Name: technical applications of microelectrode array and patch clamp recordings on human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes
Uploaded: 2022-08-04T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Technical Applications of Microelectrode Array and Patch Clamp Recordings on Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes at JoVE.com

Vi tackar Blake Wu för korrekturläsningen av manuskriptet. Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (NIH) R01 HL113006, R01 HL141371, R01 HL163680, R01 HL141851, U01FD005978 och NASA NNX16A069A (JCW) och AHA Postdoctoral Fellowship 872244 (GMP).

1. Beredning av media och lösningar
<ol><li>Förbered hiPSC-CM underhållsmedium genom att blanda en 10 ml flaska 50x B27-tillskott och 500 ml RPMI 1640-medium. Förvara mediet vid 4 °C och använd det inom en månad. Balansera mediet till rumstemperatur (RT) före användning.</li>
	<li>Förbered hiPSC-CM-såddmediet genom att blanda 20 ml serumersättning och 180 ml hiPSC-CM-underhållsmedium (10% utspädning, v / v). Medan nyberedt såddmedium föredras kan det förvaras vid 4 °C i högst 2 vecko...

<ol>
	<li>Wouters, O. J., McKee, M., Luyten, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimated+research+and+development+investment+needed+to+bring+a+new+medicine+to+market,+2009-2018.">Estimated research and development investment needed to bring a new medicine to market, 2009-2018.</a> Journal of the American Medical Association. 323 (9), 844-853 (2020).</li><li>Pang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Workshop+report:+FDA+workshop+on+improving+cardiotoxicity+assessment+with+human-relevant+platforms.">Workshop report: FDA workshop on improving cardiotoxicity assessment with human-relevant platforms.</a> Circulation Research. 125 (9), 855-867 (2019).</li><li>Mamoshina, P., Rodriguez, B., Bueno-Orovio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+broader+view+of+mechanisms+of+drug+cardiotoxicity.">Toward a broader view of mechanisms of drug cardiotoxicity.</a> Cell Reports Medicine. 2 (3), 100216 (2021).</li><li>Paik, D. T., Chandy, M., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient+and+disease-specific+induced+pluripotent+stem+cells+for+discovery+of+personalized+cardiovascular+drugs+and+therapeutics.">Patient and disease-specific induced pluripotent stem cells for discovery of personalized cardiovascular drugs and therapeutics.</a> Pharmacological Reviews. 72 (1), 320-342 (2020).</li><li>Kaese, S., Verheule, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+electrophysiology+in+mice:+a+matter+of+size.">Cardiac electrophysiology in mice: a matter of size.</a> Frontiers in Physiology. 3, 345 (2012).</li><li>Clark, W. A., Chizzonite, R. A., Everett, A. W., Rabinowitz, M., Zak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species+correlations+between+cardiac+isomyosins.+A+comparison+of+electrophoretic+and+immunological+properties.">Species correlations between cardiac isomyosins. A comparison of electrophoretic and immunological properties.</a> Journal of Biological Chemistry. 257 (10), 5449-5454 (1982).</li><li>Werfel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+circular+RNAs+in+human,+mouse,+and+rat+hearts.">Characterization of circular RNAs in human, mouse, and rat hearts.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 98, 103-107 (2016).</li><li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+generation+of+human+cardiomyocytes.">Chemically defined generation of human cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li><li>Sharma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+highly+purified+cardiomyocytes+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+using+small+molecule-modulated+differentiation+and+subsequent+glucose+starvation.">Derivation of highly purified cardiomyocytes from human induced pluripotent stem cells using small molecule-modulated differentiation and subsequent glucose starvation.</a> Journal of Visualized Experiments. (97), e52628 (2015).</li><li>Itzhaki, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+the+long+QT+syndrome+with+induced+pluripotent+stem+cells.">Modelling the long QT syndrome with induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 471 (7337), 225-229 (2011).</li><li>Lan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+calcium+handling+properties+underlie+familial+hypertrophic+cardiomyopathy+pathology+in+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells.">Abnormal calcium handling properties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in patient-specific induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 101-113 (2013).</li><li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+diastolic+dysfunction+in+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+from+hypertrophic+cardiomyopathy+patients.">Modelling diastolic dysfunction in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes from hypertrophic cardiomyopathy patients.