Name: real-time quantitative measurement of tumor cell migration and invasion following synthetic mrna transfection
Uploaded: 2023-06-23T13:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Quantitative Measurement of Tumor Cell Migration and Invasion Following Synthetic mRNA Transfection at JoVE.com

يشكر المؤلفون مركز الكتابة الطبية في رحمة الأطفال في مدينة كانساس سيتي لتحرير هذه المخطوطة. تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة ناتالي A.R.T. (إلى TP) ومنحة المجلس الاستشاري لشركاء MCA من مستشفى الرحمة للأطفال (CMH) ومركز السرطان بجامعة كانساس (KUCC) (إلى TP).

1. تخليق الحمض النووي الريبوزي المرسال
ملاحظة: بالنسبة لتخليق mRNA ، يجب معالجة جميع الكواشف والمعدات بشكل خاص لتعطيل RNases قبل الاستخدام. راجع جدول المواد للحصول على تفاصيل حول جميع المواد والأدوات والكواشف المستخدمة في هذا البروتوكول.
<ol><li>خطي الحمض النووي...

<ol>
	<li>Palmer, T. D., Ashby, W. J., Lewis, J. D., Zijlstra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+tumor+cell+motility+to+prevent+metastasis.">Targeting tumor cell motility to prevent metastasis.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (8), 568-581 (2011).</li><li>Eccles, S. A., Box, C., Court, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration/invasion+assays+and+their+application+in+cancer+drug+discovery.">Cell migration/invasion assays and their application in cancer drug discovery.</a> Biotechnology Annual Review. 11, 391-421 (2005).</li><li>Kluiver, T. A., Alieva, M., van Vuurden, D. G., Wehrens, E. J., Rios, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invaders+exposed:+Understanding+and+targeting+tumor+cell+invasion+in+diffuse+intrinsic+pontine+glioma.">Invaders exposed: Understanding and targeting tumor cell invasion in diffuse intrinsic pontine glioma.</a> Frontiers in Oncology. 10, 92 (2020).</li><li>Xie, Q., Mittal, S., Berens, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+adaptive+glioblastoma:+An+overview+of+proliferation+and+invasion.">Targeting adaptive glioblastoma: An overview of proliferation and invasion.</a> Neuro-Oncology. 16 (12), 1575-1584 (2014).</li><li>Wee, Y., Wang, T., Liu, Y., Li, X., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pan-cancer+study+of+copy+number+gain+and+up-regulation+in+human+oncogenes.">A pan-cancer study of copy number gain and up-regulation in human oncogenes.</a> Life Sciences. 211, 206-214 (2018).</li><li>Zhao, M., Liu, Y., Qu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+epithelial-mesenchymal+transition-related+genes+increases+with+copy+number+in+multiple+cancer+types.">Expression of epithelial-mesenchymal transition-related genes increases with copy number in multiple cancer types.</a> Oncotarget. 7 (17), 24688-24699 (2016).</li><li>Pijuan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+cell+migration,+invasion,+and+adhesion+assays:+From+cell+imaging+to+data+analysis.">In vitro cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 107 (2019).</li><li>Park, T., Large, N., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+glioblastoma+phenotypes+in+vitro+establishes+cell+migration+as+a+robust+readout+of+Crk+and+CrkL+activity.">Quantitative assessment of glioblastoma phenotypes in vitro establishes cell migration as a robust readout of Crk and CrkL activity.</a> The Journal of Biological Chemistry. 296, 100390 (2021).</li><li>Urcan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+xCELLigence+impedance+analysis+of+the+cytotoxicity+of+dental+composite+components+on+human+gingival+fibroblasts.">Real-time xCELLigence impedance analysis of the cytotoxicity of dental composite components on human gingival fibroblasts.</a> Dental Materials. 26 (1), 51-58 (2010).</li><li>Limame, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+dynamic+cell+viability,+migration+and+invasion+assessments+by+novel+real-time+technology+and+classic+endpoint+assays.">Comparative analysis of dynamic cell viability, migration and invasion assessments by novel real-time technology and classic endpoint assays.</a> PLoS One. 7 (10), e46536 (2012).</li><li>Mudduluru, G., Large, N., Park, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impedance-based+real-time+measurement+of+cancer+cell+migration+and+invasion.">Impedance-based real-time measurement of cancer cell migration and invasion.</a> Journal of Visualized Experiments. (158), e60997 (2020).</li><li>Feller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crk+family+adaptors-signalling+complex+formation+and+biological+roles.">Crk family adaptors-signalling complex formation and biological roles.</a> Oncogene. 20 (44), 6348-6371 (2001).</li><li>Park, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crk+and+CrkL+as+therapeutic+targets+for+cancer+treatment.">Crk and CrkL as therapeutic targets for cancer treatment.</a> Cells. 10 (4), 739 (2021).</li><li>Verbeke, R., Lentacker, I., De Smedt, S. C., Dewitte, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dawn+of+mRNA+vaccines:+The+COVID-19+case.">The dawn of mRNA vaccines: The COVID-19 case.</a> Journal of Controlled Release. 333, 511-520 (2021).</li><li>Heine, A., Juranek, S., Brossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+and+immunological+effects+of+mRNA+vaccines+in+malignant+diseases.">Clinical and immunological effects of mRNA vaccines in malignant diseases.</a> Molecular Cancer. 20 (1), 52 (2021).</li><li>Kwon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+synthetic+mRNA:+In+vitro+synthesis+of+mRNA+and+its+applications+in+regenerative+medicine.">Emergence of synthetic mRNA: In vitro synthesis of mRNA and its applications in regenerative medicine.</a> Biomaterials. 156, 172-193 (2018).</li><li>Campillo-Davo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ins+and+outs+of+messenger+RNA+electroporation+for+physical+gene+delivery+in+immune+cell-based+therapy.">The ins and outs of messenger RNA electroporation for physical gene delivery in immune cell-based therapy.</a> Pharmaceutics. 13 (3), 396 (2021).</li><li>Park, T., Koptyra, M., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+requires+CT10+regulator+of+kinase+(Crk)+and+Crk-like+(CrkL).">Fibroblast growth requires CT10 regulator of kinase (Crk) and Crk-like (CrkL).</a> The Journal of Biological Chemistry. 291 (51), 26273-26290 (2016).</li><li>Park, T. J., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+roles+of+Crk+and+CrkL+in+fibroblast+structure+and+motility.">Essential roles of Crk and CrkL in fibroblast structure and motility.</a> Oncogene. 33 (43), 5121-5132 (2014).