Name: real-time quantitative measurement of tumor cell migration and invasion following synthetic mrna transfection
Uploaded: 2023-06-23T13:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Quantitative Measurement of Tumor Cell Migration and Invasion Following Synthetic mRNA Transfection at JoVE.com

Forfatterne takker Medical Writing Center ved Children's Mercy Kansas City for at redigere dette manuskript. Dette arbejde blev støttet af Natalies A.R.T. Foundation (til T.P.) og af et MCA Partners Advisory Board-tilskud fra Children's Mercy Hospital (CMH) og University of Kansas Cancer Center (KUCC) (til T.P.).

1. Syntese af mRNA
BEMÆRK: Til mRNA-syntesen skal alle reagenser og udstyr behandles specielt for at inaktivere RNaserne før brug. Se materialefortegnelsen for detaljer om alle de materialer, instrumenter og reagenser, der anvendes i denne protokol.
<ol><li>Linearisering af DNA BEMÆRK: Mus-cDNA'er fra CrkI og CrkL blev klonet ind i pFLAG-CMV-5a-ekspressionsvektoren for at tilføje FLAG-epitopmærket ved C-terminalen og subklonet i pcDNA3.1/myc...

<ol>
	<li>Palmer, T. D., Ashby, W. J., Lewis, J. D., Zijlstra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+tumor+cell+motility+to+prevent+metastasis.">Targeting tumor cell motility to prevent metastasis.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (8), 568-581 (2011).</li><li>Eccles, S. A., Box, C., Court, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration/invasion+assays+and+their+application+in+cancer+drug+discovery.">Cell migration/invasion assays and their application in cancer drug discovery.</a> Biotechnology Annual Review. 11, 391-421 (2005).</li><li>Kluiver, T. A., Alieva, M., van Vuurden, D. G., Wehrens, E. J., Rios, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invaders+exposed:+Understanding+and+targeting+tumor+cell+invasion+in+diffuse+intrinsic+pontine+glioma.">Invaders exposed: Understanding and targeting tumor cell invasion in diffuse intrinsic pontine glioma.</a> Frontiers in Oncology. 10, 92 (2020).</li><li>Xie, Q., Mittal, S., Berens, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+adaptive+glioblastoma:+An+overview+of+proliferation+and+invasion.">Targeting adaptive glioblastoma: An overview of proliferation and invasion.</a> Neuro-Oncology. 16 (12), 1575-1584 (2014).</li><li>Wee, Y., Wang, T., Liu, Y., Li, X., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pan-cancer+study+of+copy+number+gain+and+up-regulation+in+human+oncogenes.">A pan-cancer study of copy number gain and up-regulation in human oncogenes.</a> Life Sciences. 211, 206-214 (2018).</li><li>Zhao, M., Liu, Y., Qu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+epithelial-mesenchymal+transition-related+genes+increases+with+copy+number+in+multiple+cancer+types.">Expression of epithelial-mesenchymal transition-related genes increases with copy number in multiple cancer types.</a> Oncotarget. 7 (17), 24688-24699 (2016).</li><li>Pijuan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+cell+migration,+invasion,+and+adhesion+assays:+From+cell+imaging+to+data+analysis.">In vitro cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 107 (2019).</li><li>Park, T., Large, N., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+glioblastoma+phenotypes+in+vitro+establishes+cell+migration+as+a+robust+readout+of+Crk+and+CrkL+activity.">Quantitative assessment of glioblastoma phenotypes in vitro establishes cell migration as a robust readout of Crk and CrkL activity.</a> The Journal of Biological Chemistry. 296, 100390 (2021).</li><li>Urcan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+xCELLigence+impedance+analysis+of+the+cytotoxicity+of+dental+composite+components+on+human+gingival+fibroblasts.">Real-time xCELLigence impedance analysis of the cytotoxicity of dental composite components on human gingival fibroblasts.</a> Dental Materials. 26 (1), 51-58 (2010).</li><li>Limame, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+dynamic+cell+viability,+migration+and+invasion+assessments+by+novel+real-time+technology+and+classic+endpoint+assays.">Comparative analysis of dynamic cell viability, migration and invasion assessments by novel real-time technology and classic endpoint assays.</a> PLoS One. 7 (10), e46536 (2012).</li><li>Mudduluru, G., Large, N., Park, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impedance-based+real-time+measurement+of+cancer+cell+migration+and+invasion.">Impedance-based real-time measurement of cancer cell migration and invasion.</a> Journal of Visualized Experiments. (158), e60997 (2020).</li><li>Feller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crk+family+adaptors-signalling+complex+formation+and+biological+roles.">Crk family adaptors-signalling complex formation and biological roles.</a> Oncogene. 20 (44), 6348-6371 (2001).</li><li>Park, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crk+and+CrkL+as+therapeutic+targets+for+cancer+treatment.">Crk and CrkL as therapeutic targets for cancer treatment.</a> Cells. 10 (4), 739 (2021).</li><li>Verbeke, R., Lentacker, I., De Smedt, S. C., Dewitte, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dawn+of+mRNA+vaccines:+The+COVID-19+case.">The dawn of mRNA vaccines: The COVID-19 case.</a> Journal of Controlled Release. 333, 511-520 (2021).</li><li>Heine, A., Juranek, S., Brossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+and+immunological+effects+of+mRNA+vaccines+in+malignant+diseases.">Clinical and immunological effects of mRNA vaccines in malignant diseases.</a> Molecular Cancer. 20 (1), 52 (2021).</li><li>Kwon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+synthetic+mRNA:+In+vitro+synthesis+of+mRNA+and+its+applications+in+regenerative+medicine.">Emergence of synthetic mRNA: In vitro synthesis of mRNA and its applications in regenerative medicine.</a> Biomaterials. 156, 172-193 (2018).</li><li>Campillo-Davo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ins+and+outs+of+messenger+RNA+electroporation+for+physical+gene+delivery+in+immune+cell-based+therapy.">The ins and outs of messenger RNA electroporation for physical gene delivery in immune cell-based therapy.</a> Pharmaceutics. 13 (3), 396 (2021).</li><li>Park, T., Koptyra, M., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+requires+CT10+regulator+of+kinase+(Crk)+and+Crk-like+(CrkL).">Fibroblast growth requires CT10 regulator of kinase (Crk) and Crk-like (CrkL).</a> The Journal of Biological Chemistry. 291 (51), 26273-26290 (2016).</li><li>Park, T. J., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+roles+of+Crk+and+CrkL+in+fibroblast+structure+and+motility.">Essential roles of Crk and CrkL in fibroblast structure and motility.