Name: co-culture and transduction of murine thymocytes on delta-like 4-expressing stromal cells to study oncogenes in t-cell leukemia
Uploaded: 2023-06-09T15:00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Co-Culture and Transduction of Murine Thymocytes on Delta-Like 4-Expressing Stromal Cells to Study Oncogenes in T-Cell Leukemia at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من قبل البرنامج الداخلي للمعهد الوطني للسرطان ، مشروع ZIABC009287. تم الحصول على OP9-DL4 من الدكتور خوان كارلوس زونيغا بفلوكر (مركز سانيبروك للعلوم الصحية ، تورنتو ، أونتاريو ، كندا). يشكر المؤلفون برنامج علوم مختبر NCI-Frederick على مساعدتهم الفنية المستمرة ونصائحهم ومدخلاتهم التجريبية ، وكذلك جيف كاريل وميغان كاروان وكيمبرلي كلارمان للمساعدة في قياس التدفق الخلوي. نحن ممتنون لهوارد يونغ على المشورة والمدخلات الهامة.

<ol>
	<li>Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+development+made+simple.">T-cell development made simple.</a> Nature Reviews Immunology. 4 (1), 67 (2004).</li><li>Kodama, H., Nose, M., Niida, S., Nishikawa, S., Nishikawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+c-kit+receptor+in+the+adhesion+of+hematopoietic+stem+cells+to+stromal+cells.">Involvement of the c-kit receptor in the adhesion of hematopoietic stem cells to stromal cells.</a> Experimental Hematology. 22 (10), 979-984 (1994).</li><li>Nakano, T., Kodama, H., Honjo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+lymphohematopoietic+cells+from+embryonic+stem+cells+in+culture.">Generation of lymphohematopoietic cells from embryonic stem cells in culture.</a> Science. 265 (5175), 1098-1101 (1994).</li><li>Nakano, T., Kodama, H., Honjo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+development+of+primitive+and+definitive+erythrocytes+from+different+precursors.">In vitro development of primitive and definitive erythrocytes from different precursors.</a> Science. 272 (5262), 722-724 (1996).</li><li>Ueno, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stromal+cell-derived+membrane+protein+that+supports+hematopoietic+stem+cells.">A stromal cell-derived membrane protein that supports hematopoietic stem cells.</a> Nature Immunology. 4 (5), 457-463 (2003).</li><li>Jaleco, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+Notch+ligands+Delta-1+and+Jagged-1+in+human+lymphoid+differentiation.">Differential effects of Notch ligands Delta-1 and Jagged-1 in human lymphoid differentiation.</a> Journal of Experimental Medicine. 194 (7), 991-1002 (2001).</li><li>Mohtashami, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+comparison+of+Dll1-+and+Dll4-mediated+Notch+activation+levels+shows+differential+lymphomyeloid+lineage+commitment+outcomes.">Direct comparison of Dll1- and Dll4-mediated Notch activation levels shows differential lymphomyeloid lineage commitment outcomes.</a> Journal of Immunology. 185 (2), 867-876 (2010).</li><li>Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+T+cell+development+from+hematopoietic+progenitor+cells+by+delta-like-1+in+vitro.">Induction of T cell development from hematopoietic progenitor cells by delta-like-1 in vitro.</a> Immunity. 17 (6), 749-756 (2002).</li><li>Mazzucchelli, R., Durum, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-7+receptor+expression:+Intelligent+design.">Interleukin-7 receptor expression: Intelligent design.</a> Nature Reviews Immunology. 7 (2), 144-154 (2007).</li><li>Robey, E. A., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+in+lymphocyte+development+and+function.">Notch signaling in lymphocyte development and function.</a> Current Opinion in Immunology. 16 (3), 360-366 (2004).</li><li>Lavaert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+scRNA-Seq+identifies+human+postnatal+thymus+seeding+progenitors+and+regulatory+dynamics+of+differentiating+immature+thymocytes.">Integrated scRNA-Seq identifies human postnatal thymus seeding progenitors and regulatory dynamics of differentiating immature thymocytes.</a> Immunity. 52 (6), 1088-1104 (2020).</li><li>Roh, K. H., Roy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+approaches+for+regeneration+of+T+lymphopoiesis.">Engineering approaches for regeneration of T lymphopoiesis.</a> Biomaterials Research. 20 (20), (2016).</li><li>Zlotoff, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCR7+and+CCR9+together+recruit+hematopoietic+progenitors+to+the+adult+thymus.">CCR7 and CCR9 together recruit hematopoietic progenitors to the adult thymus.</a> Blood. 115 (10), 1897-1905 (2010).</li><li>Holmes, R., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+OP9-DL1+system:+Generation+of+T-lymphocytes+from+embryonic+or+hematopoietic+stem+cells+in+vitro.">The OP9-DL1 system: Generation of T-lymphocytes from embryonic or hematopoietic stem cells in vitro.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (2), (2009).</li><li>Cramer, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutant+IL-7Ralpha+and+mutant+NRas+are+sufficient+to+induce+murine+T+cell+acute+lymphoblastic+leukemia.">Mutant IL-7Ralpha and mutant NRas are sufficient to induce murine T cell acute lymphoblastic leukemia.</a> Leukemia. 32 (8), 1795-1882 (2018).</li><li>Treanor, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-7+receptor+mutants+initiate+early+T+cell+precursor+leukemia+in+murine+thymocyte+progenitors+with+multipotent+potential.">Interleukin-7 receptor mutants initiate early T cell precursor leukemia in murine thymocyte progenitors with multipotent potential.</a> Journal of Experimental Medicine. 211 (4), 701-713 (2014).</li><li>Yokoyama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+leukemogenic+potential+of+an+interleukin+7+receptor+alpha+chain+mutant+in+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells.">In vivo leukemogenic potential of an interleukin 7 receptor alpha chain mutant in hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Blood. 122 (26), 4259-4263 (2013).</li><li>Simmons, A., Alberola-Ila, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+transduction+of+T+cells+and+T+cell+precursors.">Retroviral transduction of T cells and T cell precursors.</a> Methods in Molecular Biology. 1323, 99-108 (2016).</li><li>. Retroviral systems Available from: <a target="_blank" href="https://web.stanford.edu/group/nolan/_OldWebsite/retroviral_systems/retsys.html">https://web.stanford.edu/group/nolan/_OldWebsite/retroviral_systems/retsys.html</a> (2022)</li><li>Xing, Y., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+identification,+and+purification+of+murine+thymic+epithelial+cells.">Isolation, identification, and purification of murine thymic epithelial cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (90), e51780 (2014).</li><li>Gray, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+kinetics,+turnover,+and+stimulatory+capacity+of+thymic+epithelial+cells.">Developmental kinetics, turnover, and stimulatory capacity of thymic epithelial cells.</a> Blood. 108 (12), 3777-3785 (2006).</li><li>Godfrey, D. I., Kennedy, J., Suda, T., Zlotnik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+pathway+involving+four+phenotypically+and+functionally+distinct+subsets+of+CD3-CD4-CD8-+triple-negative+adult+mouse+thymocytes+defined+by+CD44+and+CD25+expression.">A developmental pathway involving four phenotypically and functionally distinct subsets of CD3-CD4-CD8- triple-negative adult mouse thymocytes defined by CD44 and CD25 expression.</a> Journal of Immunology. 150 (10), 4244-4252 (1993).</li><li>Wang, Y. B., Edinger, M., Mittar, D., McIntyre, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+mouse+thymocyte+development+using+multiparametric+flow+cytometry:+An+efficient+method+to+improve+an+8-color+panel+on+the+BD+FACSVerse&#8482;+system.">Studying mouse thymocyte development using multiparametric flow cytometry: An efficient method to improve an 8-color panel on the BD FACSVerse&#8482; system.</a> BD Biosciences&#8211;Application Note. , (2012).</li><li>Sakaguchi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+thymic+T-cell+selection+due+to+a+mutation+of+the+ZAP-70+gene+causes+autoimmune+arthritis+in+mice.">Altered thymic T-cell selection due to a mutation of the ZAP-70 gene causes autoimmune arthritis in mice.</a> Nature. 426 (6965), 454-460 (2003).</li><li>He, X., Park, K., Kappes, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+ThPOK+in+control+of+CD4/CD8+lineage+commitment.">The role of ThPOK in control of CD4/CD8 lineage commitment.</a> Annual Review of Immunology. 28, 295-320 (2010).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+CXXC+motif+in+CD3epsilon+is+critical+for+T+cell+development+and+TCR+signaling.">A conserved CXXC motif in CD3epsilon is critical for T cell development and TCR signaling.</a> PLoS Biology. 7 (12), e1000253 (2009).</li><li>Aliahmad, P., Kadavallore, A., de la Torre, B., Kappes, D., Kaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TOX+is+required+for+development+of+the+CD4+T+cell+lineage+gene+program.">TOX is required for development of the CD4 T cell lineage gene program.</a> Journal of Immunology. 187 (11), 5931-5940 (2011).</li></ol>