</li><li>Chou, P. P., Jaynes, P. K., King, B. P., Chapman, E., Bailey, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+comparison+between+conventional+(method-I)+and+reverse+(method-Ii)+pipetting.">Precision comparison between conventional (method-I) and reverse (method-Ii) pipetting.</a> Clinical Chemistry. 30 (6), 958 (1984).</li><li>Pushparaj, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+the+micropipetting+techniques+in+biomedical+sciences:+A+fundamental+prerequisite+in+good+laboratory+practice.">Revisiting the micropipetting techniques in biomedical sciences: A fundamental prerequisite in good laboratory practice.</a> Bioinformation. 16 (1), 8-12 (2020).</li><li>Park, T. J., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crk+and+Crk-like+play+essential+overlapping+roles+downstream+of+disabled-1+in+the+Reelin+pathway.">Crk and Crk-like play essential overlapping roles downstream of disabled-1 in the Reelin pathway.</a> The Journal of Neuroscience. 28 (50), 13551-13562 (2008).</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRK+proteins+selectively+regulate+T+cell+migration+into+inflamed+tissues.">CRK proteins selectively regulate T cell migration into inflamed tissues.</a> The Journal of Clinical Investigation. 125 (3), 1019-1032 (2015).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+adaptor+protein+Crk+is+indispensable+for+malignant+feature+of+glioblastoma+cell+line+KMG4.">Signaling adaptor protein Crk is indispensable for malignant feature of glioblastoma cell line KMG4.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 362 (4), 976-981 (2007).</li><li>Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+regulation+of+Abl+kinase+by+Crk+Y251+and+Abi1+controls+invasive+phenotypes+in+glioblastoma.">Reciprocal regulation of Abl kinase by Crk Y251 and Abi1 controls invasive phenotypes in glioblastoma.</a> Oncotarget. 6 (35), 37792-37807 (2015).</li><li>Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crk+tyrosine+phosphorylation+regulates+PDGF-BB-inducible+Src+activation+and+breast+tumorigenicity+and+metastasis.">Crk tyrosine phosphorylation regulates PDGF-BB-inducible Src activation and breast tumorigenicity and metastasis.</a> Molecular Cancer Research. 16 (1), 173-183 (2018).</li><li>Raudenska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engine+shutdown:+Migrastatic+strategies+and+prevention+of+metastases.">Engine shutdown: Migrastatic strategies and prevention of metastases.</a> Trends in Cancer. 9 (4), 293-308 (2023).</li><li>Decaestecker, C., Debeir, O., Van Ham, P., Kiss, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+anti-migratory+drugs+be+screened+in+vitro?+A+review+of+2D+and+3D+assays+for+the+quantitative+analysis+of+cell+migration.">Can anti-migratory drugs be screened in vitro? A review of 2D and 3D assays for the quantitative analysis of cell migration.</a> Medicinal Research Reviews. 27 (2), 149-176 (2007).</li><li>Farasani, A., Darbre, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+exposure+to+triclosan+increases+migration+and+invasion+of+human+breast+epithelial+cells+in+vitro.">Long-term exposure to triclosan increases migration and invasion of human breast epithelial cells in vitro.</a> Journal of Applied Toxicology. 41 (7), 1115-1126 (2021).</li><li>Hanusova, V., Skalova, L., Kralova, V., Matouskova, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+flubendazole+on+adhesion+and+migration+in+SW480+and+SW620+colon+cancer+cells.">The effect of flubendazole on adhesion and migration in SW480 and SW620 colon cancer cells.</a> Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 18 (6), 837-846 (2018).</li><li>Lago-Baameiro, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PARK7/DJ-1+inhibition+decreases+invasion+and+proliferation+of+uveal+melanoma+cells.">PARK7/DJ-1 inhibition decreases invasion and proliferation of uveal melanoma cells.</a> Tumori. 109 (1), 47-53 (2023).</li><li>Escalona, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knock+down+of+TIMP-2+by+siRNA+and+CRISPR/Cas9+mediates+diverse+cellular+reprogramming+of+metastasis+and+chemosensitivity+in+ovarian+cancer.">Knock down of TIMP-2 by siRNA and CRISPR/Cas9 mediates diverse cellular reprogramming of metastasis and chemosensitivity in ovarian cancer.</a> Cancer Cell International. 22 (1), 422 (2022).</li><li>Mosca, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+S-adenosyl-L-methionine+on+the+invasion+and+migration+of+head+and+neck+squamous+cancer+cells+and+analysis+of+the+underlying+mechanisms.">Effects of S-adenosyl-L-methionine on the invasion and migration of head and neck squamous cancer cells and analysis of the underlying mechanisms.</a> International Journal of Oncology. 56 (5), 1212-1224 (2020).</li><li>Zhao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGI174+protein+and+its+functional+domain+peptides+exert+antitumour+effects+on+renal+cell+carcinoma.">VEGI174 protein and its functional domain peptides exert antitumour effects on renal cell carcinoma.</a> International Journal of Oncology. 54 (1), 390-398 (2019).</li><li>Witte, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta1-induced+cell+migration+in+pancreatic+carcinoma+cells+is+RAC1+and+NOX4-dependent+and+requires+RAC1+and+NOX4-dependent+activation+of+p38+MAPK.">TGF-beta1-induced cell migration in pancreatic carcinoma cells is RAC1 and NOX4-dependent and requires RAC1 and NOX4-dependent activation of p38 MAPK.</a> Oncology Reports. 38 (6), 3693-3701 (2017).</li><li>Bui, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+aquaporin+3+expression+by+the+AhR+pathway+is+critical+to+cell+migration.">Regulation of aquaporin 3 expression by the AhR pathway is critical to cell migration.</a> Toxicological Sciences. 149 (1), 158-166 (2016).</li><li>Tsuji, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+different+cell-detaching+methods+on+the+viability+and+cell+surface+antigen+expression+of+synovial+mesenchymal+stem+cells.">Effects of different cell-detaching methods on the viability and cell surface antigen expression of synovial mesenchymal stem cells.</a> Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).</li><li>Frandsen, S. K., McNeil, A. K., Novak, I., McNeil, P. L., Gehl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Difference+in+membrane+repair+capacity+between+cancer+cell+lines+and+a+normal+cell+line.">Difference in membrane repair capacity between cancer cell lines and a normal cell line.</a> The Journal of Membrane Biology. 249 (4), 569-576 (2016).</li></ol>