</a> Oncogene. 33 (43), 5121-5132 (2014).</li><li>Chou, P. P., Jaynes, P. K., King, B. P., Chapman, E., Bailey, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+comparison+between+conventional+(method-I)+and+reverse+(method-Ii)+pipetting.">Precision comparison between conventional (method-I) and reverse (method-Ii) pipetting.</a> Clinical Chemistry. 30 (6), 958 (1984).</li><li>Pushparaj, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+the+micropipetting+techniques+in+biomedical+sciences:+A+fundamental+prerequisite+in+good+laboratory+practice.">Revisiting the micropipetting techniques in biomedical sciences: A fundamental prerequisite in good laboratory practice.</a> Bioinformation. 16 (1), 8-12 (2020).</li><li>Park, T. J., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crk+and+Crk-like+play+essential+overlapping+roles+downstream+of+disabled-1+in+the+Reelin+pathway.">Crk and Crk-like play essential overlapping roles downstream of disabled-1 in the Reelin pathway.</a> The Journal of Neuroscience. 28 (50), 13551-13562 (2008).</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRK+proteins+selectively+regulate+T+cell+migration+into+inflamed+tissues.">CRK proteins selectively regulate T cell migration into inflamed tissues.</a> The Journal of Clinical Investigation. 125 (3), 1019-1032 (2015).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+adaptor+protein+Crk+is+indispensable+for+malignant+feature+of+glioblastoma+cell+line+KMG4.">Signaling adaptor protein Crk is indispensable for malignant feature of glioblastoma cell line KMG4.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 362 (4), 976-981 (2007).</li><li>Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+regulation+of+Abl+kinase+by+Crk+Y251+and+Abi1+controls+invasive+phenotypes+in+glioblastoma.">Reciprocal regulation of Abl kinase by Crk Y251 and Abi1 controls invasive phenotypes in glioblastoma.</a> Oncotarget. 6 (35), 37792-37807 (2015).</li><li>Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crk+tyrosine+phosphorylation+regulates+PDGF-BB-inducible+Src+activation+and+breast+tumorigenicity+and+metastasis.">Crk tyrosine phosphorylation regulates PDGF-BB-inducible Src activation and breast tumorigenicity and metastasis.</a> Molecular Cancer Research. 16 (1), 173-183 (2018).</li><li>Raudenska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engine+shutdown:+Migrastatic+strategies+and+prevention+of+metastases.">Engine shutdown: Migrastatic strategies and prevention of metastases.</a> Trends in Cancer. 9 (4), 293-308 (2023).</li><li>Decaestecker, C., Debeir, O., Van Ham, P., Kiss, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+anti-migratory+drugs+be+screened+in+vitro?+A+review+of+2D+and+3D+assays+for+the+quantitative+analysis+of+cell+migration.">Can anti-migratory drugs be screened in vitro? A review of 2D and 3D assays for the quantitative analysis of cell migration.</a> Medicinal Research Reviews. 27 (2), 149-176 (2007).</li><li>Farasani, A., Darbre, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+exposure+to+triclosan+increases+migration+and+invasion+of+human+breast+epithelial+cells+in+vitro.">Long-term exposure to triclosan increases migration and invasion of human breast epithelial cells in vitro.</a> Journal of Applied Toxicology. 41 (7), 1115-1126 (2021).</li><li>Hanusova, V., Skalova, L., Kralova, V., Matouskova, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+flubendazole+on+adhesion+and+migration+in+SW480+and+SW620+colon+cancer+cells.">The effect of flubendazole on adhesion and migration in SW480 and SW620 colon cancer cells.</a> Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 18 (6), 837-846 (2018).</li><li>Lago-Baameiro, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PARK7/DJ-1+inhibition+decreases+invasion+and+proliferation+of+uveal+melanoma+cells.">PARK7/DJ-1 inhibition decreases invasion and proliferation of uveal melanoma cells.</a> Tumori. 109 (1), 47-53 (2023).</li><li>Escalona, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knock+down+of+TIMP-2+by+siRNA+and+CRISPR/Cas9+mediates+diverse+cellular+reprogramming+of+metastasis+and+chemosensitivity+in+ovarian+cancer.">Knock down of TIMP-2 by siRNA and CRISPR/Cas9 mediates diverse cellular reprogramming of metastasis and chemosensitivity in ovarian cancer.</a> Cancer Cell International. 22 (1), 422 (2022).</li><li>Mosca, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+S-adenosyl-L-methionine+on+the+invasion+and+migration+of+head+and+neck+squamous+cancer+cells+and+analysis+of+the+underlying+mechanisms.">Effects of S-adenosyl-L-methionine on the invasion and migration of head and neck squamous cancer cells and analysis of the underlying mechanisms.</a> International Journal of Oncology. 56 (5), 1212-1224 (2020).</li><li>Zhao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGI174+protein+and+its+functional+domain+peptides+exert+antitumour+effects+on+renal+cell+carcinoma.">VEGI174 protein and its functional domain peptides exert antitumour effects on renal cell carcinoma.</a> International Journal of Oncology. 54 (1), 390-398 (2019).</li><li>Witte, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta1-induced+cell+migration+in+pancreatic+carcinoma+cells+is+RAC1+and+NOX4-dependent+and+requires+RAC1+and+NOX4-dependent+activation+of+p38+MAPK.">TGF-beta1-induced cell migration in pancreatic carcinoma cells is RAC1 and NOX4-dependent and requires RAC1 and NOX4-dependent activation of p38 MAPK.</a> Oncology Reports. 38 (6), 3693-3701 (2017).</li><li>Bui, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+aquaporin+3+expression+by+the+AhR+pathway+is+critical+to+cell+migration.">Regulation of aquaporin 3 expression by the AhR pathway is critical to cell migration.</a> Toxicological Sciences. 149 (1), 158-166 (2016).</li><li>Tsuji, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+different+cell-detaching+methods+on+the+viability+and+cell+surface+antigen+expression+of+synovial+mesenchymal+stem+cells.">Effects of different cell-detaching methods on the viability and cell surface antigen expression of synovial mesenchymal stem cells.</a> Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).</li><li>Frandsen, S. K., McNeil, A. K., Novak, I., McNeil, P. L., Gehl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Difference+in+membrane+repair+capacity+between+cancer+cell+lines+and+a+normal+cell+line.">Difference in membrane repair capacity between cancer cell lines and a normal cell line.</a> The Journal of Membrane Biology. 249 (4), 569-576 (2016).</li></ol>

