Integrated Studio (AxIS)</td>
			<td>Axion Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>navigator software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>BF 100-50-10,</td>
			<td>Patch clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 1 M in H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>21115</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting chamber slides</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
			<td>Cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoView 48-well MEA plates</td>
			<td>Axion Biosystems</td>
			<td>M768-tMEA-48B</td>
			<td>MEA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco/Life Technologies</td>
			<td>12634028</td>
			<td>Extracellular matrix medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-190-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td>Intracellular pipette solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPC 10 USB&#160;patch clamp amplifier</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>89-5000</td>
			<td>Patch clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2, AM, cell permeant</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>F1221</td>
			<td>Ca2+ transient measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hiPSCs</td>
			<td>Stanford Cardiovascular Institute iPSC Biobank</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>529552</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10828-028</td>
			<td>hiPSC-CM seeding medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH 8&#160;M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4494</td>
			<td>Intracellular pipette solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda DG 4</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td></td>
			<td>Ca2+ transient measurement; ultra-high-speed wavelength switching light source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna-FL automated fluorescence cell counter</td>
			<td>WISBIOMED</td>
			<td>LB-L20001</td>
			<td>Cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maestro Pro&#160;MEA system</td>
			<td>Axion Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>MEA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>Extracellular matrix medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9187</td>
			<td>Intracellular pipette solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH 10&#160;M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>72068</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements AR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127 (20% Solution in DMSO)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P3000MP</td>
			<td>Ca2+ transient measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11875-119</td>
			<td>hiPSC-CM culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sony SI8000 Cell Motion Imaging System</td>
			<td>Sony Biotechnology</td>
			<td></td>
			<td>Contraction motion measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutter Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-97</td>
			<td>Patch clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue stain</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>T10282</td>
			<td>Cell counting</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

technical applications of microelectrode array and patch clamp recordings on human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes

Медикаментозная кардиотоксичность является основной причиной истощения и вывода лекарств с рынка. Поэтому использование соответствующих доклинических моделей оценки сердечной безопасности является критическим шагом при разработке лекарств. В настоящее время оценка сердечной безопасности по-прежнему сильно зависит от исследований на животных. Тем не менее, животные модели страдают от плохой трансляционной специфичности для людей из-за видовых различий, особенно с точки зрения электрофизиологических характеристик сердца. Таким образом, существует острая необходимость в разработке надежной, эффективной и основанной на человеке модели доклинической оценки сердечной безопасности. Индуцированные человеком плюрипотентные кардиомиоциты, полученные из стволовых клеток (hiPSC-CMs), стали бесценной моделью in vitro для скрининга кардиотоксичности, вызванной лекарственными средствами, и моделирования заболеваний. hiPSC-CMs могут быть получены от людей с различным генетическим фоном и различными заболеваниями, что делает их идеальным суррогатом для оценки лекарственно-индуцированной кардиотоксичности индивидуально. Поэтому необходимо разработать методологии всестороннего изучения функциональных характеристик hiPSC-CM. В этом протоколе мы подробно описываем различные функциональные анализы, которые могут быть оценены на hiPSC-CM, включая измерение сократимости, потенциала поля, потенциала действия и обработки кальция. В целом, включение hiPSC-CM в доклиническую оценку сердечной безопасности может революционизировать разработку лекарств.

Этот протокол описывает, как измерить движение сжатия, потенциал поля, потенциал действия и переходный процесс Ca2+ hiPSC-CM. Принципиальная схема, включающая ферментативное пищеварение, посев клеток, поддержание и проведение функционального анализа, показана на рисунке 1</...

Watch this Scientific Journal Video about Technical Applications of Microelectrode Array and Patch Clamp Recordings on Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes at JoVE.com

Technical Applications of Microelectrode Array and Patch Clamp Recordings on Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Индуцированные человеком плюрипотентные кардиомиоциты, полученные из стволовых клеток (hiPSC-CMs), стали многообещающей моделью in vitro для скрининга кардиотоксичности, вызванной лекарственными препаратами, и моделирования заболеваний. Здесь мы подробно описываем протокол измерения сократимости и электрофизиологии hiPSC-CM.