الهجرة والغزو هي سمات مهمة للخلايا السرطانية. يوفر قياس حركة الخلايا السرطانية وفهم الآلية الأساسية التي تتحكم في حركة الخلايا السرطانية رؤى مهمة في التدخلات العلاجية 2,27. تم تطوير عدة طرق لدراسة هجرة الخلايا7. يعد فحص التئام الجروح باستخدام ال...

تلعب حركية الخلايا السرطانية دورا مهما في ورم خبيث 1,2. إن انتشار الخلايا السرطانية إلى الأنسجة السليمة المجاورة والبعيدة يجعل علاج السرطان صعبا ويساهم في تكرار 3,4. لذلك ، من الضروري فهم آليات حركة الخلايا السرطانية وتطوير الاستراتيجيات العلاجية ذات الصلة. نظرا لأن العديد من الخلايا السرطانية قد غيرت ملامح التعبير الجيني ، فمن الأهمية بمكان فهم التغييرات في ملف تعريف التعبير الجيني التي تؤدي إلى تغيير حركة الخلايا السرطانية 5,6.
تم تطوير العديد من المقايسات لقياس هجرة الخلايا في المختبر. توفر بعض المقايسات معلومات محدودة فقط بسبب السماح فقط بالقياسات في نقاط زمنية محددة ، بينما يقدم البعض الآخر معلومات شاملة عن حركة الخلايا السرطانية في الوقت الفعلي7. على الرغم من أن العديد من فحوصات حركية الخلايا هذه يمكن أن توفر نتائج كمية في وقت معين أو نقطة النهاية ، إلا أنها تفشل في توفير معلومات مفصلة بما فيه الكفاية عن التغيرات الديناميكية في معدل هجرة الخلايا خلال الفترة التجريبية. بالإضافة إلى ذلك ، قد يكون من الصعب فحص التغييرات المحتملة في معدل هجرة الخلايا اعتمادا على التصميم التجريبي وأنواع الخلايا وأرقام الخلايا. علاوة على ذلك ، يمكن التحقيق في آثار العلاجات غير المعقدة من خلال القياس الكمي البسيط لمقايسات الحركة التقليدية ، ولكن قد تكون هناك حاجة إلى تقدير كمي أكثر تعقيدا لدراسة التأثيرات المعقدة لمختلف العلاجات المشتركة8.
تم تطوير أداة لمراقبة التيار الكهربائي لقاع بئر لوحة العيار الدقيق المغطى بأقطاب كهربائية دقيقة9. يعيق التصاق الخلايا بسطح البئر تدفق الإلكترون ، وترتبط المعاوقة بالارتباط الكمي والنوعي للخلايا. يسمح وجود الأقطاب الكهربائية الدقيقة في قاع البئر بقياس التصاق الخلايا وانتشارها وتكاثرها. يسمح وجود الأقطاب الكهربائية الدقيقة تحت غشاء صغير يسهل اختراقه في الغرفة العلوية بقياس هجرة الخلايا وغزوها إلى الغرفة السفلية ، مع طلاء الغرفة العلوية ببروتينات مصفوفة خارج الخلية (ECM) للسماح بالغزو10.
في السابق ، ثبت أن القياسات في الوقت الفعلي القائمة على المعاوقة لهجرة الخلايا السرطانية وغزوها توفر بيانات في الوقت الفعلي خلال التجربة بأكملها ، بالإضافة إلى مقارنات وتقديرات فورية في ظل ظروف تجريبية مختلفة11. في ورقة الطريقة هذه ، تم حث ضربة قاضية للجينات لاختبار دور البروتينات ذات الأهمية في هجرة الخلايا السرطانية وغزوها. نظرا لأن تأثير ضربة قاضية للجين الكامل في ظل الظروف التجريبية المختبرة استغرق 3-4 أيام بعد التثقيب الكهربائي باستخدام الحمض النووي الريبي الصغير المتداخل (siRNAs) 8 ، فقد تم إعادة طلاء الخلايا بعد التثقيب الكهربائي وإعادة حصادها بعد 3 أيام للقياس في الوقت الفعلي القائم على المعاوقة لهجرة الخلايا السرطانية وغزوها.
منظم CT10 للكيناز (Crk) و Crk-like (CrkL) عبارة عن بروتينات محول تتوسط تفاعلات البروتين والبروتين في اتجاه مجرى مسارات كيناز مستقبلات عامل النمو المختلفة ومسارات التيروزين كيناز غير المستقبلة12. تساهم المستويات المرتفعة من بروتينات Crk و CrkL في سوء التشخيص في العديد من أنواع السرطان البشرية ، بما في ذلك الورم الأرومي الدبقي13. ومع ذلك ، فمن غير الواضح كيف تؤدي بروتينات Crk و CrkL المرتفعة إلى سوء التشخيص. لذلك ، من المهم تحديد تأثير التعبير المفرط ل Crk و CrkL على وظائف الخلايا السرطانية. في السابق ، تم إجراء دراسة ضربة قاضية للجينات لإثبات أن المستويات الداخلية لبروتينات Crk و CrkL مطلوبة لهجرة خلايا الورم الأرومي الدبقي وغزوها8. هنا ، تم تطوير نظام فحص معدل لمعالجة تأثير التعبير المفرط ل Crk و CrkL على هجرة الخلايا السرطانية وغزوها.
في الآونة الأخيرة ، جذب التوليف في المختبر ل mRNA وتطبيقاته العلاجية اهتماما متجددا بسبب تطوير لقاحات mRNA ضد SARS-CoV-2 (استعرضه Verbeke et al.14). بالإضافة إلى ذلك ، تم إحراز تقدم ملحوظ في استخدام mRNA الاصطناعية في السرطان وأمراض أخرى15,16. يعد التثقيب الكهربائي للخلايا طريقة فعالة لتوصيل mRNA الاصطناعي والحث على التعديل الجيني العابر (تمت مراجعته بواسطة Campillo-Davo et al.17) ، ويتيح استخدام mRNA الاصطناعي التعبير الجيني السريع والفعال في الخلايا الليفية الخالدة 18. تجمع ورقة الطريقة هذه بين الإفراط في التعبير الجيني باستخدام mRNA الاصطناعي مع تحليلات الخلايا في الوقت الفعلي لدراسة هجرة الخلايا السرطانية وغزوها. ومع ذلك ، فإن المخطط التجريبي المستخدم في siRNAs لا يعمل مع نقل mRNA الاصطناعي ، حيث يزداد مستوى البروتينات الخارجية بسرعة وينخفض تدريجيا عند نقل mRNA الاصطناعي18. لذلك ، تم تعديل الطريقة لإجراء تحليل في الوقت الفعلي لهجرة الخلايا وغزوها مباشرة بعد النقل دون زراعة الخلايا بشكل إضافي.
توضح ورقة الطريقة هذه أن الجمع بين القياسات في الوقت الفعلي القائمة على المعاوقة مع نقل الخلايا السرطانية باستخدام mRNAs الاصطناعية يوفر تحليلا سريعا وشاملا لآثار تنظيم الجينات على هجرة الخلايا السرطانية وغزوها. تصف ورقة الطريقة هذه الإجراءات التفصيلية لقياس كيفية تأثر هجرة وغزو خلايا الورم الأرومي الدبقي بالتعبير المفرط عن Crk و CrkL. من خلال فحص التأثيرات المعتمدة على التركيز ل mRNA الاصطناعية على هجرة الخلايا السرطانية ، تصف الورقة بوضوح كيف أن الزيادة في مستويات البروتين تحفز هجرة الخلايا السرطانية. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تقديم نهج لتغيير تركيز هلام ECM لتقييم آثار التغيرات في التعبير الجيني على غزو الخلايا السرطانية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AlphaImager HP</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>92-13823-00</td>
			<td>Agarose gel imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-Tubulin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9026</td>
			<td>Used to detect &#945;-tubulin protein (dilution 1:3,000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CIM-plate 16</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc</td>
			<td>5665825001</td>
			<td>Cell invasion and migration plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crk antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610035</td>
			<td>Used to detect CrkI and CrkII proteins (dilution 1:1,500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CrkL antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-319</td>
			<td>Used to detect CrkL protein (dilution 1:1,500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>302002</td>
			<td>Cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td>Buffer used to wash cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30910.03</td>
			<td>Culture medium supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell VIOS 160i CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51030285</td>
			<td>CO2 incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW goat anti-mouse IgG secondary antibody</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td>926-32210</td>