Migration og invasion er vigtige træk ved tumorceller. Måling af tumorcellernes bevægelighed og forståelse af den underliggende mekanisme, der styrer tumorcellemotilitet, giver kritisk indsigt i terapeutiske interventioner 2,27. Der er udviklet flere metoder til at studere cellemigration7. Sårhelingsanalysen ved hjælp af ridser eller kulturindsatser er en enkel og ofte anvendt metode, der giver kontrasterende billeder af hullukning. ...

Tumorcellemotilitet spiller en afgørende rolle i metastase 1,2. Spredningen af tumorceller til nærliggende og fjerntliggende sunde væv gør kræftbehandling vanskelig og bidrager til gentagelse 3,4. Derfor er det vigtigt at forstå mekanismerne for tumorcellemotilitet og udvikle relevante terapeutiske strategier. Da mange tumorceller har ændret genekspressionsprofiler, er det afgørende at forstå, hvilke ændringer i genekspressionsprofilen, der fører til ændret tumorcellemotilitet 5,6.
Flere assays er blevet udviklet til at måle cellemigration in vitro. Nogle analyser giver kun begrænset information på grund af kun at tillade målinger på bestemte tidspunkter, mens andre tilbyder omfattende information om tumorcellemotilitet i realtid7. Selvom mange af disse cellemotilitetsanalyser kan give kvantitative resultater på et givet tidspunkt eller endepunktet, giver de ikke tilstrækkeligt detaljerede oplysninger om dynamiske ændringer i cellemigrationshastigheden i løbet af forsøgsperioden. Derudover kan det være vanskeligt at undersøge potentielle ændringer i cellemigrationshastigheden afhængigt af eksperimentelt design, celletyper og cellenumre. Desuden kan virkningerne af ukomplicerede behandlinger undersøges ved simpel kvantificering af traditionelle motilitetsassays, men mere sofistikeret kvantificering kan være nødvendig for at studere de komplekse virkninger af forskellige kombinerede behandlinger8.
Der er udviklet et instrument til overvågning af den elektriske strøm af en mikrotiterplade, der er godt bunddækket med mikroelektroder9. Vedhæftningen af celler til overfladen af brønden hindrer elektronstrømmen, og impedansen korrelerer med cellernes kvantitative og kvalitative binding. Tilstedeværelsen af mikroelektroderne på brøndbunden muliggør måling af celleadhæsion, spredning og proliferation. Tilstedeværelsen af mikroelektroderne under en mikroporøs membran i det øverste kammer muliggør måling af cellemigration og invasion i det nedre kammer, med det øverste kammer belagt med ekstracellulære matrixproteiner (ECM) for at muliggøre invasion10.
Tidligere blev det demonstreret, at impedansbaserede realtidsmålinger af tumorcellemigration og invasion giver realtidsdata under hele eksperimentet samt øjeblikkelige sammenligninger og kvantificeringer under forskellige eksperimentelle betingelser11. I dette metodepapir blev genknockdown induceret for at teste rollen som proteiner af interesse i tumorcellemigration og invasion. Da en fuldblæst genknockdown-effekt under de testede eksperimentelle betingelser tog 3-4 dage efter elektroporation med små interfererende RNA'er (siRNA'er)8, blev cellerne genudgyldt efter elektroporationen og høstet igen 3 dage senere til impedansbaseret realtidsmåling af tumorcellemigration og invasion.
CT10-regulator af kinase (Crk) og Crk-lignende (CrkL) er adaptorproteiner, der medierer protein-proteininteraktioner nedstrøms for forskellige vækstfaktorreceptorkinaseveje og ikke-receptortyrosinkinaseveje12. Forhøjede niveauer af Crk- og CrkL-proteiner bidrager til dårlig prognose i flere humane kræftformer, herunder glioblastom13. Det er imidlertid uklart, hvordan forhøjede Crk- og CrkL-proteiner fører til en dårlig prognose. Derfor er det vigtigt at definere effekten af Crk og CrkL overekspression på tumorcellefunktioner. Tidligere blev der udført en genknockdown-undersøgelse for at demonstrere, at endogene niveauer af Crk- og CrkL-proteiner er nødvendige for glioblastomcellemigration og invasion8. Her er der udviklet et modificeret analysesystem til at adressere effekten af Crk og CrkL overekspression på tumorcellemigration og invasion.
For nylig har in vitro-syntesen af mRNA og dets terapeutiske anvendelser tiltrukket fornyet opmærksomhed på grund af udviklingen af mRNA-vaccinerne mod SARS-CoV-2 (gennemgået af Verbeke et al.14). Derudover er der gjort bemærkelsesværdige fremskridt i brugen af syntetisk mRNA i kræft og andre sygdomme15,16. Elektroporation af celler er en effektiv metode til at levere syntetisk mRNA og inducere forbigående genetisk modifikation (gennemgået af Campillo-Davo et al.17), og brugen af syntetisk mRNA muliggør hurtig og effektiv genekspression i udødeliggjorte fibroblaster 18. Dette metodepapir kombinerer genoverekspression ved hjælp af syntetisk mRNA med celleanalyser i realtid for at studere tumorcellemigration og invasion. Det eksperimentelle skema, der anvendes til siRNA'er, fungerer imidlertid ikke med syntetisk mRNA-transfektion, da niveauet af eksogene proteiner stiger hurtigt og falder gradvist ved syntetisk mRNA-transfektion18. Derfor er metoden blevet modificeret til at udføre realtidsanalyse af cellemigration og invasion lige efter transfektionen uden yderligere dyrkning af cellerne.
Dette metodepapir viser, at kombination af impedansbaserede realtidsmålinger med transfektion af tumorceller med syntetiske mRNA'er giver en hurtig og omfattende analyse af virkningerne af genopregulering på tumorcellemigration og invasion. Dette metodepapir beskriver detaljerede procedurer til måling af, hvordan migration og invasion af glioblastomceller påvirkes af overekspression af Crk og CrkL. Ved at undersøge de koncentrationsafhængige virkninger af syntetisk mRNA på tumorcellemigration beskriver papiret klart, hvordan en stigning i proteinniveauer stimulerer tumorcellemigration. Derudover præsenteres en tilgang til at variere koncentrationen af ECM-gelen for at vurdere virkningerne af ændringer i genekspression på tumorcelleinvasion.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AlphaImager HP</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>92-13823-00</td>
			<td>Agarose gel imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-Tubulin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9026</td>
			<td>Used to detect &#945;-tubulin protein (dilution 1:3,000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CIM-plate 16</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc</td>
			<td>5665825001</td>
			<td>Cell invasion and migration plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crk antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610035</td>
			<td>Used to detect CrkI and CrkII proteins (dilution 1:1,500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CrkL antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-319</td>
			<td>Used to detect CrkL protein (dilution 1:1,500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>302002</td>
