Name: co-culture and transduction of murine thymocytes on delta-like 4-expressing stromal cells to study oncogenes in t-cell leukemia
Uploaded: 2023-06-09T15:00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Co-Culture and Transduction of Murine Thymocytes on Delta-Like 4-Expressing Stromal Cells to Study Oncogenes in T-Cell Leukemia at JoVE.com

Эта работа была поддержана очной программой Национального института рака, проект ZIABC009287. OP9-DL4 был получен от доктора Хуана Карлоса Суньига-Пфлюкера (Центр медицинских наук Саннибрук, Торонто, Онтарио, Канада). Авторы благодарят Программу NCI-Frederick Laboratory Animal Sciences Program за их постоянную техническую помощь, экспериментальные советы и вклад, а также Джеффа Каррела, Меган Карван и Кимберли Кларманн за помощь в проточной цитометрии. Мы благодарны Говарду Янгу за критические советы и вклад.

<ol>
	<li>Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+development+made+simple.">T-cell development made simple.</a> Nature Reviews Immunology. 4 (1), 67 (2004).</li><li>Kodama, H., Nose, M., Niida, S., Nishikawa, S., Nishikawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+c-kit+receptor+in+the+adhesion+of+hematopoietic+stem+cells+to+stromal+cells.">Involvement of the c-kit receptor in the adhesion of hematopoietic stem cells to stromal cells.</a> Experimental Hematology. 22 (10), 979-984 (1994).</li><li>Nakano, T., Kodama, H., Honjo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+lymphohematopoietic+cells+from+embryonic+stem+cells+in+culture.">Generation of lymphohematopoietic cells from embryonic stem cells in culture.</a> Science. 265 (5175), 1098-1101 (1994).</li><li>Nakano, T., Kodama, H., Honjo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+development+of+primitive+and+definitive+erythrocytes+from+different+precursors.">In vitro development of primitive and definitive erythrocytes from different precursors.</a> Science. 272 (5262), 722-724 (1996).</li><li>Ueno, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stromal+cell-derived+membrane+protein+that+supports+hematopoietic+stem+cells.">A stromal cell-derived membrane protein that supports hematopoietic stem cells.</a> Nature Immunology. 4 (5), 457-463 (2003).</li><li>Jaleco, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+Notch+ligands+Delta-1+and+Jagged-1+in+human+lymphoid+differentiation.">Differential effects of Notch ligands Delta-1 and Jagged-1 in human lymphoid differentiation.</a> Journal of Experimental Medicine. 194 (7), 991-1002 (2001).</li><li>Mohtashami, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+comparison+of+Dll1-+and+Dll4-mediated+Notch+activation+levels+shows+differential+lymphomyeloid+lineage+commitment+outcomes.">Direct comparison of Dll1- and Dll4-mediated Notch activation levels shows differential lymphomyeloid lineage commitment outcomes.</a> Journal of Immunology. 185 (2), 867-876 (2010).</li><li>Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+T+cell+development+from+hematopoietic+progenitor+cells+by+delta-like-1+in+vitro.">Induction of T cell development from hematopoietic progenitor cells by delta-like-1 in vitro.</a> Immunity. 17 (6), 749-756 (2002).</li><li>Mazzucchelli, R., Durum, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-7+receptor+expression:+Intelligent+design.">Interleukin-7 receptor expression: Intelligent design.</a> Nature Reviews Immunology. 7 (2), 144-154 (2007).</li><li>Robey, E. A., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+in+lymphocyte+development+and+function.">Notch signaling in lymphocyte development and function.</a> Current Opinion in Immunology. 16 (3), 360-366 (2004).</li><li>Lavaert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+scRNA-Seq+identifies+human+postnatal+thymus+seeding+progenitors+and+regulatory+dynamics+of+differentiating+immature+thymocytes.">Integrated scRNA-Seq identifies human postnatal thymus seeding progenitors and regulatory dynamics of differentiating immature thymocytes.</a> Immunity. 52 (6), 1088-1104 (2020).</li><li>Roh, K. H., Roy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+approaches+for+regeneration+of+T+lymphopoiesis.">Engineering approaches for regeneration of T lymphopoiesis.</a> Biomaterials Research. 20 (20), (2016).</li><li>Zlotoff, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCR7+and+CCR9+together+recruit+hematopoietic+progenitors+to+the+adult+thymus.">CCR7 and CCR9 together recruit hematopoietic progenitors to the adult thymus.</a> Blood. 115 (10), 1897-1905 (2010).