			<td>Secondary antibody for Western blot analysis (dilution 1:10,000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW goat anti-rabbit IgG secondary antibody</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td>926-32211</td>
			<td>Secondary antibody for Western blot analysis&#160; (dilution 1:10,000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium chloride&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9480</td>
			<td>Used for RNA precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Extracellular matrix (ECM) gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAscript T7 transcription kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1334</td>
			<td>Used for RNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millennium RNA markers</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM7150</td>
			<td>Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini centrifuge</td>
			<td>ISC BioExpress</td>
			<td>C1301P-ISC</td>
			<td>Used to spin down cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse brain QUICK-Clone cDNA</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>637301</td>
			<td>Source of genes (inserts) for cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoQuant</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>M200PRO</td>
			<td>Nucleic acid quantification system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon electroporation system&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK5000</td>
			<td>Electroporation system1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon transfection system 10 &#181;L kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK1025</td>
			<td>Electroporation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon transfection system 100 &#181;L kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK10096</td>
			<td>Electroporation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NorthernMax denaturing gel buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM8676</td>
			<td>Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NorthernMax formaldehyde load dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM8552</td>
			<td>Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NorthernMax running buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM8671</td>
			<td>Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>W3331</td>
			<td>Used for various reactions during mRNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey CLx Imager</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td></td>
			<td>Imager for Western blot analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3.1/myc-His</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>V80020</td>
			<td>The vector into which inserts (mouse CrkI and CrkL cDNAs) were cloned</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFLAG-CMV-5a</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>E7523</td>
			<td>Source of the FLAG epitope tag</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:chloroform:isoamyl alcohol&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2069</td>
			<td>Used for DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PmeI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0560L</td>
			<td>Used to linearize the plasmids for mRNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(A) tailing kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1350</td>
			<td>Used for poly(A) tail reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene tissue culture dish (100 x 20 mm style)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353003</td>
			<td>Used for culturing cells before transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene tissue culture dish (35 x 10 mm style)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353001</td>
			<td>Used for culturing transfected cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25530049</td>
			<td>Used to remove protein in the reaction mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purifier Axiom Class II, Type C1</td>
			<td>Labconco Corporation</td>
			<td>304410001</td>
			<td>Biosafety cabinet for sterile handling of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resuspension Buffer R</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>A buffer included in the electroporation kits, MPK1025 and MPK10096. The buffer is used to resupend cells before electroporation, and its composition is proprietary information.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9780</td>
			<td>RNA decontamination solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scepter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>C85360</td>
			<td>Handheld automated cell counter&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ScriptCap 2&#39;-O-methyltransferase kit</td>
			<td>Cellscript</td>
			<td>C-SCMT0625</td>
			<td>Used for capping reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ScriptCap m7G capping system</td>
			<td>Cellscript</td>
			<td>C-SCCE0625</td>
			<td>Used for capping reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15553-035</td>
			<td>Detergent used for the proteinase K reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend XT centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75004532</td>
			<td>Benchtop centrifuge to spin down cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>Used for dissociation of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-118MG&#160;</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB15</td>
			<td>An adherent cell line derived from a human glioblastoma patient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinculin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V9131</td>
			<td>Used to detect vinculin protein (dilution 1:100,000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xCELLigence RTCA DP</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc</td>
			<td>380601050</td>
			<td>Instrument used for real-time cell analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1Electroporation parameters and other related information for various cell lines are available on the manufacturer&#39;s homepage (https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-culture/transfection/neon-transfection-system/neon-transfection-system-cell-line-data.html?).</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time quantitative measurement of tumor cell migration and invasion following synthetic mrna transfection