Технические применения микроэлектродных массивов и записей зажимов пластырей на кардиомиоцитах, полученных из человеческих плюрипотентных стволовых клеток

Drug-induced cardiotoxicity is the leading cause of drug attrition and withdrawal from the market. Therefore, using appropriate preclinical cardiac safety ...

Оценка сердечной безопасности является важным компонентом в процессе разработки препарата. Кардиомиоциты человека, полученные из iPSC, оказались надежной, эффективной и основанной на человеке моделью для доклинической оценки сердечной безопасности. Мы разработали методологии для всестороннего исследования функциональной характеристики кардиомиоцитов человека, полученных из iPSC, которые имеют действительно важное значение для моделирования заболеваний, скрининга сердечной токсичности, вызванной лекарственными средствами, и прецизионной медицины.Растущее включение кардиомиоцитов человека, полученных из iPSC, в стандартный процесс доклинических оценок безопасности может повысить точность прогнозирования токсичности соединений кандидата. Начните с культивирования кардиомиоцитов человека, полученных из iPSC, в течение не менее 10 дней, прежде чем проводить измерение. Включите регулятор температуры и установите его на 37 градусов по Цельсию.Включите микроскоп, камеру и подачу углекислого газа. Наполните водяную рубашку держателя пластины соответствующим количеством стерильной деионизированной воды. Поместите пластину с 96 лунками на держатель пластины и инкубируйте клетки в течение не менее пяти минут.Откройте программное обеспечение для просмотра, затем установите частоту кадров камеры на 75 кадров в секунду, а разрешение видео или изображения на 1024 x 1024 пикселя. Применяйте функции автофокусировки и автоматической яркости, записывайте видео и изображения кардиомиоцитов человека, полученных из iPSC. Осторожно поместите восьмимикролитровую каплю раствора экстра-клеточного матричного покрытия на площадь регистрирующего электрода каждой скважины 48-луночных микроэлектродных пластин.Затем добавьте три миллилитра стерильной деионизированной воды в область, окружающую колодцы, чтобы предотвратить испарение раствора покрытия. Используя наконечник пипетки объемом 200 микролитров, удалите большую часть дополнительной среды сотовой матрицы с поверхности скважины в пределах одного ряда или колонны, не касаясь электродов. Семена 50 000 клеток на лунку в восьмимикролитровой капле посевной среды над площадью регистрирующего электрода.Повторяйте до тех пор, пока все колодцы не будут покрыты ячейками. Затем инкубируют микроэлектродные пластины массива в увлажненном инкубаторе клеточной культуры. Медленно добавляйте 150 микролитров посевной среды в каждую лунку пластин микроэлектродного массива.На 10 день после нанесения покрытия проверьте плотность спонтанного биения монослоя iPSC CM человека под микроскопом. Поместите 48-луночную микроэлектродную пластину в записывающий прибор. Убедитесь, что температура составляет 37 градусов по Цельсию, а углекислый газ составляет 5% Откройте программное обеспечение навигатора.В окне экспериментальной настройки выберите конфигурацию сердца в реальном времени и записи потенциала поля. Применяйте спонтанные или вставленные конфигурации. В параметрах обнаружения биения установите порог обнаружения равным 300 микровольтам, минимальный период биения — 250 миллисекунд, а максимальный период биения — пять секунд.Выберите полиномиальную регрессию для вычисления длительности потенциала поля. Проверьте, является ли базовый сигнал электрической активности зрелым и стабильным, и получите базовую сердечную деятельность в течение одной-трех минут. Выполните запись через 10 дней после нанесения покрытия.Замените человеческую среду для поддержания iPSC CM раствором тирода и дайте клеткам акклиматизироваться в течение 15 минут. Вставьте датчики температуры в камеру и поместите внутрь 35-миллиметровую тарелку. Отрегулируйте температуру до 37 градусов по Цельсию.