</li><li>Holmes, R., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+OP9-DL1+system:+Generation+of+T-lymphocytes+from+embryonic+or+hematopoietic+stem+cells+in+vitro.">The OP9-DL1 system: Generation of T-lymphocytes from embryonic or hematopoietic stem cells in vitro.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (2), (2009).</li><li>Cramer, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutant+IL-7Ralpha+and+mutant+NRas+are+sufficient+to+induce+murine+T+cell+acute+lymphoblastic+leukemia.">Mutant IL-7Ralpha and mutant NRas are sufficient to induce murine T cell acute lymphoblastic leukemia.</a> Leukemia. 32 (8), 1795-1882 (2018).</li><li>Treanor, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-7+receptor+mutants+initiate+early+T+cell+precursor+leukemia+in+murine+thymocyte+progenitors+with+multipotent+potential.">Interleukin-7 receptor mutants initiate early T cell precursor leukemia in murine thymocyte progenitors with multipotent potential.</a> Journal of Experimental Medicine. 211 (4), 701-713 (2014).</li><li>Yokoyama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+leukemogenic+potential+of+an+interleukin+7+receptor+alpha+chain+mutant+in+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells.">In vivo leukemogenic potential of an interleukin 7 receptor alpha chain mutant in hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Blood. 122 (26), 4259-4263 (2013).</li><li>Simmons, A., Alberola-Ila, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+transduction+of+T+cells+and+T+cell+precursors.">Retroviral transduction of T cells and T cell precursors.</a> Methods in Molecular Biology. 1323, 99-108 (2016).</li><li>. Retroviral systems Available from: <a target="_blank" href="https://web.stanford.edu/group/nolan/_OldWebsite/retroviral_systems/retsys.html">https://web.stanford.edu/group/nolan/_OldWebsite/retroviral_systems/retsys.html</a> (2022)</li><li>Xing, Y., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+identification,+and+purification+of+murine+thymic+epithelial+cells.">Isolation, identification, and purification of murine thymic epithelial cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (90), e51780 (2014).</li><li>Gray, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+kinetics,+turnover,+and+stimulatory+capacity+of+thymic+epithelial+cells.">Developmental kinetics, turnover, and stimulatory capacity of thymic epithelial cells.</a> Blood. 108 (12), 3777-3785 (2006).</li><li>Godfrey, D. I., Kennedy, J., Suda, T., Zlotnik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+pathway+involving+four+phenotypically+and+functionally+distinct+subsets+of+CD3-CD4-CD8-+triple-negative+adult+mouse+thymocytes+defined+by+CD44+and+CD25+expression.">A developmental pathway involving four phenotypically and functionally distinct subsets of CD3-CD4-CD8- triple-negative adult mouse thymocytes defined by CD44 and CD25 expression.</a> Journal of Immunology. 150 (10), 4244-4252 (1993).</li><li>Wang, Y. B., Edinger, M., Mittar, D., McIntyre, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+mouse+thymocyte+development+using+multiparametric+flow+cytometry:+An+efficient+method+to+improve+an+8-color+panel+on+the+BD+FACSVerse&#8482;+system.">Studying mouse thymocyte development using multiparametric flow cytometry: An efficient method to improve an 8-color panel on the BD FACSVerse&#8482; system.</a> BD Biosciences&#8211;Application Note. , (2012).</li><li>Sakaguchi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+thymic+T-cell+selection+due+to+a+mutation+of+the+ZAP-70+gene+causes+autoimmune+arthritis+in+mice.">Altered thymic T-cell selection due to a mutation of the ZAP-70 gene causes autoimmune arthritis in mice.</a> Nature. 426 (6965), 454-460 (2003).</li><li>He, X., Park, K., Kappes, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+ThPOK+in+control+of+CD4/CD8+lineage+commitment.">The role of ThPOK in control of CD4/CD8 lineage commitment.</a> Annual Review of Immunology. 28, 295-320 (2010).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+CXXC+motif+in+CD3epsilon+is+critical+for+T+cell+development+and+TCR+signaling.">A conserved CXXC motif in CD3epsilon is critical for T cell development and TCR signaling.</a> PLoS Biology. 7 (12), e1000253 (2009).</li><li>Aliahmad, P., Kadavallore, A., de la Torre, B., Kappes, D., Kaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TOX+is+required+for+development+of+the+CD4+T+cell+lineage+gene+program.">TOX is required for development of the CD4 T cell lineage gene program.</a> Journal of Immunology. 187 (11), 5931-5940 (2011).</li></ol>