			<td>Cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td>Buffer used to wash cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30910.03</td>
			<td>Culture medium supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell VIOS 160i CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51030285</td>
			<td>CO2 incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW goat anti-mouse IgG secondary antibody</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td>926-32210</td>
			<td>Secondary antibody for Western blot analysis (dilution 1:10,000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW goat anti-rabbit IgG secondary antibody</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td>926-32211</td>
			<td>Secondary antibody for Western blot analysis&#160; (dilution 1:10,000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium chloride&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9480</td>
			<td>Used for RNA precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Extracellular matrix (ECM) gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAscript T7 transcription kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1334</td>
			<td>Used for RNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millennium RNA markers</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM7150</td>
			<td>Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini centrifuge</td>
			<td>ISC BioExpress</td>
			<td>C1301P-ISC</td>
			<td>Used to spin down cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse brain QUICK-Clone cDNA</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>637301</td>
			<td>Source of genes (inserts) for cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoQuant</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>M200PRO</td>
			<td>Nucleic acid quantification system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon electroporation system&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK5000</td>
			<td>Electroporation system1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon transfection system 10 &#181;L kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK1025</td>
			<td>Electroporation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon transfection system 100 &#181;L kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK10096</td>
			<td>Electroporation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NorthernMax denaturing gel buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM8676</td>
			<td>Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NorthernMax formaldehyde load dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM8552</td>
			<td>Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NorthernMax running buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM8671</td>
			<td>Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>W3331</td>
			<td>Used for various reactions during mRNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey CLx Imager</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td></td>
			<td>Imager for Western blot analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3.1/myc-His</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>V80020</td>
			<td>The vector into which inserts (mouse CrkI and CrkL cDNAs) were cloned</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFLAG-CMV-5a</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>E7523</td>
			<td>Source of the FLAG epitope tag</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:chloroform:isoamyl alcohol&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2069</td>
			<td>Used for DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PmeI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0560L</td>
			<td>Used to linearize the plasmids for mRNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(A) tailing kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1350</td>
			<td>Used for poly(A) tail reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene tissue culture dish (100 x 20 mm style)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353003</td>
			<td>Used for culturing cells before transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene tissue culture dish (35 x 10 mm style)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353001</td>
			<td>Used for culturing transfected cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25530049</td>
			<td>Used to remove protein in the reaction mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purifier Axiom Class II, Type C1</td>
			<td>Labconco Corporation</td>
			<td>304410001</td>
			<td>Biosafety cabinet for sterile handling of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resuspension Buffer R</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>A buffer included in the electroporation kits, MPK1025 and MPK10096. The buffer is used to resupend cells before electroporation, and its composition is proprietary information.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9780</td>
			<td>RNA decontamination solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scepter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>C85360</td>
			<td>Handheld automated cell counter&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ScriptCap 2&#39;-O-methyltransferase kit</td>
			<td>Cellscript</td>
			<td>C-SCMT0625</td>
			<td>Used for capping reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ScriptCap m7G capping system</td>
			<td>Cellscript</td>
			<td>C-SCCE0625</td>
			<td>Used for capping reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15553-035</td>
			<td>Detergent used for the proteinase K reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend XT centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75004532</td>
			<td>Benchtop centrifuge to spin down cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>Used for dissociation of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-118MG&#160;</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB15</td>
			<td>An adherent cell line derived from a human glioblastoma patient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinculin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V9131</td>
			<td>Used to detect vinculin protein (dilution 1:100,000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xCELLigence RTCA DP</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc</td>
			<td>380601050</td>
			<td>Instrument used for real-time cell analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1Electroporation parameters and other related information for various cell lines are available on the manufacturer&#39;s homepage (https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-culture/transfection/neon-transfection-system/neon-transfection-system-cell-line-data.html?).</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time quantitative measurement of tumor cell migration and invasion following synthetic mrna transfection