Вытащите микропипетки из боросиликатных стеклянных капилляров с помощью съемника микропипетки. Наполните микропипетки внутриклеточным раствором и вставьте их в держатель, соединенный с головной ступенью патч-зажимного усилителя. Откройте программное обеспечение для сбора данных, загрузите протокол записи потенциала действия и выберите конфигурацию зажима напряжения.Вставьте микропипетку в раствор ванны и выберите соответствующие одиночные человеческие iPSC CM. Отрегулируйте и опустите положение микропипетки рядом с выбранной ячейкой с помощью микроманипулятора. Когда наконечник пипетки вставлен в раствор ванны, проверьте сопротивление пипетки на мониторе осциллографа.Расположите пипетку близко к ячейке, и импульсы тока немного уменьшатся, чтобы отразить растущее сопротивление уплотнения. Примените мягкое всасывание с отрицательным давлением, чтобы увеличить сопротивление. Это будет образовывать гигасеал.Затем примените функцию уплотнения. Примените дополнительное всасывание, чтобы сломать мембрану, чтобы получить целую конфигурацию записи клетки. На этом этапе переключитесь из режима зажима напряжения в режим зажима тока или без впрыска тока с помощью диалога усилителя.Нажмите кнопку записи, чтобы создать и сохранить файлы записи потенциального действия. Выполняйте измерение преходящего кальция не менее чем через 10 дней после нанесения покрытия. Приготовьте свежий раствор тирода и загрузочный раствор Fura-2 AM.Аспирируйте человеческую поддерживающую среду iPSC CM и дважды промывайте камеры раствором тирода. Нанесите 100 микролитров загрузочного раствора Фура-2 АМ и инкубируйте в течение 10 минут при комнатной температуре. Замените загрузочный раствор Fura-2 AM раствором тирода и инкубируйте в течение не менее пяти минут для полной деэтеризации Fura-2 AM. Добавьте каплю погружного масла на 40-кратный масляный иммерсионный объектив перевернутого эпифлуоресцентного микроскопа.Поместите клеточную камеру в адаптер ступени микроскопа. Установите провода регулятора температуры в камеру ванны и установите ее на 37 градусов по Цельсию. Установите электроды для стимуляции электрического поля и установите импульсы на 0,5 герц с длительностью 20 миллисекунд.Включите сверхскоростной источник света переключения длин волн и установите его в режим быстрого переключения 340 нанометров и 380 нанометров. Примените время экспозиции 20 миллисекунд для обеих длин волн и время записи 20 секунд. Запишите видео, отражающее изменения переходного кальция в реальном времени, экспортируйте данные в электронную таблицу для анализа.Монослой кардиомиоцитов человека, полученный из iPSC, был использован для измерения движения сокращения. Анализ следа релаксационного движения сокращения с помощью анализатора программного обеспечения обнаружил начало сокращений, пик сокращения, конец сокращения, пик релаксации и конец релаксации. Полное покрытие монослоя кардиомиоцитов человека, полученного из iPSC, наблюдалось на всех электродах в пластинах микроэлектродного массива.Зрелые формы сигналов, записанные каждым электродом, отражали потенциал сердечного поля с идентифицируемыми характеристиками. После анализа были получены период биения, длительность потенциала поля и амплитуда шипа. Записи зажимов цельноклеточных пластырей в текущем режиме зажима регистрировали спонтанные потенциалы действия отдельных кардиомиоцитов.После анализа было получено несколько параметров, включая амплитуду, максимальный диастолический потенциал и продолжительность потенциала действия. После анализа кальциевой визуализации было получено соотношение F340 к F380 с течением времени, и были нанесены необработанные следы стимулированных переходных процессов кальция. Кроме того, были получены такие параметры, как амплитуда, диастолический кальций и тау распада кальция.Важно использовать кардиомиоциты человека, полученные из iPSC, которые находятся в хороших условиях биения, а также обеспечить высокую чистоту кардиомиоцитов человека, полученных из iPSC. Этот протокол включает в себя четыре конкретных метода для изучения функциональности кардиомиоцитов человека, полученного из iPSC, другой конфигурации или автоматического изучения сердечных ионных токов, которые играют решающую роль в сердечной деятельности.