</a> European Heart Journal. 40 (45), 3685-3695 (2019).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+PDGF+pathway+links+LMNA+mutation+to+dilated+cardiomyopathy.">Activation of PDGF pathway links LMNA mutation to dilated cardiomyopathy.</a> Nature. 572 (7769), 335-340 (2019).</li><li>Sun, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells+as+a+model+for+familial+dilated+cardiomyopathy.">Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy.</a> Science Translational Medicine. 4 (130), (2012).</li><li>Chen, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+PDGFRA+signaling+contributes+to+filamin+C-related+arrhythmogenic+cardiomyopathy.">Activation of PDGFRA signaling contributes to filamin C-related arrhythmogenic cardiomyopathy.</a> Science Advances. 8 (8), (2022).</li><li>Sharma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+of+tyrosine+kinase+inhibitor+cardiotoxicity+with+human+induced+pluripotent+stem+cells.">High-throughput screening of tyrosine kinase inhibitor cardiotoxicity with human induced pluripotent stem cells.</a> Science Translational Medicine. 9 (377), (2017).</li><li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+recapitulate+the+predilection+of+breast+cancer+patients+to+doxorubicin-induced+cardiotoxicity.">Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes recapitulate the predilection of breast cancer patients to doxorubicin-induced cardiotoxicity.</a> Nature Medicine. 22 (5), 547-556 (2016).</li><li>Kitani, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human-induced+pluripotent+stem+cell+model+of+trastuzumab-induced+cardiac+dysfunction+in+patients+with+breast+cancer.">Human-induced pluripotent stem cell model of trastuzumab-induced cardiac dysfunction in patients with breast cancer.</a> Circulation. 139 (21), 2451-2465 (2019).</li><li>Matsa, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+profiling+of+patient-specific+human+iPSC-cardiomyocytes+predicts+individual+drug+safety+and+efficacy+responses+in+vitro.">Transcriptome profiling of patient-specific human iPSC-cardiomyocytes predicts individual drug safety and efficacy responses in vitro.</a> Cell Stem Cell. 19 (3), 311-325 (2016).</li><li>Stillitano, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+susceptibility+to+drug-induced+long+QT+with+a+panel+of+subject-specific+induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling susceptibility to drug-induced long QT with a panel of subject-specific induced pluripotent stem cells.</a> Elife. 6, (2017).</li><li>Zhang, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+to+measure+contraction,+calcium,+and+action+potential+in+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Protocol to measure contraction, calcium, and action potential in human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> STAR Protocols. 2 (4), 100859 (2021).</li><li>Blinova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+multisite+study+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+drug+proarrhythmic+potential+assessment.">International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment.</a> Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).</li><li>Greensmith, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca+analysis:+an+Excel+based+program+for+the+analysis+of+intracellular+calcium+transients+including+multiple,+simultaneous+regression+analysis.">Ca analysis: an Excel based program for the analysis of intracellular calcium transients including multiple, simultaneous regression analysis.</a> Computer Methods and Programs in Biomedicine. 113 (1), 241-250 (2014).</li><li>Ma, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+pathogenicity+of+a+genomic+variant+of+uncertain+significance+using+CRISPR/Cas9+and+human-induced+pluripotent+stem+cells.">Determining the pathogenicity of a genomic variant of uncertain significance using CRISPR/Cas9 and human-induced pluripotent stem cells.</a> Circulation. 138 (23), 2666-2681 (2018).</li><li>Lam, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+the+transcriptome+signatures+of+calcium+channel+blockers+in+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Identifying the transcriptome signatures of calcium channel blockers in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Circulation Research. 125 (2), 212-222 (2019).</li><li>Seeger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+premature+termination+codon+mutation+in+MYBPC3+causes+hypertrophic+cardiomyopathy+via+chronic+activation+of+nonsense-mediated+decay.">A premature termination codon mutation in MYBPC3 causes hypertrophic cardiomyopathy via chronic activation of nonsense-mediated decay.</a> Circulation. 