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه

تم تطوير البروتوكول الموصوف هنا خصيصا لدراسات الخلايا التائية DN المشتقة من الغدة الصعترية (CD4− / CD8−) مع نقل الفيروسات القهقرية متبوعا بنموذج تمايز OP9-DL4. ومع ذلك ، فمن المحتمل أن الخلايا المستهدفة التي ستخضع لبروتوكول التنبيغ هذا متبوعا بتمايز الخلايا سيكون لها فائدة متعددة التخصصات أوسع. وبالتالي ، بالإضافة إلى الخلايا الصعترية غير الناضجة ، يمكن استخدام الخلايا الجذعية المكونة للدم ، مثل الخلايا المشتقة من كبد الجنين أو نخاع العظام ، في هذا البروتوكول.
أثبت نظام OP9-DL4 أنه نموذج فعال لدراسة وظيفة الجينات في مجموعة متنوعة من الجوانب ، بما في ذلك تمايز الخلايا17 وتكوين الأورام15. في حين أن التعديل العكسي للفيروسات الرجعية للأسلاف المكونة للدم هو تقنية راسخة تمكن من التعديل الوراثي المستقر ، فإن الجمع بين تحريض تمايز الخلايا على نظام OP9-DL4 ونقل الفيروسات القهقرية يتطلب العناية والمهارة. الجانب الحاسم لتحقيق النجاح مع هذا البروتوكول هو ضمان تنسيق جميع الخطوات بشكل جيد ، حيث يتضمن البروتوكول استخدام ثلاثة أنواع مختلفة من الخلايا التي يجب الحفاظ عليها صحية وفي التقاء مثالي مطلوب لكل مرحلة محددة. مع وضع ذلك في الاعتبار ، من المهم إجراء جميع تحليلات نقاط تفتيش مراقبة الجودة بعد تنفيذ كل خطوة قبل الانتقال إلى الخطوة التالية. سيضمن ذلك أن جميع الخطوات تعمل. لذلك ، يعد التحقق من كفاءة الاستنفاد والنقل والنقل أمرا مهما للتنفيذ الناجح لهذا البروتوكول (انظر النتيجة النموذجية لكفاءة النقل في الشكل 4). ترتبط كفاءة نقل الخلايا الأولية الجيدة بعيار فيروسي عالي. عادة ، تؤدي الحشوات الأكبر إلى انخفاض عيار الفيروس18. لأغراض التدريب ، نستخدم متجه فارغ لتمثيل النتائج التي يمكن الحصول عليها باستخدام هذا البروتوكول. في تجربتنا ، تختلف كفاءات النقل والنقل وفقا لحجم الإدراج ، لا سيما بالنظر إلى جينات مراسل العمود الفقري الفيروسي ، مثل GFP. تتمثل إحدى الاستراتيجيات التي يمكن استخدامها عند دراسة تفاعل أكثر من جين واحد في استنساخ كل جين في ناقل نقل مختلف ، يليه إنتاج الفيروس الفردي ، وأخيرا النقل المشترك للخلية المستهدفة. في هذه الحالة ، يمكن تطبيق خطوة اختيار لإزالة الخلايا المنقولة بشكل فردي والاحتفاظ فقط بالخلايا المتحولة بشكل مشترك.
تجدر الإشارة إلى أن غالبية خطوط خلايا طبقة التغذية اللحمية OP9-DL1 / DL4 قد تمت هندستها وراثيا للتعبير عن GFP كجزء من تركيبات DL1 أو DL47. في هذا البروتوكول ، استخدمنا ناقلا للفيروسات القهقرية يعبر أيضا عن GFP. ومع ذلك ، فهو أكثر إشراقا من بروتين GFP الذي تعبر عنه خلايا OP9-DL4 ولا يتداخل مع فحص النقل عند تصور الثقافة المشتركة تحت المجهر الفلوري.
تتمايز خلايا OP9 إلى خلايا دهنية بعد العديد من الممرات ، أو فترات طويلة في الثقافة ، أو في ظل ظروف الالتقاء المفرط19. يتضح هذا من خلال تطور فجوات كبيرة. وبالتالي ، لا ينبغي استخدام خلايا OP9 التي تقدم هذه الخصائص في هذا البروتوكول. سيؤدي نقل الخلايا المنتجة للفيروسات القهقرية شديدة التلاشي إلى انخفاض عيار الفيروس. في الواقع ، المرحلة الفرعية هي عندما تكون الخلايا أكثر قابلية للنقل. علاوة على ذلك ، فإن نقل الخلايا المنتجة للفيروسات القهقرية منخفضة الالتقاء سيقلل من إجهاد الخلية في عملية النقل ويعطي أعلى عيار للفيروس.
بينما ، في هذا البروتوكول ، لا نقوم بمعايرة طاف الفيروس ، يجب مراعاة معايرة طاف الفيروس في بعض الحالات ، مثل عدم وجود جين مراسل في ناقل الفيروسات القهقرية ، مما يمنع التحديد غير المباشر للإنتاج الفيروسي ، أو في الحالات التي يتطلب فيها التصميم التجريبي عددا أكثر دقة من نسخ الجينات المحورة ليتم دمجها في جينوم الخلية المستهدفة. ومع ذلك ، من المهم ملاحظة أن عيار طافية ناقل الفيروسات القهقرية ينخفض بشكل كبير عند تخزينه عند -80 درجة مئوية أو 4 درجات مئوية حتى يتم الحصول على نتائج المعايرة. لذلك ، فإن استخدام طاف الفيروس الطازج للتنبيغ سيؤدي إلى كفاءة نقل أفضل.
تحتوي الغدة الصعترية على عدد كبير من الخلايا الصعترية المزدوجة الإيجابية (DP) (أكثر من 85٪) وحوالي 10٪ من الخلايا الأحادية الإيجابية15 (CD4 أو CD8) ، وهي خلايا الغدة الصعترية في مرحلة ما بعد DN. لا يمكن لخلايا DP البقاء على قيد الحياة في المختبر للتلاعب بالفيروسات القهقرية ، في حين أن خلايا SP غير قابلة للتحويل. لذلك ، يمكن تطبيق هذا البروتوكول لتوليد خلايا الغدة الصعترية DN القابلة للنقل من ناقلات الفيروسات القهقرية.

