Name: co-culture and transduction of murine thymocytes on delta-like 4-expressing stromal cells to study oncogenes in t-cell leukemia
Uploaded: 2023-06-09T15:00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Co-Culture and Transduction of Murine Thymocytes on Delta-Like 4-Expressing Stromal Cells to Study Oncogenes in T-Cell Leukemia at JoVE.com

इस काम को राष्ट्रीय कैंसर संस्थान के इंट्राम्यूरल कार्यक्रम, परियोजना ZIABC009287 द्वारा समर्थित किया गया था। ओपी 9-डीएल 4 डॉ जुआन कार्लोस ज़ुनिगा-पफ्लकर (सनीब्रुक हेल्थ साइंसेज सेंटर, टोरंटो, ओएन, कनाडा) से प्राप्त किया गया था। लेखक ों ने एनसीआई-फ्रेडरिक प्रयोगशाला पशु विज्ञान कार्यक्रम को उनकी निरंतर तकनीकी सहायता और प्रयोगात्मक सलाह और इनपुट के साथ-साथ जेफ कैरेल, मेगन कारवान और किम्बर्ली क्लारमैन को फ्लो साइटोमेट्री सहायता के लिए धन्यवाद दिया। हम महत्वपूर्ण सलाह और इनपुट के लिए हॉवर्ड यंग के आभारी हैं।

<ol>
	<li>Zuniga-Pflucker, J. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+T+cell+development+from+hematopoietic+progenitor+cells+by+delta-like-1+in+vitro.">Induction of T cell development from hematopoietic progenitor cells by delta-like-1 in vitro.</a> Immunity. 17 (6), 749-756 (2002).</li><li>Mazzucchelli, R., Durum, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-7+receptor+expression:+Intelligent+design.">Interleukin-7 receptor expression: Intelligent design.</a> Nature Reviews Immunology. 7 (2), 144-154 (2007).</li><li>Robey, E. A., Bluestone, J. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-7+receptor+mutants+initiate+early+T+cell+precursor+leukemia+in+murine+thymocyte+progenitors+with+multipotent+potential.">Interleukin-7 receptor mutants initiate early T cell precursor leukemia in murine thymocyte progenitors with multipotent potential.</a> Journal of Experimental Medicine. 211 (4), 701-713 (2014).</li><li>Yokoyama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+leukemogenic+potential+of+an+interleukin+7+receptor+alpha+chain+mutant+in+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells.">In vivo leukemogenic potential of an interleukin 7 receptor alpha chain mutant in hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Blood. 122 (26), 4259-4263 (2013).</li><li>Simmons, A., Alberola-Ila, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+transduction+of+T+cells+and+T+cell+precursors.">Retroviral transduction of T cells and T cell precursors.</a> Methods in Molecular Biology. 1323, 99-108 (2016).</li><li>. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+kinetics,+turnover,+and+stimulatory+capacity+of+thymic+epithelial+cells.">Developmental kinetics, turnover, and stimulatory capacity of thymic epithelial cells.</a> Blood. 108 (12), 3777-3785 (2006).</li><li>Godfrey, D. I., Kennedy, J., Suda, T., Zlotnik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+pathway+involving+four+phenotypically+and+functionally+distinct+subsets+of+CD3-CD4-CD8-+triple-negative+adult+mouse+thymocytes+defined+by+CD44+and+CD25+expression.">A developmental pathway involving four phenotypically and functionally distinct subsets of CD3-CD4-CD8- triple-negative adult mouse thymocytes defined by CD44 and CD25 expression.</a> Journal of Immunology. 150 (10), 4244-4252 (1993).</li><li>Wang, Y. 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लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है