139 (6), 799-811 (2019).</li><li>Zhang, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cryopreservation+on+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+assessing+drug+safety+response+profiles.">Effects of cryopreservation on human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for assessing drug safety response profiles.</a> Stem Cell Reports. 16 (1), 168-181 (2021).</li><li>Yu, B., Zhao, S. R., Yan, C. D., Zhang, M., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconvoluting+the+cells+of+the+human+heart+with+iPSC+technology:+cell+types,+protocols,+and+uses.">Deconvoluting the cells of the human heart with iPSC technology: cell types, protocols, and uses.</a> Current Cardiology Reports. 24 (5), 487-496 (2022).</li><li>Thomas, D., Cunningham, N. J., Shenoy, S., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human-induced+pluripotent+stem+cells+in+cardiovascular+research:+current+approaches+in+cardiac+differentiation,+maturation+strategies,+and+scalable+production.">Human-induced pluripotent stem cells in cardiovascular research: current approaches in cardiac differentiation, maturation strategies, and scalable production.</a> Cardiovascular Research. 118 (1), 20-36 (2022).</li><li>Zhu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+developmental+cues+for+the+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Physical developmental cues for the maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 5 (5), 117 (2014).</li><li>Feyen, D. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+maturation+media+improve+physiological+function+of+human+iPSC-derived+cardiomyocytes.">Metabolic maturation media improve physiological function of human iPSC-derived cardiomyocytes.</a> Cell Reports. 32 (3), 107925 (2020).</li><li>Gintant, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+in+preclinical+cancer+drug+cardiotoxicity+testing:+a+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association.">Use of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in preclinical cancer drug cardiotoxicity testing: a scientific statement from the American Heart Association.</a> Circulation Research. 125 (10), 75-92 (2019).</li><li>Kussauer, S., David, R., Lemcke, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hiPSCs+Derived+cardiac+cells+for+drug+and+toxicity+screening+and+disease+modeling:+what+micro-+electrode-array+analyses+can+tell+us.">hiPSCs Derived cardiac cells for drug and toxicity screening and disease modeling: what micro- electrode-array analyses can tell us.</a> Cells. 8 (11), (2019).</li><li>Ng, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+phenotyping+of+heteromeric+human+ether-a-go-go-related+gene+potassium+channel+variants+can+discriminate+pathogenic+from+rare+benign+variants.">High-throughput phenotyping of heteromeric human ether-a-go-go-related gene potassium channel variants can discriminate pathogenic from rare benign variants.</a> Heart Rhythm. 17 (3), 492-500 (2020).</li><li>Obergrussberger, A., Friis, S., Bruggemann, A., Fertig, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+patch+clamp+in+drug+discovery:+major+breakthroughs+and+innovation+in+the+last+decade.">Automated patch clamp in drug discovery: major breakthroughs and innovation in the last decade.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 16 (1), 1-5 (2021).</li><li>Kozek, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+discovery+of+trafficking-deficient+variants+in+the+cardiac+potassium+channel+KV11.1.">High-throughput discovery of trafficking-deficient variants in the cardiac potassium channel KV11.1.</a> Heart Rhythm. 17 (12), 2180-2189 (2020).</li><li>Heyne, H. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+functional+effects+of+missense+variants+in+voltage-gated+sodium+and+calcium+channels.">Predicting functional effects of missense variants in voltage-gated sodium and calcium channels.</a> Science Translational Medicine. 12 (556), (2020).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+automated+patch-clamp+platform+for+electrophysiological+and+pharmacological+evaluation+of+hiPSC-CMs.">Establishment of an automated patch-clamp platform for electrophysiological and pharmacological evaluation of hiPSC-CMs.</a> Stem Cell Research. 41, 101662 (2019).</li><li>Li, W., Luo, X., Ulbricht, Y., Guan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blebbistatin+protects+iPSC-CMs+from+hypercontraction+and+facilitates+automated+patch-clamp+based+electrophysiological+study.">Blebbistatin protects iPSC-CMs from hypercontraction and facilitates automated patch-clamp based electrophysiological study.</a> Stem Cell Research. 56, 102565 (2021).</li><li>Milligan, C. J., M&#246;ller, C., Gamper, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Ion Channels: Methods and Protocols. , 171-187 (2013).</li></ol>