يوفر خط الخلايا اللحمية لنخاع العظم OP9 نظاما مفيدا في المختبر لتحريض تكون اللمفاويات من عدة مصادر للأسلاف1. أظهرت الدراسات الأولى التي استخدمت خلايا OP9 أن عدم وجود تعبير عامل تحفيز مستعمرة البلاعم (MCSF) ساهم في قدرة خط خلايا OP9 على دعم تكون الدم وتمايز الخلايا البائية عن الخلايا الجذعية المكونة للدم المشتقة من نخاع العظم (HSCs) ، كما هو موضح لاحقا أيضا للخلايا الجذعية الجنينية (ESCs)2،3،4،5 . في الدراسات السابقة ، مكن توليد خلايا OP9 التي تشبه دلتا (OP9-DL1 / OP9-DL4) من تحريض التزام سلالة الخلايا التائية6 وأظهر القدرة على تلخيص نضج الغدة الصعترية بنجاح 7,8. باختصار ، تم وصف تطور الخلايا التائية من خلال التعبير المتسلسل لجزيئات CD4 و CD8. الخلايا الصعترية غير الناضجة "سلبية مزدوجة" (DN ، CD4− CD8−) ويمكن تقسيمها بشكل أكبر وفقا للتعبير السطحي ل CD44 و CD25. تتمايز الخلايا الصعترية DN من خلال مرحلة الإيجابية المفردة غير الناضجة (ISP) ، والتي تتميز بتعبير CD8 في الفئران و CD4 في البشر ، تليها المرحلة الإيجابية المزدوجة (DP) ، التي تتميز بالتعبير المشترك ل CD4 و CD8 ، وأخيرا ، المرحلة الإيجابية الفردية الناضجة ، التي تتميز بالتعبير عن CD4 أو CD89. تعبر HSCs عن مستقبل Notch1 ، والذي يتفاعل عادة مع 4 (DL4) الشبيه بالدلتا المعبر عنه على الخلايا الظهارية الصعترية للحث على تمايز سلالة T10. ومن ثم ، زاد الاهتمام بنموذج OP9-DL1 / 4 تدريجيا ، مما أدى إلى الاستخدام المكثف لهذا النهج في مجموعة واسعة من التطبيقات في العقدين الماضيين8،11،12،13. على الرغم من أن DL1 و DL4 قادران على دعم تمايز الخلايا التائية في المختبر ، إلا أنهما يظهران متطلبات تفاضلية في الجسم الحي ، وقد اقترحت بعض الدراسات أن OP9_DL4 أكثر كفاءة من OP9_DL1 في تلخيص بيئة الغدة الصعترية للفأر 7,14.
من بين التطبيقات المحتملة لنظام OP9-DL1/4 ، هناك اهتمام خاص بالجمع بين هذا النظام ونقل خلايا DN أو HSCs مع ناقلات الفيروسات القهقرية. هذا المزيج هو وسيلة فعالة لمعالجة التعبير الجيني أثناء نمو الخلايا التائية الطبيعية وتكوين الكريات البيض وقد ثبت أنه طريقة فعالة للحث أو تثبيط وظيفة الجين محلالاهتمام 15،16،17. تم استخدام هذا النموذج بنجاح خاص لدراسة التعاون بين الجينات المسرطنة التي تقود سرطان الدم15 لأنه مرن ويتيح فحص آثار مجموعات جينية متعددة في وقت معقول ، على عكس توليد الفئران المعدلة وراثيا. علاوة على ذلك ، تم استخدام نماذج مماثلة سابقا لتقييم آثار إدخال الجينات المسرطنة في الخلايا الطبيعية15،16،17. بالإضافة إلى ذلك ، يتطلب نقل الفيروسات القهقرية تقسيم الخلايا لتكامل الجينات المحورة18 ، وبينما سيتغلب نقل الفيروسات العدسية على هذا القيد من خلال القضاء على الحاجة إلى تقسيم الخلايا لتكامل الجينات المحورة ، لم نتمكن من تحقيق النقل الناجح لخلايا الغدة الصعترية DN باستخدام ناقلات الفيروسات العدسية. وبالتالي ، فإن OP9-DL1 / DL4 هو أداة مناسبة لزراعة الخلايا السلفية المكونة للدم.
يتضمن البروتوكول القياسي لتكوين اللمفاويات للخلايا الصعترية المحولة على OP9-DL4 سلسلة من الخطوات المنسقة التي يجب تنفيذها بعناية لتحقيق نتيجة ناجحة. على الرغم من أن هذه التقنيات كانت تخدم المجتمع بشكل جيد لسنوات عديدة ، إلا أن البروتوكولات المتاحة في الأدبيات غالبا ما تكون مجزأة. ونتيجة لذلك، يضطر كل مختبر إلى تكييف المراحل المختلفة من الإجراء وتحسينها، الأمر الذي قد يستغرق وقتا طويلا. هنا ، يصف هذا البروتوكول عزل الخلايا الصعترية DN من الغدة الصعترية للفأر ، يليها نقل الفيروسات القهقرية والاستزراع المشترك على الخلايا اللحمية OP9-DL4 لمزيد من التحليل الوظيفي. وقد ثبت أن هذا البروتوكول المعمول به فعال وقابل للتكرار في تحويل الخلايا الصعترية الأولية ، يليه التمايز على خلايا OP9-DL4 أو تحريض سرطان الدم الليمفاوي الحاد للخلايا التائية15.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysis buffer</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>10-548E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9998S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4 Microbeads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-049-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8 Microbeads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-049-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5910R</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5942IP802353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum HyClone FBS</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>&#160;SH30910.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LD columns</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td>Freeze glutamine in aliquots and use freshly-thawed glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P/N 52887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM-alpha Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12561-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPTI-MEM I Reducing Serum Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS pH 7.2</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcL-Eco Plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin/streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMIG Plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>6492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-Separation Filters</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-041-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombinant hFLT-3L</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombinant IL-7</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>217-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retrovial packaging cell line Phoenix-Eco</td>
			<td>Orbigen</td>
			<td>RVC-10002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter (0.45 &#181;m)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLHV033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

co-culture and transduction of murine thymocytes on delta-like 4-expressing stromal cells to study oncogenes in t-cell leukemia

يمكن تمييز الخلايا الصعترية غير الناضجة للفأر المحول إلى خلايا تائية في المختبر باستخدام نظام الاستزراع المشترك لخط الخلايا اللحمية لنخاع العظم الذي يشبه دلتا (OP9-DL4). نظرا لأن نقل الفيروسات القهقرية يتطلب انقسام الخلايا لتكامل الجينات المحورة ، فإن OP9-DL4 يوفر بيئة مناسبة في المختبر لزراعة الخلايا السلفية المكونة للدم. هذا مفيد بشكل خاص عند دراسة آثار التعبير عن جين معين أثناء نمو الخلايا التائية الطبيعية وتكوين الكريات البيض ، لأنه يسمح للباحثين بالتحايل على العملية التي تستغرق وقتا طويلا لتوليد الفئران المعدلة وراثيا. لتحقيق نتائج ناجحة ، يجب إجراء سلسلة من الخطوات المنسقة التي تنطوي على معالجة متزامنة لأنواع مختلفة من الخلايا بعناية. على الرغم من أن هذه إجراءات راسخة للغاية ، إلا أن عدم وجود مصدر مشترك في الأدبيات غالبا ما يعني أن هناك حاجة إلى سلسلة من التحسينات ، والتي يمكن أن تستغرق وقتا طويلا. وقد ثبت أن هذا البروتوكول فعال في تحويل الخلايا الصعترية الأولية متبوعا بالتمايز على خلايا OP9-DL4. مفصل هنا هو بروتوكول يمكن أن يكون بمثابة دليل سريع ومحسن للثقافة المشتركة للخلايا الصعترية المحولة بالفيروسات القهقرية على الخلايا اللحمية OP9-DL4.