यहां वर्णित प्रोटोकॉल विशेष रूप से थाइमस-व्युत्पन्न डीएन (सीडी 4−/सीडी 8−) टी सेल अध्ययन के लिए रेट्रोवायरल अभिकर्मक के साथ विकसित किया गया था, जिसके बाद ओपी 9-डीएल 4 भेदभाव मॉडल था। हालांकि, यह संभावना है कि लक्ष्य कोशिकाएं जो सेल भेदभाव के बाद पारगमन के इस प्रोटोकॉल के अधीन होंगी, उनकी व्यापक अंतःविषय उपयोगिता होगी। इस प्रकार, अपरिपक्व थाइमोसाइट्स के अलावा, हेमटोपोइएटिक स्टेम सेल, जैसे कि भ्रूण के यकृत या अस्थि मज्जा से प्राप्त कोशिकाएं, संभावित रूप से इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जा सकती हैं।
ओपी 9-डीएल 4 प्रणाली विभिन्न पहलुओं में जीन फ़ंक्शन का अध्ययन करने के लिए एक प्रभावी मॉडल साबित हुई है, जिसमें सेल भेदभाव17 और ऑन्कोजेनेसिस15 शामिल हैं। जबकि हेमटोपोइएटिक पूर्वजों का रेट्रोवायरल संशोधन एक अच्छी तरह से स्थापित तकनीक है जो स्थिर आनुवंशिक संशोधन को सक्षम बनाता है, ओपी 9-डीएल 4 प्रणाली और रेट्रोवायरल ट्रांसडक्शन पर सेल भेदभाव के प्रेरण के संयोजन के लिए देखभाल और कौशल की आवश्यकता होती है। इस प्रोटोकॉल के साथ सफलता प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण पहलू यह सुनिश्चित करना है कि सभी कदम अच्छी तरह से समन्वित हैं, क्योंकि प्रोटोकॉल में तीन अलग-अलग सेल प्रकारों का उपयोग करना शामिल है जिन्हें स्वस्थ रखने और प्रत्येक विशिष्ट चरण के लिए आवश्यक आदर्श संगम पर रखने की आवश्यकता है। इसे ध्यान में रखते हुए, अगले चरण पर आगे बढ़ने से पहले प्रत्येक चरण के निष्पादन के बाद सभी गुणवत्ता नियंत्रण चेकपॉइंट विश्लेषण करना महत्वपूर्ण है। यह सुनिश्चित करेगा कि सभी कदम काम कर रहे हैं। इसलिए, इस प्रोटोकॉल के सफल निष्पादन के लिए कमी, अभिकर्मक और पारगमन क्षमता की जांच करना महत्वपूर्ण है ( चित्रा 4 में पारगमन दक्षता के लिए एक विशिष्ट परिणाम देखें)। अच्छी प्राथमिक सेल ट्रांसडक्शन दक्षता एक उच्च वायरल टिटर से जुड़ी हुई है। आमतौर पर, बड़े आवेषण के परिणामस्वरूप वायरस टिटर्स18 कम होते हैं। प्रशिक्षण उद्देश्यों के लिए, हम इस प्रोटोकॉल के साथ प्राप्त किए जा सकने वाले परिणामों का प्रतिनिधित्व करने के लिए एक खाली वेक्टर का उपयोग करते हैं। हमारे अनुभव में, पारगमन और अभिकर्मक क्षमता सम्मिलित आकार के अनुसार भिन्न होती है, विशेष रूप से वायरल बैकबोन-व्यक्त रिपोर्टर जीन, जैसे जीएफपी को ध्यान में रखते हुए। एक से अधिक जीन की बातचीत का अध्ययन करते समय एक रणनीति का उपयोग किया जा सकता है, प्रत्येक जीन को एक अलग हस्तांतरण वेक्टर में क्लोन करना है, इसके बाद व्यक्तिगत वायरस उत्पादन, और अंत में, लक्ष्य सेल का सह-पारगमन। उस स्थिति में, एकल ट्रांसड्यूस कोशिकाओं को खत्म करने और केवल सह-ट्रांसड्यूस कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए एक चयन चरण लागू किया जा सकता है।