Mänsklig iPSC-teknik har vuxit fram som en kraftfull plattform för sjukdomsmodellering och läkemedelsscreening. Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för att mäta hiPSC-CM-kontraktilitet, fältpotential, åtgärdspotential och Ca2+ övergående. Detta protokoll ger en omfattande karakterisering av hiPSC-CM-kontraktilitet och elektrofysiologi. Dessa funktionella analyser har tillämpats i flera publikationer från vår grupp 12,13,18,24,25,26,27.</s...

Läkemedelsutveckling är en lång och dyr process. En studie av nya terapeutiska läkemedel som godkänts av US Food and Drug Administration (FDA) mellan 2009 och 2018 rapporterade att den uppskattade mediankostnaden för kapitaliserad forskning och kliniska prövningar var 985 miljoner dollar per produkt1. Läkemedelsinducerad kardiotoxicitet är den främsta orsaken till läkemedelsförlust och tillbakadragande från marknaden2. I synnerhet rapporteras kardiotoxicitet bland flera klasser av terapeutiska läkemedel3. Därför är hjärtsäkerhetsbedömning en avgörande komponent under läkemedelsutvecklingsprocessen. Det nuvarande paradigmet för hjärtsäkerhetsbedömning är fortfarande starkt beroende av djurmodeller. Artskillnader från användningen av djurmodeller erkänns dock alltmer som en primär orsak till felaktiga förutsägelser för läkemedelsinducerad kardiotoxicitet hos mänskliga patienter4. Till exempel skiljer sig morfologin för hjärtåtgärdspotential väsentligt mellan människor och möss på grund av bidragen från olika repolariserande strömmar5. Dessutom har differentiella isoformer av hjärtmyosin och cirkulära RNA som kan påverka hjärtfysiologin dokumenterats väl bland arter 6,7. För att överbrygga dessa luckor är det absolut nödvändigt att upprätta en tillförlitlig, effektiv och människobaserad modell för preklinisk hjärtsäkerhetsbedömning.
Den banbrytande uppfinningen av inducerad pluripotent stamcellsteknik (iPSC) har genererat oöverträffade plattformar för läkemedelsscreening och sjukdomsmodellering. Under det senaste decenniet har metoder för att generera humaninducerade pluripotenta stamcellsderiverade kardiomyocyter (hiPSC-CM) blivit väl etablerade 8,9. hiPSC-CMs har väckt stort intresse för deras potentiella tillämpningar inom sjukdomsmodellering, läkemedelsinducerad kardiotoxicitetsscreening och precisionsmedicin. Till exempel har hiPSC-CM använts för att modellera de patologiska fenotyperna av hjärtsjukdomar orsakade av genetiskt arv, såsom långt QT-syndrom10, hypertrofisk kardiomyopati 11,12 och dilaterad kardiomyopati13,14,15. Följaktligen har viktiga signalvägar som är inblandade i patogenesen av hjärtsjukdomar identifierats, vilket kan belysa potentiella terapeutiska strategier för effektiv behandling. Dessutom har hiPSC-CM använts för att screena läkemedelsinducerad kardiotoxicitet associerad med cancermedel, inklusive doxorubicin, trastuzumab och tyrosinkinashämmare16,17,18; Strategier för att mildra den resulterande kardiotoxiciteten undersöks. Slutligen möjliggör den genetiska informationen som lagras i hiPSC-CMs screening och förutsägelse av läkemedelsinducerad kardiotoxicitet på både individ- och populationsnivå19,20. Sammantaget har hiPSC-CM visat sig vara ett ovärderligt verktyg för personlig hjärtsäkerhetsförutsägelse.
Det övergripande målet med detta protokoll är att etablera metoder för att omfattande och effektivt undersöka de funktionella egenskaperna hos hiPSC-CMs, som är av stor betydelse för att tillämpa hiPSC-CMs mot sjukdomsmodellering, läkemedelsinducerad kardiotoxicitetsscreening och precisionsmedicin. Här beskriver vi en rad funktionella analyser för att bedöma de funktionella egenskaperna hos hiPSC-CMs, inklusive mätning av kontraktilitet, fältpotential, åtgärdspotential och kalcium (Ca2+) hantering (figur 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35 mm glass bottom dish with 20 mm micro-well #1.5 cover glass</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>D35-20-1.5-N</td>
			<td>Patch clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50x B27 supplements</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>hiPSC-CM culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well culture plate</td>
			<td>E &#38; K Scientific</td>
			<td>EK-27160</td>
			<td>hiPSC-CM culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well flat clear bottom black polystyrene TC-treated microplates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3603</td>
			<td>Contraction motion measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6964</td>
			<td>Enzymatic dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axion&#39;s Integrated Studio (AxIS)</td>
			<td>Axion Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>navigator software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>BF 100-50-10,</td>
			<td>Patch clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 1 M in H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>21115</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting chamber slides</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
			<td>Cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoView 48-well MEA plates</td>
			<td>Axion Biosystems</td>
			<td>M768-tMEA-48B</td>
			<td>MEA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco/Life Technologies</td>
			<td>12634028</td>
			<td>Extracellular matrix medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-190-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td>Intracellular pipette solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPC 10 USB&#160;patch clamp amplifier</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>89-5000</td>
			<td>Patch clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2, AM, cell permeant</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>F1221</td>
			<td>Ca2+ transient measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hiPSCs</td>
			<td>Stanford Cardiovascular Institute iPSC Biobank</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>529552</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10828-028</td>
			<td>hiPSC-CM seeding medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH 8&#160;M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4494</td>
			<td>Intracellular pipette solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda DG 4</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td></td>
			<td>Ca2+ transient measurement; ultra-high-speed wavelength switching light source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna-FL automated fluorescence cell counter</td>
			<td>WISBIOMED</td>
			<td>LB-L20001</td>
			<td>Cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maestro Pro&#160;MEA system</td>
			<td>Axion Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>MEA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>Extracellular matrix medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9187</td>
			<td>Intracellular pipette solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH 10&#160;M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>72068</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements AR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127 (20% Solution in DMSO)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P3000MP</td>
			<td>Ca2+ transient measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11875-119</td>
			<td>hiPSC-CM culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sony SI8000 Cell Motion Imaging System</td>
			<td>Sony Biotechnology</td>
			<td></td>
			<td>Contraction motion measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutter Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-97</td>
			<td>Patch clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue stain</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>T10282</td>
			<td>Cell counting</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