Tumorceller er meget bevægelige og invasive og viser ændrede genekspressionsmønstre. Viden om, hvordan ændringer i genekspression regulerer tumorcellemigration og invasion, er afgørende for at forstå mekanismerne for tumorcelleinfiltration i nærliggende sundt væv og metastase. Tidligere blev det påvist, at genknockdown efterfulgt af impedansbaseret realtidsmåling af tumorcellemigration og invasion muliggør identifikation af de gener, der kræves til tumorcellemigration og invasion. For nylig har mRNA-vaccinerne mod SARS-CoV-2 øget interessen for at bruge syntetisk mRNA til terapeutiske formål. Her blev metoden ved hjælp af syntetisk mRNA revideret for at studere effekten af genoverekspression på tumorcellemigration og invasion. Denne undersøgelse viser, at forhøjet genekspression med syntetisk mRNA-transfektion efterfulgt af impedansbaseret realtidsmåling kan hjælpe med at identificere de gener, der stimulerer tumorcellemigration og invasion. Dette metodepapir giver vigtige detaljer om procedurerne for undersøgelse af effekten af ændret genekspression på tumorcellemigration og invasion.

Crk- og CrkL-proteiner spiller vigtige roller i motiliteten af mange celletyper, herunder neuroner22, T-celler23, fibroblaster 18,19 og en række tumorceller13. Da Crk- og CrkL-proteiner er rapporteret at være forhøjet i glioblastom24,25,26, blev virkningerne af overekspression af CrkI, en splejsningsvariant af Crk,<sup class="xref"...

Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Quantitative Measurement of Tumor Cell Migration and Invasion Following Synthetic mRNA Transfection at JoVE.com

Real-Time Quantitative Measurement of Tumor Cell Migration and Invasion Following Synthetic mRNA Transfection

Mange opregulerede gener stimulerer tumorcellemigration og invasion, hvilket fører til dårlig prognose. Det er afgørende at bestemme, hvilke gener der regulerer tumorcellemigration og invasion. Denne protokol præsenterer en metode til at undersøge virkningerne af den øgede ekspression af et gen på migration og invasion af tumorceller i realtid.

Kvantitativ måling i realtid af tumorcellemigration og invasion efter syntetisk mRNA-transfektion

Tumor cells are highly motile and invasive and display altered gene expression patterns. Knowledge of how changes in gene expression regulate tumor cell ...