यह ध्यान देने योग्य है कि ओपी 9-डीएल 1 / डीएल 4 स्ट्रोमल फीडर परत सेल लाइनों के बहुमत को आनुवंशिक रूप से डीएल 1 या डीएल 4 निर्माण7 के हिस्से के रूप में जीएफपी को व्यक्त करने के लिए इंजीनियर किया गया है। इस प्रोटोकॉल में, हमने एक रेट्रोवायरल वेक्टर का उपयोग किया जो जीएफपी को भी व्यक्त करता है; हालांकि, यह ओपी 9-डीएल 4 कोशिकाओं द्वारा व्यक्त जीएफपी प्रोटीन की तुलना में उज्जवल है और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत सह-संस्कृति की कल्पना करते समय पारगमन निरीक्षण में हस्तक्षेप नहीं करता है।
ओपी 9 कोशिकाएं कई मार्गों के बाद एडिपोसाइट्स में अंतर करती हैं, संस्कृति में लंबी अवधि, या अति-संयोजन की स्थितियों केतहत। यह बड़े रिक्तिकाओं के विकास से स्पष्ट है। इस प्रकार, इन विशेषताओं को प्रस्तुत करने वाले ओपी 9 कोशिकाओं का उपयोग इस प्रोटोकॉल में नहीं किया जाना चाहिए। अत्यधिक कॉन्फ्लुएंट रेट्रोवायरस-निर्माता कोशिकाओं को स्थानांतरित करने से कम वायरस टिटर होगा। दरअसल, सबकॉन्फ्लुएंट चरण तब होता है जब कोशिकाएं सबसे अधिक स्थानांतरित होती हैं। इसके अलावा, कम-संगम रेट्रोवायरस-निर्माता कोशिकाओं को स्थानांतरित करने से अभिकर्मक प्रक्रिया में सेल तनाव कम हो जाएगा और उच्चतम वायरस टिटर मिलेगा।
हालांकि, इस प्रोटोकॉल में, हम वायरस सुपरनैटेंट को टाइट नहीं करते हैं, कुछ मामलों में वायरस सुपरनैटेंट अनुमापन पर विचार किया जाना चाहिए, जैसे कि रेट्रोवायरल वेक्टर में एक रिपोर्टर जीन की अनुपस्थिति में, जो वायरल उत्पादन के अप्रत्यक्ष निर्धारण को रोक देगा, या ऐसे मामलों में जहां प्रयोगात्मक डिजाइन को लक्ष्य सेल जीनोम में एकीकृत करने के लिए ट्रांसजीन प्रतियों की अधिक सटीक संख्या की आवश्यकता होती है। हालांकि, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि रेट्रोवायरल वेक्टर सुपरनैटेंट का टिटर -80 डिग्री सेल्सियस या 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत होने पर काफी कम हो जाता है जब तक कि अनुमापन परिणाम प्राप्त नहीं होते हैं। इसलिए, पारगमन के लिए ताजा तैयार वायरस सुपरनैटेंट का उपयोग करने से बेहतर पारगमन दक्षता प्राप्त होगी।
थाइमस में बड़ी संख्या में डबल-पॉजिटिव (डीपी) थाइमोसाइट्स (85% से अधिक) और लगभग 10% एकल-सकारात्मक15 कोशिकाएं (सीडी 4 या सीडी 8) होती हैं, जो पोस्ट-डीएन चरण थाइमोसाइट्स हैं। डीपी कोशिकाएं रेट्रोवायरल हेरफेर के लिए विट्रो में जीवित नहीं रह सकती हैं, जबकि एसपी कोशिकाएं अपरिवर्तनीय हैं। इसलिए, इस प्रोटोकॉल को रेट्रोवायरल वेक्टर ट्रांसड्यूसिबल डीएन थाइमोसाइट्स उत्पन्न करने के लिए लागू किया जा सकता है।