У авторов нет конфликтов интересов, которые необходимо раскрывать

Описанный здесь протокол был разработан специально для исследований ДНК (CD4-/CD8-) Т-клеток, полученных из тимуса, с последующей ретровирусной трансфекцией с последующей моделью дифференцировки OP9-DL4. Однако вполне вероятно, что клетки-мишени, которые будут подвергнуты этому протоколу трансдукции с последующей дифференцировкой клеток, будут иметь более широкую междисциплинарную полезность. Таким образом, в дополнение к незрелым тимоцитам, гемопоэтические стволовые клетки, такие как клетки, полученные из печени плода или костного мозга, потенциально могут быть использованы в этом протоколе.
Система OP9-DL4 оказалась эффективной моделью для изучения функции генов в различных аспектах, включая дифференцировкуклеток 17 и онкогенез15. В то время как ретровирусная модификация гемопоэтических предшественников является хорошо зарекомендовавшим себя методом, который обеспечивает стабильную генетическую модификацию, сочетание индукции дифференцировки клеток в системе OP9-DL4 и ретровирусной трансдукции требует осторожности и навыков. Критическим аспектом для достижения успеха с этим протоколом является обеспечение хорошей координации всех шагов, поскольку протокол включает в себя использование трех различных типов клеток, которые необходимо поддерживать здоровыми и в идеальном слиянии, необходимом для каждого конкретного этапа. Имея это в виду, важно выполнить все анализы контрольных точек контроля качества после выполнения каждого шага, прежде чем переходить к следующему шагу. Это гарантирует, что все шаги работают. Таким образом, проверка эффективности истощения, трансфекции и трансдукции важна для успешного выполнения этого протокола (см. типичный результат эффективности трансдукции на рисунке 4). Хорошая эффективность первичной клеточной трансдукции связана с высоким титром вируса. Как правило, более крупные вставки приводят к более низким титрам вируса18. В учебных целях мы используем пустой вектор для представления результатов, которые могут быть получены с помощью этого протокола. По нашему опыту, эффективность трансдукции и трансфекции варьируется в зависимости от размера вставки, особенно с учетом репортерных генов, экспрессирующих вирусную магистраль, таких как GFP. Одна из стратегий, которая может быть использована при изучении взаимодействия более чем одного гена, заключается в клонировании каждого гена в другой вектор переноса с последующим производством отдельного вируса и, наконец, совместной трансдукцией клетки-мишени. В этом случае стадия отбора может быть применена для удаления одиночно трансдуцированных клеток и сохранения только котрансдуцированных клеток.
Стоит отметить, что большинство клеточных линий стромального фидерного слоя OP9-DL1/DL4 были генетически модифицированы для экспрессии GFP как части конструкций DL1 или DL47. В этом протоколе мы использовали ретровирусный вектор, который также экспрессирует GFP; однако он ярче, чем белок GFP, экспрессируемый клетками OP9-DL4, и не мешает трансдукционному контролю при визуализации кокультуры под флуоресцентным микроскопом.
Клетки OP9 дифференцируются в адипоциты после многих пассажей, длительных периодов в культуре или в условиях чрезмерного слияния19. Об этом свидетельствует развитие крупных вакуолей. Таким образом, ячейки OP9, обладающие этими характеристиками, не должны использоваться в этом протоколе. Трансфекция чрезмерно сливающихся клеток-продуцентов ретровируса приведет к низкому титру вируса. Действительно, субконфлюентная стадия - это когда клетки наиболее трансфицируемы. Кроме того, трансфекция клеток-продуцентов ретровируса с низким слиянием уменьшит клеточный стресс в процессе трансфекции и даст самый высокий титр вируса.
Хотя в этом протоколе мы не титруем надосадочную жидкость вируса, титрование надосадочной жидкости вируса необходимо учитывать в некоторых случаях, например, при отсутствии репортерного гена в ретровирусном векторе, что предотвратило бы косвенное определение продукции вируса, или в случаях, когда экспериментальный дизайн требует более точного количества копий трансгена, которые должны быть интегрированы в геном клетки-мишени. Однако важно отметить, что титр надосадочной жидкости ретровирусного вектора значительно снижается при хранении при -80 °C или 4 °C до получения результатов титрования. Таким образом, использование свежеприготовленного надосадочной жидкости вируса для трансдукции даст лучшую эффективность трансдукции.
Тимус содержит большое количество двойных положительных (DP) тимоцитов (более 85%) и около 10% одноположительных15 клеток (CD4 или CD8), которые являются тимоцитами пост-ДН-стадии. DP-клетки не могут выжить in vitro при ретровирусных манипуляциях, в то время как SP-клетки нетрансдумируемы. Таким образом, этот протокол может быть применен для генерации ретровирусного вектора, трансдуцируемого ДН-тимоцитов.