technical applications of microelectrode array and patch clamp recordings on human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes

Läkemedelsinducerad kardiotoxicitet är den främsta orsaken till läkemedelsförlust och tillbakadragande från marknaden. Att använda lämpliga prekliniska modeller för hjärtsäkerhetsbedömning är därför ett kritiskt steg under läkemedelsutvecklingen. För närvarande är hjärtsäkerhetsbedömningen fortfarande mycket beroende av djurstudier. Djurmodeller plågas dock av dålig translationell specificitet för människor på grund av artspecifika skillnader, särskilt när det gäller hjärtelektrofysiologiska egenskaper. Det finns därför ett akut behov av att utveckla en tillförlitlig, effektiv och människobaserad modell för preklinisk hjärtsäkerhetsbedömning. Humaninducerade pluripotenta stamcellsderiverade kardiomyocyter (hiPSC-CM) har framstått som en ovärderlig in vitro-modell för läkemedelsinducerad kardiotoxicitetsscreening och sjukdomsmodellering. hiPSC-CM kan erhållas från individer med olika genetisk bakgrund och olika sjuka tillstånd, vilket gör dem till ett idealiskt surrogat för att bedöma läkemedelsinducerad kardiotoxicitet individuellt. Därför måste metoder för att på ett heltäckande sätt undersöka de funktionella egenskaperna hos hiPSC-CM fastställas. I detta protokoll beskriver vi olika funktionella analyser som kan bedömas på hiPSC-CMs, inklusive mätning av kontraktilitet, fältpotential, åtgärdspotential och kalciumhantering. Sammantaget har införlivandet av hiPSC-CM i preklinisk hjärtsäkerhetsbedömning potential att revolutionera läkemedelsutvecklingen.

Detta protokoll beskriver hur man mäter kontraktionsrörelse, fältpotential, åtgärdspotential och Ca2+ transient av hiPSC-CMs. Ett schematiskt diagram inklusive enzymatisk matsmältning, cellsådd, underhåll och funktionell analysledning visas i figur 1. Bildandet av hiPSC-CM-monoskiktet är nödvändigt för mätning av sammandragningsrörelse (figur 2B). Ett representativt spår av hiPSC-CMs kontraktionsavslappningsrörelse visas i <strong clas...