الخلايا السرطانية شديدة الحركة والغازية وتظهر أنماط التعبير الجيني المتغيرة. إن معرفة كيفية تنظيم التغيرات في التعبير الجيني لهجرة الخلايا السرطانية وغزوها أمر ضروري لفهم آليات تسلل الخلايا السرطانية إلى الأنسجة السليمة المجاورة وورم خبيث. في السابق ، ثبت أن ضربة قاضية للجينات متبوعة بالقياس في الوقت الفعلي القائم على المعاوقة لهجرة الخلايا السرطانية وغزوها تمكن من تحديد الجينات المطلوبة لهجرة الخلايا السرطانية وغزوها. في الآونة الأخيرة ، زادت لقاحات mRNA ضد SARS-CoV-2 من الاهتمام باستخدام mRNA الاصطناعي لأغراض علاجية. هنا ، تمت مراجعة الطريقة التي تستخدم mRNA الاصطناعية لدراسة تأثير الإفراط في التعبير الجيني على هجرة الخلايا السرطانية وغزوها. توضح هذه الدراسة أن التعبير الجيني المرتفع مع نقل mRNA الاصطناعي متبوعا بالقياس في الوقت الفعلي القائم على المعاوقة قد يساعد في تحديد الجينات التي تحفز هجرة الخلايا السرطانية وغزوها. تقدم ورقة الطريقة هذه تفاصيل مهمة حول إجراءات فحص تأثير التعبير الجيني المتغير على هجرة الخلايا السرطانية وغزوها.