Research

JoVE Journal

Medicine

Formation of Human Prostate Epithelium Using Tissue Recombination of Rodent Urogenital Sinus Mesenchyme and Human Stem Cells

Формирование человеческого эпителия простаты с использованием тканевых Рекомбинация грызунов мочеполовой Мезенхима Синус и стволовых клеток человека

Progress in prostate cancer research is severely  limited by the availability of human-derived and hormone-na&iuml;ve model systems,  which limit our ...

Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

Выделение и функциональная характеристика человека желудочка кардиомиоцитов из свежих хирургических образцов

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...

Tissue-simulating Phantoms for Assessing Potential Near-infrared Fluorescence Imaging Applications in Breast Cancer Surgery

Tissue-моделирования Фантомы для оценки потенциального ближней инфракрасной флуоресценции визуализации приложений в хирургии рака молочной железы

Inaccuracies in intraoperative tumor localization and evaluation of surgical margin status result in suboptimal outcome of breast-conserving surgery ...

Multi-electrode Array Recordings of Human Epileptic Postoperative Cortical Tissue

Многоэлектродной массива Записи человека эпилептические Послеоперационный корковой ткани

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Muscular Dystrophy Patients: Efficient Integration-free Reprogramming of Urine Derived Cells

Генерация индуцированные плюрипотентные стволовые клетки мышечной дистрофией пациентов: эффективная интеграция без перепрограммирования мочи клеток, полученных

Dystrophic cardiomyopathy is a poorly understood consequence of muscular dystrophy. Generating induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) from patients with ...

Rapid and Efficient Generation of Recombinant Human Pluripotent Stem Cells by Recombinase-mediated Cassette Exchange in the AAVS1 Locus

Rapid and Efficient Generation of Recombinant Human Pluripotent Stem Cells by Recombinase-mediated Cassette Exchange in the AAVS1 Locus

Быстрое и эффективное создание рекомбинантного человеческого плюрипотентных стволовых клеток с помощью рекомбинантному-опосредованной кассетные бирже в<em&gt; AAVS1</em&gt; Locus

Even with the revolution of gene-targeting technologies led by CRISPR-Cas9, genetic modification of human pluripotent stem cells&#160;(hPSCs)&#160;is ...

Targeted and Selective Treatment of Pluripotent Stem Cell-derived Teratomas Using External Beam Radiation in a Small-animal Model

Целенаправленный и избирательный лечение плюрипотентных стволовых клеток тератомы, используя внешний пучка излучения в модели малого животных

The growing number of victims of &#34;stem cell tourism,&#34; the unregulated transplantation of stem cells worldwide, has raised concerns about the ...

Sarcomere Shortening of Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes using Fluorescent-Tagged Sarcomere Proteins.

Саркомерное укорочение кардиомиоцитов, полученных из плюрипотентных стволовых клеток, с использованием флуоресцентно-помеченных саркомерных белков.

Pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (PSC-CMs) can be produced from both embryonic and induced pluripotent stem (ES/iPS) cells. These cells ...

Directed Induction of Retinal Organoids from Human Pluripotent Stem Cells

Направленная индукция органоидов сетчатки из плюрипотентных стволовых клеток человека

Retinal cell transplantation is a promising therapeutic approach, which could restore the retinal architecture and stabilize or even improve the visual ...

Microelectrode Array Recording of Sinoatrial Node Firing Rate to Identify Intrinsic Cardiac Pacemaking Defects in Mice

Микроэлектродная запись скорости срабатывания синоатриального узла для выявления внутренних дефектов кардиостимуляции у мышей

The sinoatrial node (SAN), located in the right atrium, contains the pacemaker cells of the heart, and dysfunction of this region can cause tachycardia or ...