Watch this Scientific Journal Video about Technical Applications of Microelectrode Array and Patch Clamp Recordings on Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes at JoVE.com

Technical Applications of Microelectrode Array and Patch Clamp Recordings on Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Humaninducerade pluripotenta stamcellsderiverade kardiomyocyter (hiPSC-CM) har framstått som en lovande in vitro-modell för läkemedelsinducerad kardiotoxicitetsscreening och sjukdomsmodellering. Här beskriver vi ett protokoll för att mäta kontraktiliteten och elektrofysiologin hos hiPSC-CM.

Tekniska tillämpningar av mikroelektrodmatris och patchkläminspelningar på humaninducerade pluripotenta stamcellsderiverade kardiomyocyter

Drug-induced cardiotoxicity is the leading cause of drug attrition and withdrawal from the market. Therefore, using appropriate preclinical cardiac safety ...

Hjärtsäkerhetsbedömning är en avgörande komponent under läkemedelsutvecklingsprocessen. Humana iPSC-härledda kardiomyocyter har visat sig vara en pålitlig, effektiv och mänsklig baserad modell för preklinisk hjärtsäkerhetsbedömning. Vi har etablerat metoder för att omfattande undersöka den funktionella egenskapen hos humana iPSC-härledda kardiomyocyter, som är av verkligt viktig sjukdomsmodellering, läkemedelsinducerad kardiotoxicitetsscreening och precisionsmedicin.Den växande införlivandet av humana iPSC-härledda kardiomyocyter i den vanliga prekliniska säkerhetsutvärderingsprocessen har potential att förbättra noggrannheten i toxicitetsförutsägelsen av en kandidats föreningar. Börja med att odla de humana iPSC-härledda kardiomyocyterna i minst 10 dagar innan mätningen görs. Slå på temperaturregulatorn och ställ in den på 37 grader celsius.Slå på mikroskopet, kameran och koldioxidtillförseln. Fyll platthållarens vattenmantel med en lämplig mängd sterilt avjoniserat vatten. Placera 96-brunnsplattan på platthållaren och inkubera cellerna i minst fem minuter.Öppna visningsprogramvaran och ställ sedan in kamerans bildhastighet till 75 bilder per sekund och video- eller bildupplösningen till 1024 x 1024 pixlar. Använd autofokus och automatisk ljusstyrka, spela in videor och bilder av humana iPSC-härledda kardiomyocyter. Placera försiktigt en åtta mikroliter droppe extra cellulär matrisbeläggningslösning över inspelningselektrodområdet för varje brunn i de 48 brunnsmikroelektroduppsättningsplattorna.Tillsätt sedan tre milliliter sterilt avjoniserat vatten till området kring brunnarna för att förhindra avdunstning av beläggningslösningen. Använd en pipettspets på 200 mikroliter och ta bort det mesta av det extra cellulära matrismediet från brunnsytan inom samma enda rad eller kolumn utan att vidröra elektroderna. Frö 50 000 celler per brunn i en åtta mikroliter droppe såddmedium över inspelningselektrodområdet.Upprepa tills alla brunnar har pläterats med celler. Inkubera sedan mikroelektrodmatrisplattorna i en fuktad cellodlingsinkubator. Tillsätt långsamt 150 mikroliter såddmedium till varje brunn i mikroelektrodmatrisplattorna.På dag 10 efter plätering, kontrollera densiteten hos spontan slående mänsklig iPSC CM-monolayer under ett mikroskop. Placera 48-brunns mikroelektrodmatrisplattan i inspelningsinstrumentet. Se till att temperaturen är 37 grader celsius och koldioxiden är 5%Öppna navigatorprogramvaran.I det experimentella installationsfönstret väljer du hjärtkonfiguration i realtid och fältpotentialinspelningar. Använd spontana eller klistra in slående konfigurationer. I taktdetekteringsparametrar ställer du in detektionströskeln till 300 mikrovolt, minsta slagperiod till 250 millisekunder och maximal slagperiod till fem sekunder.Välj polynomregression för beräkning av fältpotentialvaraktighet. Kontrollera om den elektriska aktivitetssignalen vid baslinjen är mogen och stabil och förvärva baslinjehjärtaktiviteterna i en till tre minuter. Utför inspelningen 10 dagar efter plätering.Byt ut det humana iPSC CM-underhållsmediet mot tyrodes lösning och låt cellerna