ओपी 9 अस्थि मज्जा स्ट्रोमल सेल लाइन पूर्वजोंके कई स्रोतों से लिम्फोपोइजिस के प्रेरण के लिए एक उपयोगी इन विट्रो सिस्टम प्रदान करती है। ओपी 9 कोशिकाओं का उपयोग करने वाले पहले अध्ययनों से पता चला है कि मैक्रोफेज कॉलोनी-उत्तेजक कारक (एमसीएसएफ) अभिव्यक्ति की कमी ने अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न हेमटोपोइएटिक स्टेम कोशिकाओं (एचएससी) से हेमटोपोइजिस और बी सेल भेदभाव का समर्थन करने के लिए ओपी 9 सेल लाइन की क्षमता में योगदान दिया, जैसा कि बाद में भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (ईएससी) 2,3,4,5 के लिए भी दिखाया गया था। . पिछले अध्ययनों में, डेल्टा जैसी 1/4-व्यक्त ओपी 9 कोशिकाओं (ओपी 9-डीएल 1 / ओपी 9-डीएल 4) की पीढ़ी ने टी सेल वंश प्रतिबद्धता6 के प्रेरण को सक्षम किया और थाइमिक परिपक्वता 7,8 को सफलतापूर्वक पुन: उत्पन्न करने की क्षमता का प्रदर्शन किया। संक्षेप में, टी सेल विकास को सीडी 4 और सीडी 8 अणुओं की अनुक्रमिक अभिव्यक्ति द्वारा वर्णित किया गया है। अपरिपक्व थाइमोसाइट्स "डबल-नकारात्मक" (डीएन, सीडी 4 − सीडी 8−) हैं और सीडी 44 और सीडी 25 की सतह अभिव्यक्ति के अनुसार आगे उप-विभाजित किए जा सकते हैं। डीएन थाइमोसाइट्स अपरिपक्व एकल-सकारात्मक (आईएसपी) चरण के माध्यम से अंतर करते हैं, जो चूहों में सीडी 8 अभिव्यक्ति और मनुष्यों में सीडी 4 की विशेषता है, इसके बाद डबल-पॉजिटिव (डीपी) चरण, सीडी 4 और सीडी 8 की सह-अभिव्यक्ति की विशेषता है, और अंत में, परिपक्व एकल-सकारात्मक चरण, सीडी 4 या सीडी 89 की अभिव्यक्ति की विशेषता है। एचएससी नॉच 1 रिसेप्टर को व्यक्त करते हैं, जो आमतौर पर टी वंश भेदभाव10 को प्रेरित करने के लिए थाइमिक उपकला कोशिकाओं पर व्यक्त डेल्टा जैसे 4 (डीएल 4) के साथ बातचीत करता है। इसलिए, ओपी 9-डीएल 1/4 मॉडल में रुचि उत्तरोत्तर बढ़ी है, जिससे पिछले दो दशकों में विभिन्न प्रकार के अनुप्रयोगों में इस दृष्टिकोण का व्यापक उपयोगहुआ है। यद्यपि डीएल 1 और डीएल 4 दोनों विट्रो में टी सेल भेदभाव का समर्थन करने में सक्षम हैं, वे विवो में अंतर आवश्यकताओं को दिखाते हैं, और कुछ अध्ययनों ने सुझाव दिया है कि OP9_DL4 माउस थाइमिक वातावरण 7,14 को पुन: व्यवस्थित करने में OP9_DL1 की तुलना में अधिक कुशल है।
ओपी 9-डीएल 1/4 प्रणाली के संभावित अनुप्रयोगों में, रेट्रोवायरल वैक्टर के साथ डीएन कोशिकाओं या एचएससी के पारगमन के साथ इस प्रणाली के संयोजन में विशेष रुचि है। यह संयोजन सामान्य टी सेल विकास और ल्यूकेमोजेनेसिस के दौरान जीन अभिव्यक्ति में हेरफेर करने का एक प्रभावी तरीका है औरइसे रुचि के जीन 15,16,17 के कार्य को प्रेरित करने या बाधित करने के लिए एक कुशल विधि के रूप में दिखाया गया है। इस मॉडल का उपयोग विशेष रूप से ल्यूकेमिया15 को चलाने वाले ऑन्कोजीन के बीच सहयोग का अध्ययन करने के लिए सफलतापूर्वक किया गया है क्योंकि यह लचीला है और ट्रांसजेनिक चूहों को उत्पन्न करने के विपरीत उचित समय में कई जीन संयोजनों के प्रभावों की जांच को सक्षम बनाता है। इसके अलावा, इसी तरह के मॉडल का उपयोग पहले सामान्य कोशिकाओं15,16,17 में ऑन्कोजीन पेश करने के प्रभावों का आकलन करने के लिए किया गया है। इसके अतिरिक्त, रेट्रोवायरल ट्रांसडक्शन के लिए ट्रांसजीन एकीकरण18 के लिए विभाजित कोशिकाओं की आवश्यकता होती है, और जबकि लेंटिवायरल ट्रांसडक्शन ट्रांसजेन एकीकरण के लिए कोशिकाओं को विभाजित करने की आवश्यकता को समाप्त करके इस सीमा को दूर करेगा, हम लेंटीवायरल वैक्टर का उपयोग करके डीएन थाइमोसाइट्स के सफल पारगमन को प्राप्त करने में असमर्थ रहे हैं। इस प्रकार, ओपी 9-डीएल 1 / डीएल 4 हेमटोपोइएटिक पूर्वज कोशिकाओं को बढ़ाने के लिए एक उपयुक्त उपकरण है।
ओपी 9-डीएल 4 पर ट्रांसड्यूस्ड थाइमोसाइट्स के लिम्फोपोइजिस के लिए मानक प्रोटोकॉल में समन्वित चरणों की एक श्रृंखला शामिल है जिसे एक सफल परिणाम प्राप्त करने के लिए सावधानीपूर्वक किया जाना चाहिए। यद्यपि ये ऐसी तकनीकें हैं जो कई वर्षों से समुदाय की अच्छी तरह से सेवा कर रही हैं, अक्सर साहित्य में उपलब्ध प्रोटोकॉल खंडित होते हैं। नतीजतन, प्रत्येक प्रयोगशाला को प्रक्रिया के विभिन्न चरणों को अनुकूलित और अनुकूलित करने के लिए मजबूर किया जाता है, जो समय लेने वाला हो सकता है। यहां, यह प्रोटोकॉल माउस थाइमस से डीएन थाइमोसाइट्स के अलगाव का वर्णन करता है, इसके बाद आगे के कार्यात्मक विश्लेषण के लिए ओपी 9-डीएल 4 स्ट्रोमल कोशिकाओं पर रेट्रोवायरल ट्रांसडक्शन और सह-संस्कृति होती है। इस स्थापित प्रोटोकॉल को प्राथमिक थाइमोसाइट्स को ट्रांसड्यूस करने में कुशल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य दिखाया गया है, इसके बाद ओपी 9-डीएल 4 कोशिकाओं पर भेदभाव या टी सेल तीव्र लिम्फोब्लास्टिक ल्यूकेमिया15 का प्रेरण होता है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysis buffer</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>10-548E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9998S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4 Microbeads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-049-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8 Microbeads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-049-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5910R</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5942IP802353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum HyClone FBS</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>&#160;SH30910.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LD columns</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td>Freeze glutamine in aliquots and use freshly-thawed glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P/N 52887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM-alpha Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12561-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPTI-MEM I Reducing Serum Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS pH 7.2</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcL-Eco Plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin/streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMIG Plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>6492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-Separation Filters</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-041-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombinant hFLT-3L</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombinant IL-7</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>217-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retrovial packaging cell line Phoenix-Eco</td>
			<td>Orbigen</td>
			<td>RVC-10002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter (0.45 &#181;m)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLHV033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