تلعب بروتينات Crk و CrkL أدوارا مهمة في حركة العديد من أنواع الخلايا ، بما في ذلك الخلايا العصبية22 والخلايا التائية23 والخلايا الليفية 18,19 ومجموعة متنوعة من الخلايا السرطانية 13. منذ أن تم الإبلاغ عن ارتفاع بروتينات Crk و CrkL ?...

Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Quantitative Measurement of Tumor Cell Migration and Invasion Following Synthetic mRNA Transfection at JoVE.com

Real-Time Quantitative Measurement of Tumor Cell Migration and Invasion Following Synthetic mRNA Transfection

تحفز العديد من الجينات غير المنظمة هجرة الخلايا السرطانية وغزوها ، مما يؤدي إلى سوء التشخيص. يعد تحديد الجينات التي تنظم هجرة الخلايا السرطانية وغزوها أمرا بالغ الأهمية. يقدم هذا البروتوكول طريقة للتحقيق في آثار زيادة التعبير عن الجين على هجرة وغزو الخلايا السرطانية في الوقت الفعلي.

القياس الكمي في الوقت الحقيقي لهجرة الخلايا السرطانية وغزوها بعد نقل mRNA الاصطناعي

Tumor cells are highly motile and invasive and display altered gene expression patterns. Knowledge of how changes in gene expression regulate tumor cell ...