Линия стромальных клеток костного мозга OP9 обеспечивает полезную систему in vitro для индукции лимфопоэза из нескольких источников предшественников1. Первые исследования, в которых использовались клетки OP9, продемонстрировали, что отсутствие экспрессии колониестимулирующего фактора макрофагов (MCSF) способствовало способности клеточной линии OP9 поддерживать кроветворение и дифференцировку В-клеток из гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) костного мозга, что позже было показано и для эмбриональных стволовых клеток (ESCs)2,3,4,5 . В предыдущих исследованиях генерация дельта-подобных 1/4-экспрессирующих клеток OP9 (OP9-DL1/OP9-DL4) позволила индукировать приверженность линии Т-клеток6 и продемонстрировала способность успешно рекапитулировать созревание тимуса 7,8. Вкратце, развитие Т-клеток было описано последовательной экспрессией молекул CD4 и CD8. Незрелые тимоциты являются «двойноотрицательными» (DN, CD4-, CD8-) и могут быть дополнительно разделены в соответствии с поверхностной экспрессией CD44 и CD25. ДН-тимоциты дифференцируются через незрелую одноположительную (ISP) стадию, характеризующуюся экспрессией CD8 у мышей и CD4 у человека, за которой следует двойная положительная (DP) стадия, характеризующаяся совместной экспрессией CD4 и CD8, и, наконец, зрелая одноположительная стадия, характеризующаяся экспрессией CD4 или CD89. ГСК экспрессируют рецептор Notch1, который обычно взаимодействует с дельта-подобным 4 (DL4), экспрессируемым на эпителиальных клетках тимуса, индуцируя дифференцировку Т-линии10. Следовательно, интерес к модели OP9-DL1/4 постепенно возрастал, что привело к широкому использованию этого подхода в самых разных приложениях за последние два десятилетия 8,11,12,13. Хотя DL1 и DL4 способны поддерживать дифференцировку Т-клеток in vitro, они демонстрируют дифференциальные требования in vivo, и несколько исследований показали, что OP9_DL4 более эффективен, чем OP9_DL1, при повторении среды тимуса мыши 7,14.
Среди потенциальных применений системы OP9-DL1/4 особый интерес представляет комбинация этой системы с трансдукцией ДНК-клеток или ГСК ретровирусными векторами. Эта комбинация является эффективным способом манипулирования экспрессией генов во время нормального развития Т-клеток и лейкемогенеза и, как было показано, является эффективным методом индуцирования или ингибирования функции интересующего гена15,16,17. Эта модель была особенно успешно использована для изучения взаимодействия между онкогенами, управляющими лейкемией15, поскольку она является гибкой и позволяет изучать эффекты нескольких комбинаций генов в разумные сроки, в отличие от получения трансгенных мышей. Более того, подобные модели использовались ранее для оценки эффектов введения онкогенов в нормальные клетки15,16,17. Кроме того, ретровирусная трансдукция требует деления клеток для интеграции трансгена18, и хотя лентивирусная трансдукция преодолела бы это ограничение, устранив необходимость в делении клеток для интеграции трансгенов, мы не смогли добиться успешной трансдукции тимоцитов ДН с использованием лентивирусных векторов. Таким образом, OP9-DL1/DL4 является подходящим инструментом для выращивания гемопоэтических клеток-предшественников.
Стандартный протокол лимфопоэза трансдуцированных тимоцитов на OP9-DL4 включает в себя ряд скоординированных шагов, которые должны быть тщательно выполнены для достижения успешного результата. Несмотря на то, что эти методы хорошо служат обществу в течение многих лет, часто протоколы, доступные в литературе, фрагментированы. В результате каждая лаборатория вынуждена адаптировать и оптимизировать различные этапы процедуры, что может занять много времени. Здесь этот протокол описывает выделение тимоцитов ДНК из тимуса мыши с последующей ретровирусной трансдукцией и совместным культивированием на стромальных клетках OP9-DL4 для дальнейшего функционального анализа. Было показано, что этот установленный протокол эффективен и воспроизводим при трансдуцировании первичных тимоцитов с последующей дифференцировкой на клетках OP9-DL4 или индукцией Т-клеточного острого лимфобластного лейкоза15.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysis buffer</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>10-548E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9998S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4 Microbeads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-049-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8 Microbeads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-049-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5910R</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5942IP802353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum HyClone FBS</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>&#160;SH30910.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LD columns</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td>Freeze glutamine in aliquots and use freshly-thawed glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P/N 52887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM-alpha Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12561-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPTI-MEM I Reducing Serum Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS pH 7.2</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcL-Eco Plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin/streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMIG Plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>6492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-Separation Filters</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-041-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombinant hFLT-3L</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombinant IL-7</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>217-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retrovial packaging cell line Phoenix-Eco</td>
			<td>Orbigen</td>
			<td>RVC-10002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter (0.45 &#181;m)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLHV033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

co-culture and transduction of murine thymocytes on delta-like 4-expressing stromal cells to study oncogenes in t-cell leukemia

Трансдуцированные незрелые тимоциты мыши могут быть дифференцированы в Т-клетки in vitro с использованием дельта-подобной 4-экспрессирующей системы совместного культивирования линии стромальных клеток костного мозга (OP9-DL4). Поскольку ретровирусная трансдукция требует деления клеток для интеграции трансгенов, OP9-DL4 обеспечивает подходящую среду in vitro для культивирования гемопоэтических клеток-предшественников. Это особенно выгодно при изучении эффектов экспрессии определенного гена во время нормального развития Т-клеток и лейкемогенеза, поскольку позволяет исследователям обойти трудоемкий процесс создания трансгенных мышей. Для достижения успешных результатов необходимо тщательно выполнить ряд скоординированных шагов, включающих одновременное манипулирование различными типами клеток. Несмотря на то, что это очень хорошо зарекомендовавшие себя процедуры, отсутствие общего источника в литературе часто означает, что требуется ряд оптимизаций, которые могут занять много времени. Было показано, что этот протокол эффективен при трансдукции первичных тимоцитов с последующей дифференцировкой на клетках OP9-DL4. Здесь подробно описан протокол, который может служить быстрым и оптимизированным руководством для совместного культивирования ретровирусно трансдуцированных тимоцитов на стромальных клетках OP9-DL4.