co-culture and transduction of murine thymocytes on delta-like 4-expressing stromal cells to study oncogenes in t-cell leukemia

ट्रांसड्यूस्ड माउस अपरिपक्व थाइमोसाइट्स को डेल्टा-जैसे 4-व्यक्त अस्थि मज्जा स्ट्रोमल सेल लाइन सह-संस्कृति प्रणाली (ओपी 9-डीएल 4) का उपयोग करके विट्रो में टी कोशिकाओं में विभेदित किया जा सकता है। चूंकि रेट्रोवायरल ट्रांसडक्शन के लिए ट्रांसजीन एकीकरण के लिए विभाजित कोशिकाओं की आवश्यकता होती है, ओपी 9-डीएल 4 हेमटोपोइएटिक पूर्वज कोशिकाओं की खेती के लिए एक उपयुक्त इन विट्रो वातावरण प्रदान करता है। सामान्य टी सेल विकास और ल्यूकेमोजेनेसिस के दौरान एक विशिष्ट जीन की अभिव्यक्ति के प्रभावों का अध्ययन करते समय यह विशेष रूप से फायदेमंद है, क्योंकि यह शोधकर्ताओं को ट्रांसजेनिक चूहों को उत्पन्न करने की समय लेने वाली प्रक्रिया को दरकिनार करने की अनुमति देता है। सफल परिणामों को प्राप्त करने के लिए, विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के एक साथ हेरफेर से जुड़े समन्वित चरणों की एक श्रृंखला सावधानीपूर्वक की जानी चाहिए। यद्यपि ये बहुत अच्छी तरह से स्थापित प्रक्रियाएं हैं, साहित्य में एक सामान्य स्रोत की कमी का मतलब अक्सर अनुकूलन की एक श्रृंखला की आवश्यकता होती है, जो समय लेने वाली हो सकती है। इस प्रोटोकॉल को प्राथमिक थाइमोसाइट्स को ट्रांसड्यूस करने में कुशल दिखाया गया है, जिसके बाद ओपी 9-डीएल 4 कोशिकाओं पर भेदभाव किया गया है। विस्तृत यहां एक प्रोटोकॉल है जो ओपी 9-डीएल 4 स्ट्रोमल कोशिकाओं पर रेट्रोवायरल ट्रांसड्यूस्ड थाइमोसाइट्स की सह-संस्कृति के लिए एक त्वरित और अनुकूलित गाइड के रूप में काम कर सकता है।