يوضح هذا البروتوكول أن الجمع بين معاملة الحمض النووي الريبي الرسول للإحساس مع القياسات في الوقت الفعلي القائمة على المعاوقة لهجرة الخلايا وغزوها يسهل تحديد الجينات التي تحفز هجرة الخلايا السرطانية وغزوها. يتيح نظام تحليل الخلايا في الوقت الفعلي القائم على المعاوقة المراقبة الكمية والمستمرة والشاملة لهجرة الخلايا السرطانية عند تغيرات التعبير الجيني. يمكن تحديد الجينات التي تفرط في التعبير عن الأورام وتحفز هجرة الخلايا السرطانية كهدف محتمل لمنع ورم خبيث في علاج السرطان.للبدء ، أضف 10 ميكرولتر من محلول تفاعل 10x ، و 1.5 ميكرولتر من PNE واحد ، و 10 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد إلى أنبوب طرد مركزي دقيق لخطية الحمض النووي للبلازميد مع إنزيم القطع. أضف الماء الخالي من النيوكلياز ليصل حجم التفاعل إلى 100 ميكرولتر. امزجه عن طريق النقر عليه وتدويره لأسفل قبل احتضان خليط التفاعل عند 37 درجة سلزية طوال الليل.مرة أخرى ، قم بتدويره وأضف خمسة ميكرولترات من 10٪ SDS ، وميكرولتر واحد من 20 ملليغرام لكل ملليلتر من بروتين درجة RNA K إلى خليط التفاعل قبل خلطه وتدويره لأسفل. بعد 30 دقيقة من الحضانة عند 50 درجة مئوية ، أضف ميكرولتر لكل منهما 10x من المخزن المؤقت للنسخ ، و ATP ، و GTP ، و UTP ، و CTP ، و T7 ، وميكروغرام واحد من الحمض النووي الخطي إلى أنبوب طرد مركزي دقيق لتخليق الحمض النووي الريبي بوساطة بوليميراز الحمض النووي الريبي T7. أضف الماء الخالي من النيوكلياز ليصل حجم التفاعل إلى 20 ميكرولتر.بعد الدوران لأسفل ، احتضان خليط التفاعل عند 37 درجة سلزية لمدة ساعتين لتخليق الحمض النووي الريبي. بعد ذلك ، قم بتدويره وأضف ميكرولترا واحدا من الحمض النووي وانقر قبل 15 دقيقة من الحضانة عند 37 درجة مئوية لإزالة قالب الحمض النووي. ابدأ ترسيب كلوريد الليثيوم للحمض النووي الريبوزي بإضافة 10 ميكرولترات من 7.5 مولار كلوريد الليثيوم إلى خليط التفاعل.بعد النقر والدوران لأسفل ، احتضان خليط التفاعل عند 20 درجة مئوية تحت الصفر لمدة 30 دقيقة. لتغطية الحرارة ، قم بتسخين عينة الحمض النووي الريبي عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ثم ضعها على الجليد للتبريد. بعد ذلك ، أضف مكونات تفاعل السد واخلطها عن طريق النقر.أدر الخليط واحتضانه عند 37 درجة سلزية لمدة ساعة واحدة. بالنسبة لمخلفات poly-A ، قم بتدوير العينة لأسفل وأضف مكونات تفاعل المخلفات poly-A. ثم اضغط على خليط التفاعل ثم أدره لأسفل واحتضنه عند 37 درجة سلزية لمدة ساعتين.لترسيب كلوريد الليثيوم والقياس الكمي للحمض النووي الريبوزي المرسال الاصطناعي ، أضف 50 ميكرولترا من 7.5 مولار كلوريد الليثيوم وقم بإجراء ترسيب كلوريد الليثيوم. قم بإزالة حصة من مخزون جل ECM من الفريزر واحتفظ بها على الجليد. قم بتخفيف 10 ملليغرام لكل لتر من جل ECM إلى تركيز العمل عن طريق خلط 990 ميكرولتر من DMEM مع 10 ميكرولتر من هلام ECM في أنبوب طرد مركزي صغير.تخلط عن طريق ماصة لطيفة. أضف 60 ميكرولترا من جل ECM المخفف إلى كل بئر من الآبار ال 16 في الغرفة العلوية للوحة CIM. ضع الحجرة العلوية للوحة CIM مع غطاء اللوحة على ورقة بلاستيكية واقية داخل حاضنة ثاني أكسيد الكربون لمدة أربع ساعات تقريبا لتشكيل طبقة هلام.للتثقيب الكهربائي ، أضف ملليلتر واحد من DPBS إلى تعليق الخلايا السرطانية في كل أنبوب. اضغط على تعليق الخلية وقم بتدويره لأسفل ثلاث مرات لمدة 10 ثوان. قم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة صغيرة.أضف 110 ميكرولتر من المخزن المؤقت لإعادة التعليق R إلى حبيبات الخلية للحصول على 0.1 مليون خلية في 10 ميكرولتر. أضف mRNA الاصطناعي إلى حبيبات الخلية للحصول على تركيز 0.2 إلى 20 نانوجرام لكل ميكرولتر اعتمادا على مستوى التعبير المطلوب. امزج وأعد تعليق حبيبات الخلية برفق عن طريق النقر.بعد ذلك ، قم بالكهرباء 10 ميكرولتر من تعليق الخلية بنظام التثقيب الكهربائي عند 1،350 فولت لمدة 10 مللي ثانية مع ثلاث نبضات في كل مرة. بمجرد الانتهاء من ذلك ، قم بنقل الخلايا الكهربائية إلى أنبوب طرد مركزي صغير جديد يحتوي على 1.1 ملليلتر من DMEM يحتوي على 0.5٪ FBS. افتح برنامج التحليل بالنقر المزدوج على أيقونة برنامج تحليل الخلايا في الوقت الفعلي.بعد فتح خيار إعداد نمط التجربة التلقائي، حدد خيار تشغيل ثلاث تجارب بشكل منفصل. افتح كل مهد بالنقر فوق علامة تبويب الرقم. بعد ذلك، انقر على علامة التبويب ملاحظات التجربة.حدد المجلد واحفظ البيانات عن طريق إدخال اسم التجربة. انقر فوق علامة تبويب التخطيط وحدد أربعة آبار في وقت واحد لإعداد الآبار الرباعية المكررة لكل حالة معالجة. أدخل معلومات العينة وانقر على تطبيق.انقر فوق علامة التبويب الجدول الزمني ، ثم أضف خطوة لإعداد وضع الخطوتين لقياسات مقاومة الخلية. ثم انقر فوق تطبيق لإعداد الخطوة الأولى. انقر فوق إضافة خطوة مرة أخرى وأدخل 10 دقائق للفاصل الزمني و 48 ساعة لمدة الهجرة والغزو.ثم ، انقر فوق تطبيق لإعداد الخطوة الثانية. قبل ساعة واحدة من قياس مقاومة الخلية ، أضف 160 ميكرولترا من DMEM تحتوي على مصل 10٪ أو جاذبات كيميائية أخرى إلى آبار الغرفة السفلية للوحة CIM. قم بتجميع الغرفة العلوية التي تحتوي على الآبار المطلية بهلام ECM للغزو أو الآبار غير المطلية للهجرة مع الغرفة السفلية.لفحص هجرة الخلايا ، أضف 50 ميكرولترا من وسط المصل المنخفض إلى آبار الغرفة العلوية للوحة CIM. ضع لوحة CIM ومهد النظام في حاضنة CO2. انقر فوق علامة تبويب الرسالة.بمجرد أن يكون الاتصال على ما يرام ، يتم عرض الرسالة ، تكون لوحة CIM جاهزة للتجربة. احتضان لوحة CIM المجمعة مسبقا في حاضنة ثاني أكسيد الكربون لمدة 30 إلى 60 دقيقة قبل تحليل الخلية في الوقت الفعلي لتأقلم لوحة CIM مع حالة الثقافة. لقراءة خط الأساس ، انقر فوق زر البدء لكل مهد.عند ظهور نافذة حفظ باسم، احفظ الملف التجريبي لتنفيذ القراءة الأساسية. بالنسبة لمقاعد الخلايا ، قم بإزالة لوحة CIM من المهد وضعها في خزانة السلامة البيولوجية على حامل اللوحة. ثم أضف 100 ميكرولتر من الخلايا الكهربائية التي تحتوي على 100،000 خلية إلى آبار الغرفة العلوية للوحة CIM ، واترك لوحة CIM تحت خزانة السلامة الحيوية لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.قم بقياس مقاومة الخلية عن طريق تحريك لوحة CIM المجمعة بالكامل إلى المهد المعني. ابدأ قياس مقاومة الخلية للخطوة الثانية بالنقر فوق زر بدء المهد وفي علامة تبويب الرسم. ثم انقر فوق الزر "إضافة الكل" وحدد مربعات المتوسط والانحراف المعياري لتصور البيانات في الوقت الفعلي.أدى التثقيب الكهربائي لخلايا الورم الأرومي الدبقي U 118 mg بتركيزات متفاوتة من الكراك الاصطناعي mRNA واحد إلى زيادة تعتمد على التركيز في بروتين الكراك الموسوم بعلامة واحد بعد يوم واحد من النقل. أدى 0.2 واثنين نانوجرام لكل ميكرولتر mRNA إلى تعبير غير قابل للكشف أو متواضع عن بروتين الكراك الخارجي واحد. أدى 20 نانوجرام لكل ميكرولتر mRNA إلى مستوى تعبير أعلى من بروتين الكراك الداخلي واحد.أشار فحص هجرة الخلايا إلى أن التثقيب الكهربائي كان 0.2 أو نانوجرام لكل ميكرولتر صدع واحد mRNA لم يؤثر بشكل كبير على هجرة الخلايا. ومع ذلك ، أدى التثقيب الكهربائي مع 20 نانوجرام لكل ميكرولتر من الحمض النووي الريبوزي المرسال إلى تحفيز واضح لهجرة الخلايا مع هجرة المزيد من الخلايا بين ساعتين و 13 ساعة مما يكشف أن هجرة خلايا الورم الأرومي الدبقي قد حفزتها الزيادة في مستوى بروتين الكراك واحد. أدى التثقيب الكهربائي باستخدام الكراك الصناعي L mRNA إلى تعبير قوي عن بروتين الكراك L الموسوم بالعلم بعد يوم واحد من النقل.تباطأ غزو الخلايا الضابطة مع زيادة تركيز بروتين ECM. أظهر الكراك L فوق الخلايا المعبرة انخفاضا يعتمد على تركيز هلام ECM في غزو الخلايا. أشارت المقارنة بين التحكم والكراك L على خلايا التعبير بتركيزات مختلفة من هلام ECM إلى أن الإفراط في التعبير عن الكراك L يحفز بشكل عام غزو الخلايا من خلال طبقة هلام ECM.أشارت النتائج أيضا إلى أن مجموعتي الخلايا تأثرتا بشكل مختلف بزيادة تركيز هلام ECM في نقاط زمنية مختلفة. يجب إعادة تعليق الخلايا بسرعة ورفق وبشكل كامل في التثقيب الكهربائي للأشخاص في الفقاعة R المعاد تعليقها لأن الحضانة الطويلة للخلايا في الفقاعة R المعاد تعليقها تجعل الخلايا غير صحية. يمكن عزل الخلايا السرطانية المهاجرة السريعة والبطيئة لتوصيف الاختلافات بين مجموعتي الخلايا.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Evaluation of the Cell Invasion and Migration Process: A Comparison of the Video Microscope-based Scratch Wound Assay and the Boyden Chamber Assay