Эффективность истощения можно оценить проточно-цитометрически, пометив магнитно немеченую клеточную фракцию для CD4 и CD8 после иммуномагнитного разделения клеток (MACS) и проанализировав ее на двумерной двумерной точечной диаграмме (рис. 3). Хороший выход двойных отрицательных (CD4-, CD8-) клеток составляет 95% или выше, как показано на рисунке 3. Двумя наиболее распространенными причинами снижения выхода являются неправильный расчет микрогранул на основе количества клеток и количества меченых клеток, превышающих емкость колонки. Рекомендуется выбирать правильное количество столбцов MACS в соответствии с количеством помеченных ячеек. При работе с тимоцитами количество меченых клеток (DP и SP клеток) практически равно количеству суммарных клеток (более 96%). Подсчет ячеек может производиться в автоматическом счетчике ячеек, камере Нойбауэра или любым альтернативным методом. В результате может потребоваться корректировка объемов, выделенных для подсчета ячеек, в зависимости от конкретной машины и выбранного метода подсчета.
Важно определить количество клеток, присутствующих до и после истощения. Эти подсчеты клеток необходимы для расчета количества необходимых столбцов истощения LD и равномерного распределения тимоцитов DN в соответствующее количество колб OP9-DL4. Контроль проточной цитометрии (немеченые клетки, клетки, меченные CD4, и клетки, меченные CD8), может быть выполнен с зарезервированным образцом до истощения, так как он содержит больше клеток. Однако, поскольку ожидается, что большая часть ячеек будет сохранена в столбце, образец после истощения, подлежащий маркировке, потребует большего объема. Следовательно, может потребоваться внести коррективы в соответствии с выбранным протоколом маркировки.
При использовании векторов, экспрессирующих скрининговые маркеры, таких как ген флуоресценции, трансфекцию и трансдукцию можно приблизительно и эмпирически оценить с помощью флуоресцентной микроскопии (рис. 2). Эффективность трансдукции может быть проанализирована путем сбора тимоцита из монослоя OP9-DL4, как описано на шаге 8.3, и изучения экспрессии гена флуоресценции с помощью проточной цитометрии. Эффективность трансдукции с использованием пустого ретровирусного вектора с GFP в качестве репортерного гена составила 84,2% (рис. 4).
Дифференцировка Т-клеток на клетках OP9-DL4 может наблюдаться через 4 дня после трансдукции. Проточную цитометрия обычно проводят для оценки дифференцировки клеток, индуцированной кокультурой на клетках OP9-DL4 и/или экспрессии трансгена, как показано на рисунке 5, где клетки были помечены для CD4, CD8, CD44 и CD25. Существует несколько возможных комбинаций маркировки молекул клеточной поверхности, которые, как было показано, полезны для исследования молекулярных и клеточных механизмов развития Т-клеток у мышей24,25,26,27. Следовательно, панели флуоресцентных антител могут варьироваться в зависимости от рассматриваемого вопроса. Трансдукция ДН-тимоцитов пустым ретровирусным вектором pMIG, показанная на панели B, представляла примерно те же пропорции одиночных положительных (CD4+ или CD8+), двойных положительных (CD4+/CD8+), двойных отрицательных (CD4-/CD8-) и ее подстадий, двойных отрицательных 1–4 (DN1–DN4), как и нетрансдуцированные тимоциты, показанные на панели А, что указывает на то, что процесс трансдукции не повлиял на развитие Т-клеток.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64271/64271fig01.jpg"> Рисунок 1: Схема этапов выделения, трансдукции и совместного культивирования тимоцитов. Аббревиатура: DN = двойное отрицание. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64271/64271fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64271/64271fig02.jpg"> Рисунок 2: Флуоресцентная микроскопия кокультуральной тимоцитов, трансдуцированных GFP, или нетрансдуцированных тимоцитов и клеток OP9-DL4. (A) Нетрансдуцированные тимоциты и (B) стабильные GFP-экспрессирующие мышиные тимоциты на OP9-DL4 на 3-й день после второй трансдукции. Использовался флуоресцентный микроскоп Olympus-IX71 с 40-кратным объективом и фильтром 480/30, подходящим для детектирования GFP. Масштабная линейка = 40 мкм. Сокращения: GFP = зеленый флуоресцентный белок; DN = двойное отрицательное. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64271/64271fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64271/64271fig03.jpg"> Рисунок 3: Проточная цитометрия истощения тимоцитов. Репрезентативные графики проточной цитометрии, анализирующие экспрессию CD4 и CD8 на тимоцитах, полученных от самок мышей C57BL/6J в возрасте 7-8 недель (A) до истощения и (B) после истощения CD4+ и CD8+ с использованием микрогранул и колонок LD в соответствии с инструкциями производителя. Точечные графики слева показывают ворота в зависимости от размера и сложности события (FCS-A и SSC-A соответственно). На средней панели показано сравнение FSC-H и FSC-A для затвора одиночных ячеек и исключения дублетов. На графиках справа клетки были определены как CD4 и CD8 от одноклеточного ворота. Сокращения: FSC-A = площадь пика прямого рассеяния; SSC-A = площадь пика бокового рассеяния; FSC-H = высота пика прямого рассеяния; FITC = изотиоцианат флуоресцеина; ПЭ = фикоэритрин. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64271/64271fig03large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64271/64271fig04.jpg"> Рисунок 4: Проточная цитометрия эффективности ретровирусной трансдукции тимоцитов. (A) Нетрансдуцированные тимоциты, совместно культивируемые на OP9-DL4; (B) ретровирусно трансдуцированные тимоциты на OP9-DL4 на 3-й день после трансдукции. Сокращения: FSC-A = площадь пика прямого рассеяния; SSC-A = площадь пика бокового рассеяния; FSC-H = высота пика прямого рассеяния; FITC = изотиоцианат флуоресцеина; ПЭ = фикоэритрин; DN = двойное отрицательное. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64271/64271fig04large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64271/64271fig05.jpg"> Рисунок 5: Проточная цитометрия трансдуцированных тимоцитов после 4 дней совместной культуры OP9-DL4. (A) Нетрансдуцированный и (B) трансдуцированный ретровирусом pMIG. Клетки сначала закрывали на живых клетках, а затем закрывали в зависимости от размера и сложности (FCS-A и SSC-A, соответственно), а затем строили график FSC-H по сравнению с FSC-A для затвора на одиночных клетках и исключения дублетов. Для нетрансдуцированных клеток мы использовали следующую стратегию ворот. Из одноклеточного затвора клетки были определены как одиночные положительные (CD4+ или CD8+), двойные положительные (CD4+/CD8+) и двойные отрицательные (CD4-/CD8-). Затем, с двойного отрицательного (CD4-/CD8-) затвора, клетки определяли как CD44+, CD25+, CD44+/CD25+ и CD44-/CD25−, как показано на панели A. Для трансдуцированных клеток pMIG, показанных на панели B, из одноклеточного ворота клетки сначала определялись как GFP+/GFP-, а затем из клеток GFP+ распределение популяции клеток на основные стадии развития Т-клеток, определяемое экспрессией CD4, CD8, CD44 и CD25, определяли с использованием той же стратегии ворот, что и для нетрансдуцированных клеток. Сокращения: FSC-A = площадь пика прямого рассеяния; SSC-A = площадь пика бокового рассеяния; FSC-H = высота пика прямого рассеяния; FITC = изотиоцианат флуоресцеина; GFP = зеленый флуоресцентный белок. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64271/64271fig05large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Co-Culture and Transduction of Murine Thymocytes on Delta-Like 4-Expressing Stromal Cells to Study Oncogenes in T-Cell Leukemia at JoVE.com