इम्यूनोमैग्नेटिक सेल सेपरेशन (एमएसीएस) के बाद सीडी 4 और सीडी 8 के लिए चुंबकीय रूप से अनलेबल सेल अंश को लेबल करके और दो-आयामी द्विभिन्नरूपी डॉट-प्लॉट (चित्रा 3) पर इसका विश्लेषण करके कमी दक्षता का मूल्यांकन साइटोमेट्रिक रूप से प्रवाह किया जा सकता है। डबल नकारात्मक (CD4−, CD8−) कोशिकाओं की एक अच्छी उपज 95% या उससे अधिक है, जैसा कि चित्र 3 में दर्शाया गया है। कम उपज के दो सबसे आम कारण कोशिकाओं की संख्या और कॉलम क्षमता से अधिक लेबल कोशिकाओं की संख्या के आधार पर माइक्रोबीड्स की गलत गणना है। लेबल किए गए कोशिकाओं की संख्या के अनुसार एमएसीएस कॉलम की सही संख्या चुनने की सिफारिश की जाती है। थाइमोसाइट्स के साथ काम करते समय, लेबल कोशिकाओं (डीपी और एसपी कोशिकाओं) की संख्या कुल कोशिकाओं (96% से अधिक) की संख्या के लगभग बराबर होती है। सेल गिनती एक स्वचालित सेल काउंटर, एक न्यूबॉयर कक्ष, या किसी भी वैकल्पिक विधि के साथ की जा सकती है। नतीजतन, सेल गिनती के लिए आवंटित वॉल्यूम को विशिष्ट मशीन और चुनी हुई गिनती विधि के आधार पर समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है।
कमी से पहले और बाद में मौजूद कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करना महत्वपूर्ण है। इन सेल गणनाओं को आवश्यक एलडी रिक्तीकरण स्तंभों की संख्या की गणना करने और डीएन थाइमोसाइट्स को ओपी 9-डीएल 4 फ्लास्क की उचित संख्या में समान रूप से वितरित करने की आवश्यकता होती है। फ्लो साइटोमेट्री (अनलेबल कोशिकाओं, सीडी 4 के लिए लेबल की गई कोशिकाओं और सीडी 8 के लिए लेबल की गई कोशिकाओं) के लिए नियंत्रण आरक्षित पूर्व-रिक्तीकरण नमूने के साथ किया जा सकता है, क्योंकि इसमें अधिक कोशिकाएं होती हैं। हालांकि, चूंकि अधिकांश कोशिकाओं को कॉलम के भीतर बनाए रखने की उम्मीद है, इसलिए लेबल किए जाने वाले पोस्ट-रिक्तीकरण नमूने को उच्च मात्रा की आवश्यकता होगी। नतीजतन, चयनित लेबलिंग प्रोटोकॉल के अनुसार समायोजन करने की आवश्यकता हो सकती है।
प्रतिदीप्ति जीन जैसे स्क्रीन करने योग्य मार्करों को व्यक्त करने वाले वैक्टर का उपयोग करते समय, अभिकर्मक और पारगमन को प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (चित्रा 2) द्वारा मोटे तौर पर और अनुभवजन्य रूप से मूल्यांकन किया जा सकता है। पारगमन दक्षता का विश्लेषण ओपी 9-डीएल 4 मोनोलेयर से थाइमोसाइट की कटाई करके किया जा सकता है, जैसा कि चरण 8.3 में वर्णित है, और प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा प्रतिदीप्ति जीन की अभिव्यक्ति को देखते हुए। रिपोर्टर जीन के रूप में जीएफपी के साथ एक खाली रेट्रोवायरल वेक्टर का उपयोग करके पारगमन की दक्षता 84.2% थी (चित्रा 4)।
ओपी 9-डीएल 4 कोशिकाओं पर टी सेल भेदभाव पारगमन के 4 दिन बाद देखा जा सकता है। फ्लो साइटोमेट्री आमतौर पर ओपी 9-डीएल 4 कोशिकाओं और / या ट्रांसजीन अभिव्यक्ति पर सह-संस्कृति द्वारा प्रेरित सेल भेदभाव का आकलन करने के लिए किया जाता है, जैसा कि चित्रा 5 में दर्शाया गया है, जहां कोशिकाओं को सीडी 4, सीडी 8, सीडी 44 और सीडी 25 के लिए लेबल किया गया था। सेल सतह अणु लेबलिंग के कई संभावित संयोजन हैं जिन्हें चूहों 24,25,26,27 में टी सेल विकास के आणविक और सेलुलर तंत्र की जांच के लिए उपयोगी दिखाया गया है। इसलिए, फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी के पैनल संबोधित किए जा रहे ब्याज के सवाल के अनुसार भिन्न हो सकते हैं। पैनल बी में दिखाए गए खाली रेट्रोवायरल वेक्टर पीएमआईजी के साथ डीएन थाइमोसाइट्स के पारगमन ने एकल सकारात्मक (सीडी 4 + या सीडी 8 +), डबल पॉजिटिव (सीडी 4 + / सीडी 8 +), डबल नकारात्मक (सीडी 4 −/ सीडी 8 -), और इसके उप-चरण डबल-नकारात्मक 1-4 (डीएन 1-डीएन 4) के लगभग समान अनुपात को पैनल ए में दिखाया गया है, जो दर्शाता है कि टी सेल विकास पारगमन प्रक्रिया से प्रभावित नहीं था।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64271/64271fig01.jpg"> चित्रा 1: थाइमोसाइट अलगाव, पारगमन और सह-संस्कृति के चरणों का आरेख। संक्षिप्त नाम: डीएन = डबल-नकारात्मक। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64271/64271fig01large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64271/64271fig02.jpg"> चित्रा 2: जीएफपी-ट्रांसड्यूस्ड थाइमोसाइट्स या अपरिवर्तित थाइमोसाइट्स और ओपी 9-डीएल 4 कोशिकाओं की सह-संस्कृति फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी। (ए) दूसरे पारगमन के बाद दिन 3 पर ओपी 9-डीएल 4 पर अपरिवर्तित थाइमोसाइट्स और (बी) स्थिर जीएफपी-व्यक्त म्यूरिन थाइमोसाइट्स। एक ओलंपस-आईएक्स 71 फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप जिसमें 40 एक्स लेंस और जीएफपी का पता लगाने के लिए उपयुक्त 480/30 फिल्टर का उपयोग किया गया था। स्केल बार = 40 μm। संक्षेप: जीएफपी = हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन; डीएन = डबल-नकारात्मक। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64271/64271fig02large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64271/64271fig03.jpg"> चित्रा 3: थाइमोसाइट की कमी का प्रवाह साइटोमेट्री। निर्माता के निर्देशों के अनुसार माइक्रोबीड्स और एलडी कॉलम का उपयोग करके 7-8 सप्ताह पुराने सी 57बीएल / 6 जे महिला चूहों (ए) पूर्व-कमी और (बी) सीडी 4 + और सीडी 8 + की कमी के बाद से प्राप्त थाइमोसाइट्स पर सीडी 4 और सीडी 8 की अभिव्यक्ति का विश्लेषण करने वाले प्रतिनिधि फ्लो साइटोमेट्री प्लॉट। बाईं ओर के डॉट प्लॉट घटना के आकार और जटिलता (क्रमशः एफसीएस-ए और एसएससी-ए) के आधार पर गेट दिखाते हैं। मध्य पैनल एकल कोशिकाओं को गेट करने और डबल्स को बाहर करने के लिए एफएससी-एच बनाम एफएससी-ए दिखाता है। दाईं ओर के भूखंडों में, कोशिकाओं को एकल-सेल गेट से सीडी 4 और सीडी 8 के रूप में परिभाषित किया गया था। संक्षिप्तरूप: एफएससी-ए = आगे स्कैटर-पीक क्षेत्र; एसएससी-ए = साइड स्कैटर-पीक क्षेत्र; एफएससी-एच = आगे स्कैटर-पीक ऊंचाई; एफआईटीसी = फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट; पीई = फाइकोएरिथ्रिन। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64271/64271fig03large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64271/64271fig04.jpg"> चित्रा 4: थाइमोसाइट रेट्रोवायरल ट्रांसडक्शन दक्षता का फ्लो साइटोमेट्री। (ए) ओपी 9-डीएल 4 पर सह-संवर्धित अपरिवर्तित थाइमोसाइट्स; (बी) ट्रांसडक्शन के बाद दिन 3 पर ओपी 9-डीएल 4 पर रेट्रोवायरल ट्रांसड्यूस्ड थाइमोसाइट्स। संक्षिप्तरूप: एफएससी-ए = आगे स्कैटर-पीक क्षेत्र; एसएससी-ए = साइड स्कैटर-पीक क्षेत्र; एफएससी-एच = आगे स्कैटर-पीक ऊंचाई; एफआईटीसी = फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट; पीई = फाइकोएरिथ्रिन; डीएन = डबल-नकारात्मक। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64271/64271fig04large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64271/64271fig05.jpg"> चित्रा 5: ओपी 9-डीएल 4 सह-संस्कृति के 4 दिनों के बाद ट्रांसड्यूस्ड थाइमोसाइट्स का फ्लोसाइटोमेट्री। (ए) अपरिवर्तित और (बी) पीएमआईजी रेट्रोवायरस के साथ ट्रांसड्यूस किया गया। कोशिकाओं को पहले जीवित कोशिकाओं पर गेट किया गया था और फिर आकार और जटिलता (एफसीएस-ए और एसएससी-ए, क्रमशः) के आधार पर गेट किया गया था, इसके बाद एकल कोशिकाओं पर गेट करने और डबल्स को बाहर करने के लिए एफएससी-एच बनाम एफएससी-ए को प्लॉट किया गया था। अपरिवर्तित कोशिकाओं के लिए, हमने निम्नलिखित गेट रणनीति का उपयोग किया। एकल-सेल गेट से, कोशिकाओं को एकल सकारात्मक (सीडी 4 + या सीडी 8 +), डबल पॉजिटिव (सीडी 4 + / सीडी 8 +), और डबल नकारात्मक (सीडी 4 −/ सीडी 8 -) के रूप में परिभाषित किया गया था। फिर, डबल नकारात्मक (CD4−/CD8−) गेट से, कक्षों को CD44+, CD25+, CD44+/CD25+, और CD44−/CD25−के रूप में परिभाषित किया गया, जैसा कि पैनल A में दिखाया गया है। एकल-सेल गेट से पैनल बी में दिखाए गए पीएमआईजी ट्रांसड्यूस्ड कोशिकाओं के लिए, कोशिकाओं को पहले जीएफपी + / जीएफपी - के रूप में परिभाषित किया गया था, और फिर जीएफपी + कोशिकाओं से, सीडी 4, सीडी 8, सीडी 44 और सीडी 25 अभिव्यक्ति द्वारा परिभाषित प्रमुख टी सेल विकास चरणों में सेल जनसंख्या वितरण, उसी गेट रणनीति का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। संक्षिप्तरूप: एफएससी-ए = आगे स्कैटर-पीक क्षेत्र; एसएससी-ए = साइड स्कैटर-पीक क्षेत्र; एफएससी-एच = आगे स्कैटर-पीक ऊंचाई; एफआईटीसी = फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट; जीएफपी = हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64271/64271fig05large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a>