يمكن تقييم كفاءة الاستنفاد للتدفق الخلوي عن طريق تسمية جزء الخلية غير المسمى مغناطيسيا ل CD4 و CD8 بعد فصل الخلايا المغناطيسية المناعية (MACS) وتحليل ذلك على مخطط نقطي ثنائي المتغير ثنائي الأبعاد (الشكل 3). العائد الجيد للخلايا السالبة المزدوجة (CD4− ، CD8−) هو 95٪ أو أعلى ، كما هو موضح في الشكل 3. اثنان من أكثر الأسباب شيوعا لانخفاض الغلة هما سوء تقدير الميكروبيدات بناء على عدد الخلايا وعدد الخلايا المصنفة التي تتجاوز سعة العمود. يوصى باختيار العدد الصحيح لأعمدة MACS وفقا لعدد الخلايا المصنفة. عند العمل مع الخلايا الصعترية ، فإن عدد الخلايا المصنفة (خلايا DP و SP) يساوي تقريبا عدد الخلايا الكلية (أكثر من 96٪). يمكن إجراء عد الخلايا في عداد الخلايا التلقائي أو غرفة نيوباور أو بأي طريقة بديلة. نتيجة لذلك ، قد تحتاج الأحجام المخصصة لعد الخلايا إلى التعديل اعتمادا على الجهاز المحدد وطريقة العد المختارة.
من المهم تحديد عدد الخلايا الموجودة قبل وبعد النضوب. هناك حاجة إلى عدد الخلايا هذه لحساب عدد أعمدة استنفاد LD اللازمة ولتوزيع خلايا الغدة الصعترية DN بالتساوي في العدد المناسب من قوارير OP9-DL4. يمكن إجراء عناصر التحكم في قياس التدفق الخلوي (الخلايا غير المسماة ، والخلايا الموسومة ل CD4 ، والخلايا الموسومة ل CD8) باستخدام عينة ما قبل الاستنفاد المحجوزة ، حيث تحتوي على المزيد من الخلايا. ومع ذلك ، نظرا لأنه من المتوقع الاحتفاظ بمعظم الخلايا داخل العمود ، فإن عينة ما بعد الاستنفاد التي سيتم تسميتها ستتطلب حجما أكبر. وبالتالي ، قد يلزم إجراء تعديلات وفقا لبروتوكول وضع العلامات المحدد.
عند استخدام النواقل التي تعبر عن علامات قابلة للفحص ، مثل جين مضان ، يمكن تقييم النقل والنقل بشكل تقريبي وتجريبي بواسطة الفحص المجهري الفلوري (الشكل 2). يمكن تحليل كفاءة النقل عن طريق حصاد الغدة الصعترية من الطبقة الأحادية OP9-DL4 ، كما هو موضح في الخطوة 8.3 ، والنظر في التعبير عن جين مضان عن طريق قياس التدفق الخلوي. كانت كفاءة النقل باستخدام ناقل فيروسات قهقرية فارغ مع GFP كجين مراسل 84.2٪ (الشكل 4).
يمكن ملاحظة تمايز الخلايا التائية على خلايا OP9-DL4 بعد 4 أيام من النقل. عادة ما يتم إجراء قياس التدفق الخلوي لتقييم تمايز الخلايا الناجم عن الثقافة المشتركة على خلايا OP9-DL4 و / أو التعبير الجيني ، كما هو موضح في الشكل 5 ، حيث تم تسمية الخلايا ل CD4 و CD8 و CD44 و CD25. هناك العديد من المجموعات الممكنة من وسم جزيئات سطح الخلية التي ثبت أنها مفيدة للتحقيق في الآليات الجزيئية والخلوية لتطور الخلايا التائية في الفئران24،25،26،27. لذلك ، قد تختلف لوحات الأجسام المضادة الفلورية وفقا لمسألة الاهتمام التي يتم تناولها. قدم نقل الخلايا الصعترية DN مع ناقل الفيروس القهقري الفارغ pMIG ، الموضح في اللوحة B ، نفس النسب تقريبا من الإيجابيات الفردية (CD4 + أو CD8 +) ، والإيجابيات المزدوجة (CD4 + / CD8 +) ، والسلبيات المزدوجة (CD4− / CD8−) ، ومراحلها الفرعية مزدوجة سلبية 1-4 (DN1-DN4) مثل الخلايا الصعترية غير المنقولة ، الموضحة في اللوحة A ، مما يشير إلى أن نمو الخلايا التائية لم يتأثر بعملية التنبيث.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64271/64271fig01.jpg"> الشكل 1: شكل يوضح خطوات عزل الخلايا التوتية، ونقلها، وزراعتها المشتركة. الاختصار: DN = سلبي مزدوج. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64271/64271fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64271/64271fig02.jpg"> الشكل 2: الفحص المجهري الفلوري للثقافة المشتركة للخلايا الصعترية المحولة بواسطة GFP أو الخلايا الصعترية غير المنقولة وخلايا OP9-DL4. (أ) الخلايا الصعترية غير المنقولة و (ب) الخلايا الصعترية المستقرة المعبرة عن GFP على OP9-DL4 في اليوم الثالث بعد التنبيغ الثاني. تم استخدام مجهر مضان أوليمبوس-IX71 مع عدسة 40x ومرشح 480/30 مناسب للكشف عن GFP. شريط المقياس = 40 ميكرومتر. الاختصارات: GFP = بروتين الفلورسنت الأخضر. DN = مزدوج سلبي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64271/64271fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64271/64271fig03.jpg"> الشكل 3: قياس التدفق الخلوي لنضوب الخلايا التوتية. مخططات قياس التدفق الخلوي التمثيلية التي تحلل التعبير عن CD4 و CD8 على الخلايا الصعترية التي تم الحصول عليها من إناث الفئران C57BL / 6J البالغة من العمر 7-8 أسابيع (A) قبل النضوب و (B) بعد استنفاد CD4 + و CD8 + باستخدام الميكروبيدات وأعمدة LD وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. تظهر المخططات النقطية على اليسار بوابات بناء على حجم الحدث وتعقيده (FCS-A و SSC-A ، على التوالي). تعرض اللوحة الوسطى FSC-H مقابل FSC-A لبوابة الخلايا المفردة واستبعاد الثنائيات. في المؤامرات الموجودة على اليمين ، تم تعريف الخلايا على أنها CD4 و CD8 من بوابة الخلية الواحدة. الاختصارات: FSC-A = منطقة ذروة التشتت الأمامية ؛ SSC-A = منطقة ذروة التشتت الجانبية ؛ FSC-H = ارتفاع ذروة التشتت الأمامي ؛ FITC = فلوريسئين إيزوثيوسيانات ؛ PE = فيكوريثرين. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64271/64271fig03large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64271/64271fig04.jpg"> الشكل 4: قياس التدفق الخلوي لكفاءة نقل الخلايا الصعترية للفيروسات القهقرية. (أ) الخلايا التوتية غير المنقولة المستزرعة في OP9-DL4؛ (ب) الخلايا الصعترية المنقولة بالفيروسات القهقرية على OP9-DL4 في اليوم الثالث بعد النقل. الاختصارات: FSC-A = منطقة ذروة التشتت الأمامية ؛ SSC-A = منطقة ذروة التشتت الجانبية ؛ FSC-H = ارتفاع ذروة التشتت الأمامي ؛ FITC = فلوريسئين إيزوثيوسيانات ؛ PE = فيكوريثرين. DN = مزدوج سلبي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64271/64271fig04large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64271/64271fig05.jpg"> الشكل 5: قياس التدفق الخلوي للخلايا الصعترية المستحثة بعد 4 أيام من الزراعة المشتركة OP9-DL4. (أ) غير محولة و (ب) محولة بالفيروس القهقري pMIG. تم أولا إغلاق الخلايا على خلايا حية ثم بوابات بناء على الحجم والتعقيد (FCS-A و SSC-A ، على التوالي) ، متبوعا برسم FSC-H مقابل FSC-A للبوابة على الخلايا المفردة واستبعاد المزدوجات. بالنسبة للخلايا غير المنقولة ، استخدمنا استراتيجية البوابة التالية. من بوابة الخلية الواحدة ، تم تعريف الخلايا على أنها إيجابيات مفردة (CD4 + أو CD8 +) ، وإيجابيات مزدوجة (CD4 + / CD8 +) ، وسلبيات مزدوجة (CD4− / CD8−). بعد ذلك ، من بوابة السالبات المزدوجة (CD4− / CD8−) ، تم تعريف الخلايا على أنها CD44 + و CD25 + و CD44 + / CD25 + و CD44− / CD25− ، كما هو موضح في اللوحة A. بالنسبة للخلايا المحولة pMIG ، الموضحة في اللوحة B ، من البوابة أحادية الخلية ، تم تعريف الخلايا أولا على أنها GFP + / GFP− ، ثم من خلايا GFP + ، تم تحديد توزيع عدد الخلايا في مراحل تطور الخلايا التائية الرئيسية ، كما هو محدد بواسطة تعبير CD4 و CD8 و CD44 و CD25 ، باستخدام نفس استراتيجية البوابة كما هو الحال بالنسبة للخلايا غير المجلدة. الاختصارات: FSC-A = منطقة ذروة التشتت الأمامية ؛ SSC-A = منطقة ذروة التشتت الجانبية ؛ FSC-H = ارتفاع ذروة التشتت الأمامي ؛ FITC = فلوريسئين إيزوثيوسيانات ؛ GFP = بروتين الفلورسنت الأخضر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64271/64271fig05large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Co-Culture and Transduction of Murine Thymocytes on Delta-Like 4-Expressing Stromal Cells to Study Oncogenes in T-Cell Leukemia at JoVE.com