Co-Culture and Transduction of Murine Thymocytes on Delta-Like 4-Expressing Stromal Cells to Study Oncogenes in T-Cell Leukemia

Этот протокол описывает выделение двойных отрицательных тимоцитов из тимуса мыши с последующей ретровирусной трансдукцией и совместным культивированием в дельта-подобной 4-экспрессирующей системе совместного культивирования стромальных клеток костного мозга (OP9-DL4) для дальнейшего функционального анализа.

Совместное культивирование и трансдукция мышиных тимоцитов на дельта-подобных 4-экспрессирующих стромальных клетках для изучения онкогенов при Т-клеточном лейкозе

Transduced mouse immature thymocytes can be differentiated into T cells&#160;in vitro&#160;using the delta-like 4-expressing bone marrow stromal cell line ...

Трансдукция незрелых тимоцитов ретровирусными векторами и культивирование этих клеток на стромальных клетках OP9 DL4 является сложной задачей. Этот подробный протокол сэкономит время и усилия исследователей при оптимизации этих систем. Этот метод обеспечивает гибкую систему in vitro для изучения влияния генетических модификаций на незрелые Т-клетки и может быть полезен для изучения развития Т-клеток и рака.Продемонстрирует процедуру Жизель Родригес, постдокторант из моей лаборатории. Для начала засейте клетки-продуценты ретровируса за 18-24 часа до трансфекции при слиянии от 70 до 90% в каждой лунке шестилуночной пластины для культивирования тканей, содержащей два миллилитра клетки-продуцента ретровируса или среды RPC. Инкубируйте тарелку при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа.Чтобы трансфицировать клетки, замените среду свежей средой RPC за час до трансфекции. Приготовьте смеси для липофекции, разбавив четыре микрограмма ДНК, содержащие два микрограмма вспомогательной плазмиды pCL-Eco и два микрограмма трансферной плазмиды pMIG, в 250 микролитрах восстановленной сывороточной среды и аккуратно перемешайте. Далее смешайте 10 микролитров реагента для трансфекции и 250 микролитров восстановленной сывороточной среды и выдержите пять минут при комнатной температуре.После пяти минут инкубации соедините разбавленную ДНК с разбавленным реагентом для трансфекции. Аккуратно перемешайте и выдерживайте 20-25 минут при комнатной температуре. Аккуратно добавьте 500 микролитров смеси ДНК и реагента для трансфекции в лунку, содержащую клетки-продуценты ретровируса, опустив их на клетки круговыми движениями.Аккуратно перемешайте, раскачивая тарелку вперед и назад, а затем инкубируйте тарелку в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия в течение 16–24 часов. Примерно через 16 часов после трансфекции замените старую среду двумя миллилитрами свежей среды RPC и продолжайте инкубацию клеток при 37 градусах Цельсия в течение 20-24 часов. Чтобы приготовить одноклеточную суспензию тимоцитов, поместите собранный тимус от усыпленных мышей в пять миллилитров PBS в чашку Петри.Используя стерильные стеклянные предметные стекла, поместите тимус между матовыми поверхностями предметных стекол и аккуратно потрите предметные стекла друг о друга, перекатывая тимус между двумя предметными стеклами. Промойте предметные стекла, чтобы собрать клетки и выбросить оставшуюся стромальную ткань тимуса. Отфильтруйте пять миллилитров суспензии тимуса через 30- или 40-микрометровый фильтр клеточного фильтра и центрифугируйте клетки при 300 G в течение 10 минут.После удаления надосадочной жидкости лизируют эритроциты, добавляя один миллилитр буфера для лизиса ACK на пробирку в течение одной минуты. Добавьте пять миллилитров буфера для истощения клеток, чтобы деактивировать буфер лизиса ACK, центрифугируйте суспензию при 300 г в течение 10 минут и ресуспендируйте в одном-пяти миллилитрах буфера истощения клеток для подсчета. После подсчета клеток и центрифугирования при 300 G в течение 10 минут ресуспендируют клетки за один раз от 10 до седьмого в 80 микролитрах буфера истощения клеток.Добавьте по 10 микролитров микрогранул CD4 и CD8 по 10 к седьмым клеткам. Хорошо перемешать и выдержать 15 минут в темноте в холодильнике. Затем подготовьте обеднительную колонну, промыв ее двумя миллилитрами обедненного буфера и выбросив проточный.Промойте инкубированные клетки, добавив один-два миллилитра обедненного буфера на 10 семь клеток. Центрифугу при 300 г в течение 10 минут и выбросьте надосадочную жидкость. Затем нанесите ресуспендированную клеточную суспензию на колонку и соберите поток немеченых клеток.