Denne protokol viser, at kombination af sensation messenger RNA-transaktion med impedansbaserede realtidsmålinger af cellemigration og invasion letter identifikationen af gen, der stimulerer tumorcellemigration og invasion. Det impedansbaserede realtidscelleanalysesystem muliggør kvantitativ, kontinuerlig og omfattende overvågning af tumorcellemigration ved genekspressionsændringer. Gener, der er over at udtrykke tumorer og stimulere tumorcellemigration, kan identificeres som potentielle mål for at hæmme metastaser i kræftbehandling.Til at begynde med tilsættes 10 mikroliter 10x reaktionsbuffer, 1,5 mikroliter PNE en og 10 mikrogram plasmid-DNA til et mikrocentrifugerør for lineariseret plasmid-DNA'et med restriktionsenzymet. Tilsæt nukleasefrit vand for at bringe reaktionsvolumenet til 100 mikroliter. Bland det ved at banke og dreje det ned, før reaktionsblandingen inkuberes ved 37 grader Celsius natten over.Drej igen ned og tilsæt fem mikroliter 10% SDS og en mikroliter 20 milligram pr. Milliliter RNA-proteinase K til reaktionsblandingen, før du blander den og spinder den ned. Efter 30 minutters inkubation ved 50 grader Celsius tilsættes to mikroliter hver af 10x transkriptionsbuffer, ATP, GTP, UTP, CTP og T7 og et mikrogram lineært DNA til et mikrocentrifugerør til T7 RNA-polymerasemedieret RNA-syntese. Tilsæt nukleasefrit vand for at bringe reaktionsvolumenet til 20 mikroliter.Efter et spin ned inkuberes reaktionsblandingen ved 37 grader Celsius i to timer til RNA-syntese. Derefter spindes ned og tilsættes en mikroliter DNA'er og tryk inden 15 minutters inkubation ved 37 grader Celsius for at fjerne skabelon-DNA'et. Begynd lithiumchloridudfældningen af RNA'et ved at tilsætte 10 mikroliter 7,5 molært lithiumchlorid til reaktionsblandingen.Efter at have tappet og spindet ned, inkuberes reaktionsblandingen ved minus 20 grader Celsius i 30 minutter. Til afdækning opvarmes RNA-prøven ved 65 grader Celsius i 10 minutter og placeres derefter på is til afkøling. Tilføj derefter capping reaktionskomponenter og bland ved at tappe.Spin ned og inkuber reaktionsblandingen ved 37 grader Celsius i en time. Til poly-A-tailing drejes prøven ned, og poly-A-tailingreaktionskomponenterne tilsættes. Tryk derefter, drej ned og inkuber reaktionsblandingen ved 37 grader Celsius i to timer.Til lithiumchloridudfældning og kvantificering af det syntetiske mRNA tilsættes 50 mikroliter 7,5 molært lithiumchlorid og udfører lithiumchloridudfældningen. Fjern en prøve ECM-gelfond fra fryseren, og opbevar den på is. Fortynd 10 milligram pr. liter ECM-gel til en arbejdskoncentration ved at blande 990 mikroliter DMEM med 10 mikroliter ECM-gel i et mikrocentrifugerør.Bland ved forsigtig pipettering. Der tilsættes 60 mikroliter fortyndet ECM-gel til hver af de 16 huller i CIM-pladens øverste kammer. CIM-pladens øverste kammer med pladedækslet anbragt på en beskyttende plastplade inde i en kuldioxidinkubator i ca. fire timer for at danne et gellag.Til elektroporation tilsættes en milliliter DPBS til tumorcellesuspensionen i hvert rør. Tryk på celleophænget, og drej ned tre gange i 10 sekunder. Supernatanten fjernes med en mikropipette.Tilsæt 110 mikroliter resuspensionsbuffer R til cellepelleten for at opnå 0,1 millioner celler i 10 mikroliter. Tilsæt syntetisk mRNA til cellepelleten for at opnå 0,2 til 20 nanogram pr. Mikroliter koncentration afhængigt af det ønskede ekspressionsniveau. Bland og ophæng cellepillen forsigtigt ved at banke.Derefter elektroporerer 10 mikroliter af cellesuspensionen med et elektroporationssystem ved 1.350 volt i 10 millisekunder med tre impulser hver gang. Når det er gjort, overføres de elektroporerede celler til et nyt mikrocentrifugerør med 1,1 ml DMEM indeholdende 0,5% FBS. Åbn analyseprogrammet ved at dobbeltklikke på ikonet for celleanalysesoftware i realtid.Når du har åbnet standardindstillingen for opsætning af eksperimentmønster, skal du vælge indstillingen for at køre tre eksperimenter separat. Åbn hver vugge ved at klikke på nummerfanen. Klik derefter på fanen Eksperimentnoter.Vælg mappen, og gem dataene ved at indtaste eksperimentets