Co-Culture and Transduction of Murine Thymocytes on Delta-Like 4-Expressing Stromal Cells to Study Oncogenes in T-Cell Leukemia

يصف هذا البروتوكول عزل الخلايا الصعترية السلبية المزدوجة من الغدة الصعترية للفأر متبوعة بنقل الفيروسات القهقرية والمزرعة المشتركة على نظام الاستزراع المشترك لخط لحمية نخاع العظم الشبيه بدلتا (OP9-DL4) لمزيد من التحليل الوظيفي.

الزراعة المشتركة ونقل الخلايا الصعترية للفئران على الخلايا اللحمية الشبيهة بدلتا 4 لدراسة الجينات المسرطنة في سرطان الدم في الخلايا التائية

Transduced mouse immature thymocytes can be differentiated into T cells&#160;in vitro&#160;using the delta-like 4-expressing bone marrow stromal cell line ...

يعد تحويل الخلايا الصعترية غير الناضجة مع ناقلات الفيروسات القهقرية وزراعة هذه الخلايا على الخلايا اللحمية OP9 DL4 تقنية صعبة. سيوفر هذا البروتوكول التفصيلي الوقت والجهد للباحثين أثناء تحسين هذه الأنظمة. توفر هذه التقنية نظاما مرنا في المختبر لدراسة آثار التعديلات الجينية على الخلايا التائية غير الناضجة ويمكن أن تكون مفيدة لدراسة تطور الخلايا التائية والسرطان.ستوضح الإجراء جيزيل رودريغز ، زميلة ما بعد الدكتوراه من مختبري. للبدء ، قم بزرع الخلايا المنتجة للفيروس القهقري قبل 18 إلى 24 ساعة من النقل عند التقاء 70 إلى 90٪ في كل بئر من صفيحة زراعة الأنسجة المكونة من ستة آبار تحتوي على ملليلتر من الخلية المنتجة للفيروس القهقري ، أو وسط RPC. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.لنقل الخلايا ، استبدل الوسط بوسط RPC جديد قبل ساعة واحدة من النقل. تحضير مخاليط lipofection عن طريق تخفيف أربعة ميكروغرام من الحمض النووي تحتوي على ميكروغرام من البلازميد المساعد pCL-Eco واثنين ميكروغرام من نقل البلازميد pMIG في 250 ميكرولتر من وسط المصل المختزل وتخلط بلطف. بعد ذلك ، امزج 10 ميكرولتر من كاشف النقل و 250 ميكرولتر من وسط المصل المنخفض واحتضانه لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.بعد خمس دقائق من الحضانة ، ادمج الحمض النووي المخفف مع كاشف النقل المخفف. تخلط بلطف وتحتضن لمدة 20 إلى 25 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. أضف 500 ميكرولتر من خليط الحمض النووي وكاشف النقل برفق إلى البئر الذي يحتوي على الخلايا المنتجة للفيروس القهقري عن طريق إسقاطها على الخلايا بحركة دائرية.امزج برفق عن طريق هز الطبق ذهابا وإيابا ثم احتضان الطبق في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 16 إلى 24 ساعة. بعد حوالي 16 ساعة من النقل ، استبدل الوسط القديم بملليلتر من وسط RPC الطازج واستمر في احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 20 إلى 24 ساعة. لتحضير معلق الخلية الوحيدة للخلية الصعترية ، ضع الغدة الصعترية المحصودة من الفئران الرحيمة في خمسة ملليلتر من PBS في طبق بتري.باستخدام شرائح زجاجية معقمة ، ضع الغدة الصعترية بين الأسطح المتجمدة للشرائح وفرك الشرائح برفق معا ، مع لف الغدة الصعترية بين الشريحتين. شطف الشرائح الزجاجية لجمع الخلايا وتجاهل الأنسجة اللحمية الغدة الصعترية المتبقية. قم بتصفية خمسة ملليلتر من تعليق الغدة الصعترية من خلال مرشح مصفاة خلية 30 أو 40 ميكرومتر وأجهزة الطرد المركزي للخلايا عند 300 جرام لمدة 10 دقائق.بعد إزالة المادة الطافية ، تحلل خلايا الدم الحمراء عن طريق إضافة ملليلتر واحد من محلول تحلل ACK لكل أنبوب لمدة دقيقة واحدة. أضف خمسة ملليلتر من المخزن المؤقت لاستنفاد الخلايا لإلغاء تنشيط المخزن المؤقت لتحلل ACK ، والطرد المركزي للتعليق عند 300 جم لمدة 10 دقائق ، وإعادة التعليق في واحد إلى خمسة ملليلتر من المخزن المؤقت لاستنفاد الخلايا للعد. بعد عد الخلايا والطرد المركزي عند 300 جم لمدة 10 دقائق ، أعد تعليق الخلايا مرة واحدة من 10 إلى السابعة في 80 ميكرولترا من المخزن المؤقت لاستنفاد الخلايا.أضف 10 ميكرولتر لكل من ميكروبيدات CD4 و CD8 لكل واحد في 10 إلى الخلايا السابعة. تخلط جيدا وتحتضن لمدة 15 دقيقة في الظلام في الثلاجة. بعد ذلك ، قم بإعداد عمود استنفاد عن طريق شطفه بملليلتر من المخزن المؤقت للنضوب والتخلص من التدفق.اغسل الخلايا المحتضنة بإضافة واحد إلى ملليلتر من المخزن المؤقت للنضوب لكل واحد في 10 الخلايا السبع. أجهزة الطرد المركزي في 300 G لمدة 10 دقائق وتجاهل طاف. بعد ذلك ، قم بتطبيق تعليق الخلية المعاد تعليقه على العمود واجمع تدفق الخلايا غير المصنفة.