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Co-Culture and Transduction of Murine Thymocytes on Delta-Like 4-Expressing Stromal Cells to Study Oncogenes in T-Cell Leukemia

यह प्रोटोकॉल माउस थाइमस से डबल-नकारात्मक थाइमोसाइट्स के अलगाव का वर्णन करता है, जिसके बाद डेल्टा-जैसे 4-व्यक्त अस्थि मज्जा स्ट्रोमल सेल लाइन को-कल्चर सिस्टम (ओपी 9-डीएल 4) पर रेट्रोवायरल ट्रांसडक्शन और सह-संस्कृति होती है।

डेल्टा-जैसे 4-व्यक्त स्ट्रोमल कोशिकाओं पर म्यूरिन थाइमोसाइट्स की सह-संस्कृति और पारगमन टी-सेल ल्यूकेमिया में ऑन्कोजीन का अध्ययन करने के लिए

Transduced mouse immature thymocytes can be differentiated into T cells&#160;in vitro&#160;using the delta-like 4-expressing bone marrow stromal cell line ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Live Imaging to Study Microtubule Dynamic Instability in Taxane-resistant Breast Cancers

लाइव इमेजिंग अध्ययन करने के लिए taxane प्रतिरोधी स्तन कैंसर में microtubule गतिशील अस्थिरता

Taxanes such as docetaxel belong to a group of microtubule-targeting agents (MTAs) that are commonly relied upon to treat cancer. However, taxane ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

प्राथमिक तीव्र माइलॉयड ल्यूकेमिया में और रोगी-व्युत्पंन-xenografts में ल्यूकेमिया स्टेम कोशिकाओं का अनुमान करने के लिए प्रवाह Cytometry, निदान पर और अनुवर्ती

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

प्राथमिक ल्यूकेमिया कोशिकाओं के चयापचय प्रोफ़ाइल का आकलन

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Mesenchymal लुगदी ऊतक और सह कैंसर कोशिकाओं के साथ संस्कृति से कोशिका अलगाव स्टेम उनके बातचीत का अध्ययन करने के लिए

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

यूरीन हेमाटोपोएटिक स्टेम और संतति कोशिकाओं और एमएल-AF9 प्रेरित ल्यूकेमिया में Mitochondrial प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के प्रवाह Cytometric विश्लेषण

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Subcellular Fractionation of Primary Chronic Lymphocytic Leukemia Cells to Monitor Nuclear/Cytoplasmic Protein Trafficking

परमाणु/

Nuclear export of macromolecules is often deregulated in cancer cells. Tumor suppressor proteins, such as p53, can be rendered inactive due to aberrant ...

Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions

प्रवासन और सेलुलर इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए पैटर्न वाले न्यूरॉन्स पर ग्लियोब्लास्टोमा स्टेम जैसी कोशिकाओं की सह-संस्कृति

Glioblastomas (GBMs), grade IV malignant gliomas, are one of the deadliest types of human cancer because of their aggressive characteristics. Despite ...

Co-culture of Glutamatergic Neurons and Pediatric High-Grade Glioma Cells Into Microfluidic Devices to Assess Electrical Interactions

Glutamatergic न्यूरॉन्स और बाल चिकित्सा उच्च ग्रेड ग्लियोमा कोशिकाओं की सह-संस्कृति माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों में विद्युत इंटरैक्शन का आकलन करने के लिए

Pediatric high-grade gliomas (pHGG) represent childhood and adolescent brain cancers that carry a rapid dismal prognosis. Since there is a need to ...

Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-Derived Xenograft Mouse Model

एक तीव्र लिम्फोब्लास्टिक ल्यूकेमिया रोगी-व्युत्पन्न जेनोग्राफ्ट माउस मॉडल का उपयोग करके चिमेरिक एंटीजन रिसेप्टर टी सेल-संबद्ध विषाक्तता का आकलन

Chimeric antigen receptor T (CART) cell therapy has emerged as a powerful tool for the treatment of multiple types of CD19+ malignancies, which has led to ...

Quantifying Telomere Length Using Non-Radioactive Chemiluminescence Detection

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay (Video) | JoVE 

टीएजीजीजी टेलोमेरे लंबाई परख के प्रदर्शन मापदंडों का अनुकूलन

Telomeres are repetitive sequences which are present at chromosomal ends; their shortening is a characteristic feature of human somatic cells. Shortening ...