Дважды промойте колонну одним миллилитром буфера и соберите проточный. Окрашивайте контроль эффективности истощения, разделив 200 микролитров клеток, собранных до истощения, на четыре пробирки FACS: неокрашенные, одноокрашенные CD4, одноокрашенные CD8 и дважды окрашенные CD4 и CD8. Используйте неокрашенные и одноокрашенные образцы для настройки параметров проточной цитометрии.Используйте 1000 микролитров клеток, собранных после истощения, для окрашивания на CD4 и CD8 и сравните с двойным окрашенным образцом, собранным до истощения. Чтобы культивировать тимоциты, поместите от двух до пяти раз от 10 до пятого до одного раза от 10 до шестого после истощения тимоцитов в колбу T25 с 80-90% сливающимися клетками OP9 DL4 в среде OP9, содержащей цитокины. Инкубируйте культуру при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение 24 часов на клетках OP9 DL4.Чтобы собрать ретровирус, соберите надосадочную жидкость, содержащую ретровирусы, из пересеченных клеток, наклонив шестилуночную пластину, а затем расположив шприц объемом от трех до пяти миллилитров на дне пластины, потянув за поршень для аспирации надосадочной жидкости. Отфильтруйте надосадочную жидкость ретровируса через шприцевой фильтр размером 0,45 микрометра и соберите фильтрат в 50-миллилитровую пробирку. Замените среду двумя миллилитрами свежей среды RPC и продолжайте инкубацию клеток при 37 градусах Цельсия в течение 20-24 часов для второй трансдукции.собрать тимоциты из культуры OP9 DL4 путем агрессивного пипетирования для удаления тимоцитов и клеток OP9 DL4 с поверхности колбы. Отфильтруйте клеточную суспензию через 40-микрометровый сетчатый фильтр, чтобы удалить большинство ячеек OP9 DL4 и собрать фильтрат в 50-миллилитровую пробирку. Центрифугируйте тимоциты и фильтрат при 300 г в течение пяти минут и выбросьте надосадочную жидкость.Ресуспендируют тимоциты в среде от 0,5 до одного миллилитра OP9 с цитокинами. Добавьте один-два миллилитра среды RPC, содержащей вирус. Затем добавьте гексаметрин бромид в количестве восемь микрограммов на миллилитр общей клеточной суспензии.Спинокулируйте содержимое, центрифугируя клетки при 850 G в течение одного часа при комнатной температуре. Ресуспендируют клетки в шести миллилитрах среды OP9 с цитокинами на колбу и добавляют суспензию обратно в монослой клеток OP9 DL4. Инкубировать при температуре 37 градусов Цельсия в течение ночи.Повторите этапы сбора ретровируса, используя новую лунку надосадочной жидкости, содержащей ретровирус. Сохраняйте трансдуцированные тимоциты на культуре OP9 DL4 в течение двух-пяти дней или замораживайте по мере необходимости. Эффективность истощения оценивали проточно-цитометрически путем мечения магнитно-немеченой клеточной фракции для CD4 и CD8 после иммуномагнитного разделения клеток и анализа этого на двумерном бивариантном точечном графике.Хороший выход двойных отрицательных клеток для CD4 и CD8 составляет 95% или выше, как показано здесь. При использовании векторов, экспрессирующих скрининговые маркеры, такие как ген флуоресценции, транссекция и трансдукция могут быть грубо и эмпирически оценены с помощью флуоресцентной микроскопии. Эффективность трансдукции анализировали путем забора тимоцитов из монослоя OP9 DL4.и изучение экспрессии гена флуоресценции с помощью проточной цитометрии. Эффективность трансдукции с использованием пустого ретровирусного вектора с GFP в качестве репортерного гена составила 84,2%, дифференцировка Т-клеток на клетках OP9 DL4 наблюдалась через четыре дня после трансдукции. Проточный цитометрический анализ дифференцировки клеток, индуцированной кокультурой на клетках OP9 DL4 и экспрессией трансгенов, где клетки были мечены для CD4, CD8, CD44 и CD25.Трансдукция двойных отрицательных тимоцитов с пустым ретровирусным вектором pMIG представляла примерно те же пропорции одиночных положительных, двойных положительных, двойных отрицательных и ее подстадий двойного отрицательного от одного до четырех, что и нетрансдуцированные тимоциты, что указывает на то, что на развитие Т-клеток процесс трансдукции не влиял. Самая сложная задача при попытке реплицировать этот протокол заключается в том, чтобы убедиться, что различные типы ячеек управляются одновременно скоординированным образом. Чрезмерная экспрессия онкогенов в незрелых тимоцитах иногда может влиять на нормальное развитие Т-клеток, поэтому последующее иммунофенотипирование с помощью проточной цитометрии является полезным способом узнать, в каком направлении двигаться.Онкогенный потенциал трансдуцированных Т-клеток, дифференцированных на клетках эмбрионального слоя, может быть дополнительно исследован путем инъекции мышам с ослабленным иммунитетом.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Live Imaging to Study Microtubule Dynamic Instability in Taxane-resistant Breast Cancers