اغسل العمود مرتين بمليلتر واحد من المخزن المؤقت واجمع التدفق. تلطيخ ضوابط كفاءة النضوب عن طريق تقسيم 200 ميكرولتر من الخلايا التي تم جمعها قبل النضوب إلى أربعة أنابيب FACS ، غير ملطخة ، CD4 أحادية اللون ، CD8 أحادية اللون ، و CD4 و CD8 مزدوجة اللون. استخدم العينات غير الملوثة والمفردة لإعداد معلمات قياس التدفق الخلوي.استخدم 1،000 ميكرولتر من الخلايا التي تم جمعها بعد النضوب لتلطيخ CD4 و CD8 وقارنها بالعينة المزدوجة الملطخة التي تم جمعها قبل النضوب. لزراعة الخلايا الصعترية ، ضع اثنين إلى خمسة مرات 10 إلى الخامس إلى واحد في 10 إلى سادس خلايا الغدة الصعترية بعد النضوب في قارورة T25 من 80 إلى 90٪ خلايا OP9 DL4 المتقاربة في وسط OP9 الذي يحتوي على السيتوكينات. احتضان الثقافة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة على خلايا OP9 DL4.لحصاد الفيروس القهقري ، اجمع المادة الطافية التي تحتوي على الفيروسات القهقرية من الخلايا المنقولة عن طريق إمالة الصفيحة ذات الستة آبار ثم وضع حقنة من ثلاثة إلى خمسة ملليلتر في أسفل اللوحة أثناء سحب المكبس لشفط المادة الطافية. قم بتصفية طاف الفيروس القهقري من خلال مرشح حقنة 0.45 ميكرومتر وجمع المرشح في أنبوب سعة 50 ملليلتر. استبدل الوسط بملليلتر من وسط RPC الطازج واستمر في احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 20 إلى 24 ساعة للتحويل الثاني.جمع الخلايا الصعترية من ثقافة OP9 DL4 عن طريق سحب العدوانية لإزالة الخلايا الصعترية وخلايا OP9 DL4 من سطح القارورة. قم بتصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر لإزالة معظم خلايا OP9 DL4 وجمع المرشح في أنبوب سعة 50 ملليلتر. أجهزة الطرد المركزي الخلايا الصعترية والمرشح في 300 غرام لمدة خمس دقائق وتجاهل طاف.إعادة تعليق الخلايا الصعترية في 0.5 إلى واحد ملليلتر من وسط OP9 مع السيتوكينات. أضف واحد إلى ملليلتر من وسط RPC الذي يحتوي على الفيروس. ثم أضف بروميد سداسي ميثرين بمعدل ثمانية ميكروجرام لكل ملليلتر من إجمالي معلق الخلية.قم بتدوير المحتويات عن طريق الطرد المركزي للخلايا عند 850 جم لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. أعد تعليق الخلايا في ستة ملليلتر من وسط OP9 مع السيتوكينات لكل قارورة وأضف التعليق مرة أخرى إلى الطبقة الأحادية للخلية OP9 DL4. احتضان عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.كرر خطوات حصاد الفيروس القهقري باستخدام بئر جديد من طاف الخلية المحتوي على الفيروس القهقري. الحفاظ على الخلايا الصعترية المتحولة على مزرعة OP9 DL4 لمدة يومين إلى خمسة أيام أو تجميدها حسب الحاجة. تم تقييم كفاءة الاستنفاد للتدفق الخلوي عن طريق تسمية جزء الخلية غير المسمى مغناطيسيا ل CD4 و CD8 بعد فصل الخلايا المغناطيسية المناعية وتحليل ذلك على مخطط نقطي ثنائي الأبعاد.العائد الجيد للخلايا السلبية المزدوجة ل CD4 و CD8 هو 95٪ أو أعلى ، كما هو موضح هنا. عند استخدام النواقل التي تعبر عن علامات قابلة للفحص مثل جين مضان ، يمكن تقييم النقل والنقل بشكل تقريبي وتجريبي بواسطة المجهر الفلوري. تم تحليل كفاءة النقل عن طريق حصاد الخلايا الصعترية من الطبقة الأحادية OP9 DL4.والنظر إلى التعبير عن جين مضان عن طريق قياس التدفق الخلوي. لوحظت كفاءة النقل باستخدام ناقل فيروسي قهقري فارغ مع GFP حيث كان جين المراسل 84.2٪ تمايز الخلايا التائية على خلايا OP9 DL4 بعد أربعة أيام من النقل. تحليل قياس التدفق الخلوي لتمايز الخلايا الناجم عن الثقافة المشتركة على خلايا OP9 DL4 والتعبير الجيني ، حيث تم تصنيف الخلايا ل CD4 و CD8 و CD44 و CD 25.قدم نقل الخلايا الصعترية السلبية المزدوجة مع ناقل الفيروس القهقري الفارغ pMIG نفس النسب تقريبا من الإيجابيات الفردية ، والإيجابيات المزدوجة ، والسلبيات المزدوجة ، ومراحلها الفرعية السلبية المزدوجة من واحد إلى أربعة مثل الخلايا الصعترية غير المنقولة ، مما يشير إلى أن تطور الخلايا التائية لم يتأثر بعملية التنبيث. أصعب مهمة عند محاولة تكرار هذا البروتوكول هي التأكد من إدارة أنواع الخلايا المختلفة في وقت واحد بطريقة منسقة. يمكن أن يؤثر الإفراط في التعبير عن الجينات المسرطنة في الخلايا الصعترية غير الناضجة أحيانا على نمو الخلايا التائية الطبيعي؛ ومن ثم فإن التنميط المناعي اللاحق عن طريق قياس التدفق الخلوي يعد طريقة مفيدة لمعرفة الاتجاه الذي يجب اتخاذه.يمكن إجراء مزيد من التحقيق في الإمكانات المسرطنة للخلايا التائية المحولة المتمايزة على خلايا طبقة الجنين عن طريق الحقن في الفئران التي تعاني من ضعف المناعة.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Live Imaging to Study Microtubule Dynamic Instability in Taxane-resistant Breast Cancers