acklimatisera sig i 15 minuter. Sätt i temperatursensorerna i kammaren och sätt 35 millimeter skålen inuti. Justera temperaturen till 37 grader celsius.Dra mikropipetterna från borosilikatglaskapillärer med en mikropipettdragare. Fyll mikropipetterna med den intracellulära lösningen och sätt in dem i hållaren ansluten till huvudsteget på patchklämförstärkaren. Öppna förvärvsprogramvaran, ladda inspelningsprotokollet för åtgärdspotential och välj konfigurationen av spänningsklämman.Sätt i mikropipetten i badlösningen och välj lämpliga enskilda humana iPSC CMs. Justera och sänk mikropipettens position bredvid den valda cellen med hjälp av en mikromanipulator. När pipettspetsen sätts in i badlösningen, kontrollera om pipettmotståndet finns på oscilloskopmonitorn.Placera pipetten nära cellen, och strömpulserna minskar något för att återspegla det ökande tätningsmotståndet. Applicera försiktigt sug med undertryck för att öka motståndet. Detta kommer att bilda en gigaseal.Applicera sedan tätningsfunktionen. Applicera ytterligare sug för att bryta membranet för att få en helcellsinspelningskonfiguration. Vid denna tidpunkt, växla från spänningsklämläge till strömklämläge, eller ingen ströminjektion med förstärkardialogen.Tryck på inspelningsknappen för att generera och spara inspelningsfilerna för åtgärdspotential. Utför kalciumövergående mätning minst 10 dagar efter plätering. Förbered färsk tyrodes lösning och Fura-2 AM-lastlösning.Aspirera det mänskliga iPSC CM-underhållsmediet och tvätta kamrarna med tyrodes lösning två gånger. Applicera 100 mikroliter Fura-2 AM lastlösning och inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur. Byt ut Fura-2 AM-lastlösningen med tyrodes lösning och inkubera i minst fem minuter för fullständig deesterifiering av Fura-2 AM. Tillsätt en droppe nedsänkningsolja på 40x oljedoppningsmålet för ett inverterat epifluorescensmikroskop.Placera cellkammaren i mikroskopets scenadapter. Montera temperaturregulatorkablarna i badkammaren och ställ in den på 37 grader celsius. Installera de elektriska fältstimuleringselektroderna och ställ in pulserna på 0,5 hertz med en varaktighet på 20 millisekunder.Slå på den ultrahöga våglängdsbrytande ljuskällan och ställ in den på 340 nanometer och 380 nanometer snabbt växlingsläge. Använd en exponeringstid på 20 millisekunder för båda våglängderna och en inspelningstid på 20 sekunder. Spela in videon som återspeglar realtidsförändringar av kalcium övergående, exportera data till ett kalkylblad för analys.Humana iPSC-härledda kardiomyocyter monolager användes för mätning av sammandragningsrörelse. Analys av ett spår av kontraktionsavslappningsrörelsen med hjälp av analysatorprogramvaran detekterade sammandragningarnas start, sammandragningstopp, sammandragningsände, avslappningstopp och avslappningsslut. Full täckning av det humana iPSC-härledda kardiomyocyterna monolager observerades på alla elektroder i mikroelektrodmatrisplattorna.De mogna vågformerna som registrerades av varje elektrod återspeglade hjärtfältpotentialen med identifierbara egenskaper. Efter analys erhölls taktperiod, fältpotentialvaraktighet och spikamplitud. Inspelningar av hela cellplåster i strömklämningsläge registrerade de spontana åtgärdspotentialerna hos enstaka kardiomyocyter.Efter analys erhölls flera parametrar, inklusive amplituden, maximal diastolisk potential och åtgärdspotentialens varaktighet. Efter analysen av kalciumavbildning erhölls F340 med F380-förhållande över tiden och råa spår av stimulerade kalciumtransienter plottades. Dessutom erhölls parametrar såsom amplitud, diastoliskt kalcium och kalciumförfall tau.Det är viktigt att använda de humana iPSC-härledda kardiomyocyterna som är i goda slagförhållanden, samt att säkerställa den höga renheten hos de humana iPSC-härledda kardiomyocyterna. Detta protokoll innehåller fyra specifika tekniker för att studera human iPSC-härledd kardiomyocytfunktionalitet, annan konfiguration eller automatisk om man ska studera hjärtjonströmmar som spelar en avgörande roll i hjärtat