Живая съемка по изучению микротрубочек динамической неустойчивости в таксанов устойчивостью рака молочной железы

Taxanes such as docetaxel belong to a group of microtubule-targeting agents (MTAs) that are commonly relied upon to treat cancer. However, taxane ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

Проточная цитометрия оценить стволовых клеток лейкемии в первичных острый миелолейкоз и пациент производные ксенотрасплантатов, диагностики и последующей вверх

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

Оценка метаболических профиля первичных лейкозных клеток

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Мезенхимальных стволовых клеток изолированно от ткани пульпы и культуры совместно с раковых клеток, чтобы изучить их взаимодействия

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

Поток Цитометрический анализ митохондриальных реактивных видов кислорода в Мурин гематопоитических стволовых и прародителей клеток и MLL-AF9 Driven лейкемии

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Subcellular Fractionation of Primary Chronic Lymphocytic Leukemia Cells to Monitor Nuclear/Cytoplasmic Protein Trafficking

Субклеточная фракция первичных клеток хронического лимфоцитарного лейкоза для мониторинга торговли ядерным/цитоплазмическим ибелением

Nuclear export of macromolecules is often deregulated in cancer cells. Tumor suppressor proteins, such as p53, can be rendered inactive due to aberrant ...

Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions

Кокультура стволовых клеток глиобластомы на узорчатых нейронах для изучения миграции и клеточных взаимодействий

Glioblastomas (GBMs), grade IV malignant gliomas, are one of the deadliest types of human cancer because of their aggressive characteristics. Despite ...

Co-culture of Glutamatergic Neurons and Pediatric High-Grade Glioma Cells Into Microfluidic Devices to Assess Electrical Interactions

Кокультура глутаматергических нейронов и педиатрических клеток глиомы высокой степени в микрофлюидные устройства для оценки электрических взаимодействий

Pediatric high-grade gliomas (pHGG) represent childhood and adolescent brain cancers that carry a rapid dismal prognosis. Since there is a need to ...

Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-Derived Xenograft Mouse Model

Оценка токсичности, ассоциированной с Т-клетками химерного антигенного рецептора, с использованием мышиной модели ксенотрансплантата пациента с острым лимфобластным лейкозом

Chimeric antigen receptor T (CART) cell therapy has emerged as a powerful tool for the treatment of multiple types of CD19+ malignancies, which has led to ...

Quantifying Telomere Length Using Non-Radioactive Chemiluminescence Detection

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay (Video) | JoVE 

Оптимизация эксплуатационных параметров анализа длины теломер TAGGG

Telomeres are repetitive sequences which are present at chromosomal ends; their shortening is a characteristic feature of human somatic cells. Shortening ...