navn. Klik på layoutfanen og vælg fire brønde ad gangen for at opsætte quad-duplikatbrøndene for hver behandlingstilstand. Indtast eksempeloplysningerne, og klik på Anvend.Klik på fanen tidsplan, og tilføj derefter et trin for at indstille totrinstilstanden for celleimpedansmålingerne. Klik derefter på Anvend for at konfigurere det første trin. Klik på tilføj et trin igen, og indtast 10 minutter for intervallet og 48 timer for varigheden af migration og invasion.Klik derefter på Anvend for at konfigurere det andet trin. En time før celleimpedansmålingen tilsættes 160 mikroliter DMEM indeholdende 10% serum eller andre kemotiltrækningsmidler til hullerne i CIM-pladens nedre kammer. Saml det øverste kammer, der indeholder ECM-gelbelagte brønde til invasion eller ubelagte brønde til migration med det nederste kammer.Til cellemigrationsanalysen tilsættes 50 mikroliter lavt serummedium til hullerne i CIM-pladens øverste kammer. Placer CIM-pladen og systemets vugge i CO2-inkubatoren. Klik på meddelelsesfanen.Når forbindelsen er okay, vises meddelelsen, CIM-pladen er klar til eksperimentet. Forinkuber den samlede CIM-plade i kuldioxidinkubatoren i 30 til 60 minutter før realtidscelleanalysen for at akklimatisere CIM-pladen til kulturtilstanden. For grundlinjeaflæsningen skal du klikke på startknappen for hver holder.Når vinduet Gem som vises, skal du gemme den eksperimentelle fil for at udføre grundlinjelæsningen. Ved cellesæder fjernes CIM-pladen fra holderen og anbringes i biosikkerhedsskabet på pladeholderen. Derefter tilsættes 100 mikroliter elektroporerede celler indeholdende 100.000 celler til brøndene i CIM-pladens øverste kammer, og lad CIM-pladen stå under biosikkerhedsskabet i 30 minutter ved stuetemperatur.Celleimpedansen måles ved at flytte den fuldt samlede CIM-plade tilbage til den respektive holder. Start celleimpedansmålingen for det andet trin ved at klikke på vuggens startknap og på plotfanen. Klik derefter på Tilføj alle knappen og vælg afkrydsningsfelterne Gennemsnit og Standardafvigelse for at visualisere dataene i realtid.Elektroporationen af U 118 mg glioblastomceller med varierende koncentrationer af syntetisk crack et mRNA resulterede i en koncentrationsafhængig stigning i flagmærket crack one protein en dag efter transfektion. 0,2 og to nanogram pr. mikroliter mRNA førte til et uopdageligt eller beskedent udtryk for det eksogene crack one-protein. 20 nanogram pr. mikroliter mRNA resulterede i et højere ekspressionsniveau end det endogene crack one-protein.Cellemigrationsanalysen indikerede, at elektroporationen var 0,2 eller to nanogram pr. Mikroliter crack, et mRNA påvirkede ikke cellemigrationen i høj grad. Imidlertid førte elektroporation med 20 nanogram pr. Mikroliter crack et mRNA til en klar stimulering af cellemigration med flere celler, der migrerede mellem to og 13 timer, hvilket afslørede, at glioblastomcellemigration blev stimuleret af stigningen i crack et proteinniveau. Elektroporationen med syntetisk crack L mRNA førte til et robust udtryk for flagmærket crack L-protein en dag efter transfektion.Invasionen af kontrolcellerne bremsede med den øgede ECM-proteinkoncentration. Crack L over ekspression af celler viste et ECM-gelkoncentrationsafhængigt fald i celleinvasion. Sammenligningen mellem kontrol og crack L over ekspression af celler ved forskellige ECM-gelkoncentrationer indikerede, at crack L-overekspression generelt stimulerede celleinvasion gennem ECM-gellaget.Resultaterne antydede også, at de to cellepopulationer blev forskelligt påvirket af stigende ECM-gelkoncentration på forskellige tidspunkter. Celler skal resuspenderes hurtigt, forsigtigt og fuldstændigt i den resuspenderede boble R-mennesker elektroporation, fordi lang inkubation af celler i den resuspenderede boble R gør celler usunde. Hurtige og langsomt migrerende tumorceller kan isoleres for at karakterisere forskelle mellem de to cellepopulationer.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Evaluation of the Cell Invasion and Migration Process: A Comparison of the Video Microscope-based Scratch Wound Assay and the Boyden Chamber Assay