تصوير لايف لدراسة أنيبيب عدم الاستقرار الديناميكي في سرطان الثدي المقاومة للالتاكسين

Taxanes such as docetaxel belong to a group of microtubule-targeting agents (MTAs) that are commonly relied upon to treat cancer. However, taxane ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

التدفق الخلوي لتقدير لوكيميا الخلايا الجذعية في الابتدائي سرطان الدم النقوي الحاد والمريض-المشتقة-تكثيفها، في التشخيص والمتابعة حتى

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

تقييم الأيضية للخلايا اللوكيميا الرئيسية

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

عزل الخلايا الجذعية الوسيطة من أنسجة اللب والثقافة المشتركة مع الخلايا السرطانية لدراسة التفاعلات الخاصة بها

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

تحليل مقياس التدفق لأنواع الأكسجين التفاعلي الميتوكوندريا في الجذعية المكونة للدم وخلايا البروجينوتريو وابيضاض الدم المدفوع MLL-AF9

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Subcellular Fractionation of Primary Chronic Lymphocytic Leukemia Cells to Monitor Nuclear/Cytoplasmic Protein Trafficking

تجزئه خلايا سرطان الدم اللمفاوية المزمنة الاوليه لرصد الاتجار بالبروتين النووي/الخلوي

Nuclear export of macromolecules is often deregulated in cancer cells. Tumor suppressor proteins, such as p53, can be rendered inactive due to aberrant ...

Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions

الثقافة المشتركة للخلايا الشبيهة بالورم الأرومي الدبقي على الخلايا العصبية المنقوشة لدراسة الهجرة والتفاعلات الخلوية

Glioblastomas (GBMs), grade IV malignant gliomas, are one of the deadliest types of human cancer because of their aggressive characteristics. Despite ...

Co-culture of Glutamatergic Neurons and Pediatric High-Grade Glioma Cells Into Microfluidic Devices to Assess Electrical Interactions

الثقافة المشتركة للخلايا العصبية الغلوتاماترجية وخلايا الورم الدبقي عالية الجودة للأطفال في الأجهزة الدقيقة لتقييم التفاعلات الكهربائية

Pediatric high-grade gliomas (pHGG) represent childhood and adolescent brain cancers that carry a rapid dismal prognosis. Since there is a need to ...

Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-Derived Xenograft Mouse Model

تقييم السمية المرتبطة بالخلايا التائية لمستقبلات المستضد الخيمري باستخدام نموذج فأر Xenograft المشتق من سرطان الدم الليمفاوي الحاد

Chimeric antigen receptor T (CART) cell therapy has emerged as a powerful tool for the treatment of multiple types of CD19+ malignancies, which has led to ...

Quantifying Telomere Length Using Non-Radioactive Chemiluminescence Detection

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay (Video) | JoVE 

تحسين معلمات الأداء لمقايسة طول التيلومير TAGGG

Telomeres are repetitive sequences which are present at chromosomal ends; their shortening is a characteristic feature of human somatic cells. Shortening ...