تقييم عملية الهجرة وغزو الخلية: مقارنة من الصفر فيديو المستندة إلى مجهر الجرح المقايسة والمقايسة الدائرة Boyden

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration ...

Serum and Plasma Copy Number Detection Using Real-time PCR

مصل وبلازما نسخة الكشف رقم PCR الوقت الحقيقي باستخدام

Serum and plasma cell free DNA (cfDNA) has been shown as an informative, non-invasive source of biomarkers for cancer diagnosis, prognosis, monitoring, ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

فحوصات التصوير خلية يعيش بدراسة الدماغ جليوبلاستوما ورم الخلايا الجذعية الهجرة والغزو

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

الكشف عن الوقت الحقيقي في المختبر ورم الخلايا المبرمج الناجمة عن CD8+ تي الخلايا لدراسة وظائف المناعة القمعية من التسلل إلى ورم الخلايا النقوي

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager

سير عمل بسيطة هجرة/غزو تصوير خلية يعيش الآلي باستخدام

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great ...

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

بالبالكامل الإنسان القائم علي الورم مصفوفة في ثلاثه الابعاد كروي الغزو الفحص

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...

Real-Time Monitoring of Human Glioma Cell Migration on Dorsal Root Ganglion Axon-Oligodendrocyte Co-Cultures

في الوقت الحقيقي رصد الهجرة الخلية البشرية الورم علي العقدة الجذر الظهرية اكسون-اوليغوداندورونسيتي الثقافات المشتركة

Glioblastoma is one of the most aggressive human cancers due to extensive cellular heterogeneity and the migration properties of hGCs. In order to better ...

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

توصيف آثار مثبطات Migrastatic على غزو الورم 3D Spheroid من قبل عالية الدقة المجهرية البؤرية

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

Impedance-based Real-time Measurement of Cancer Cell Migration and Invasion

المعاوقة القائمة على قياس في الوقت الحقيقي من هجرة الخلايا السرطانية والغزو

Cancer arises due to uncontrolled proliferation of cells initiated by genetic instability, mutations, and environmental and other stress factors. These ...

Measuring Real-time Drug Response in Organotypic Tumor Tissue Slices

قياس الاستجابة للمخدرات في الوقت الحقيقي في شرائح أنسجة الورم Organotypic

Tumor tissues are composed of cancerous cells, infiltrated immune cells, endothelial cells, fibroblasts, and extracellular matrix. This complex milieu ...