Research

JoVE Journal

Medicine

Formation of Human Prostate Epithelium Using Tissue Recombination of Rodent Urogenital Sinus Mesenchyme and Human Stem Cells

Bildning av Human Prostate Epitel Använda Tissue rekombination av gnagare Urogenital Sinus mesenkym och mänskliga stamceller

Progress in prostate cancer research is severely  limited by the availability of human-derived and hormone-na&iuml;ve model systems,  which limit our ...

Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

Isolering och funktionell karakterisering av Human Ventrikulär Cardiomyocytes från Fresh Kirurgiska prover

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...

Tissue-simulating Phantoms for Assessing Potential Near-infrared Fluorescence Imaging Applications in Breast Cancer Surgery

Vävnads simulera Phantoms för bedömning Potentiella nära infraröda fluorescens bildåtergivning i bröstcancer kirurgi

Inaccuracies in intraoperative tumor localization and evaluation of surgical margin status result in suboptimal outcome of breast-conserving surgery ...

Multi-electrode Array Recordings of Human Epileptic Postoperative Cortical Tissue

Multi-elektrod Array Inspelningar av Human Epileptic Postoperativ kortikalvävnad

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Muscular Dystrophy Patients: Efficient Integration-free Reprogramming of Urine Derived Cells

Generering av inducerade pluripotenta stamceller från muskeldystrofi Patienter: Effektiv integration fria Omprogrammering av urin härledda celler

Dystrophic cardiomyopathy is a poorly understood consequence of muscular dystrophy. Generating induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) from patients with ...

Rapid and Efficient Generation of Recombinant Human Pluripotent Stem Cells by Recombinase-mediated Cassette Exchange in the AAVS1 Locus

Rapid and Efficient Generation of Recombinant Human Pluripotent Stem Cells by Recombinase-mediated Cassette Exchange in the AAVS1 Locus

Snabb och effektiv generering av rekombinant human pluripotenta stamceller genom Recombinase-medierad kassett Exchange i<em&gt; AAVS1</em&gt; Locus

Even with the revolution of gene-targeting technologies led by CRISPR-Cas9, genetic modification of human pluripotent stem cells&#160;(hPSCs)&#160;is ...

Targeted and Selective Treatment of Pluripotent Stem Cell-derived Teratomas Using External Beam Radiation in a Small-animal Model

Riktad och selektiv behandling av pluripotenta stamceller-derived Teratom använder externa balk strålning i en liten-djur-modell

The growing number of victims of &#34;stem cell tourism,&#34; the unregulated transplantation of stem cells worldwide, has raised concerns about the ...

Sarcomere Shortening of Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes using Fluorescent-Tagged Sarcomere Proteins.

Sarkomisk förkortning av pluripotenta stamcellsbaserade kardiomyocyter med fluorescerande taggade sarkomproteiner.

Pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (PSC-CMs) can be produced from both embryonic and induced pluripotent stem (ES/iPS) cells. These cells ...

Directed Induction of Retinal Organoids from Human Pluripotent Stem Cells

Riktad induktion av retinala organoider från humana pluripotenta stamceller

Retinal cell transplantation is a promising therapeutic approach, which could restore the retinal architecture and stabilize or even improve the visual ...

Microelectrode Array Recording of Sinoatrial Node Firing Rate to Identify Intrinsic Cardiac Pacemaking Defects in Mice

Mikroelektrod arrayinspelning av sinoatrie nodavfyrningshastighet för att identifiera inneboende hjärt pacemaking defekter hos möss

The sinoatrial node (SAN), located in the right atrium, contains the pacemaker cells of the heart, and dysfunction of this region can cause tachycardia or ...