Evaluering af celle Invasion og migrationsprocessen: en sammenligning af den Video mikroskop-baseret skrabespil sår Assay og Boyden kammer Assay

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration ...

Serum and Plasma Copy Number Detection Using Real-time PCR

Serum og Plasma kopi nummer påvisning ved hjælp af Real-time PCR

Serum and plasma cell free DNA (cfDNA) has been shown as an informative, non-invasive source of biomarkers for cancer diagnosis, prognosis, monitoring, ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Live-celle Imaging Assays til undersøgelse glioblastom hjerne Tumor stamcelle Migration og Invasion

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Realtid påvisning af i Vitro Tumor celle apoptose induceret af CD8+ T-celler til at studere immun suppressiv funktioner af Tumor infiltrerer myeloide celler

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager

En simpel Migration/Invasion arbejdsgang ved hjælp af en automatiseret Live-celle Imager

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great ...

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

Fuldt humant tumor-baserede matrix i tredimensionale Spheroid invasion assay

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...

Real-Time Monitoring of Human Glioma Cell Migration on Dorsal Root Ganglion Axon-Oligodendrocyte Co-Cultures

Realtidsovervågning af menneskelige Glioma celle migration på dorsale root ganglion Axon-Oligodendrocyte Co-kulturer

Glioblastoma is one of the most aggressive human cancers due to extensive cellular heterogeneity and the migration properties of hGCs. In order to better ...

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

Karakterisering af virkningerne af Migrastatiske hæmmere på 3D tumor Spheroid invasion af høj opløsning Konfokal mikroskopi

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

Impedance-based Real-time Measurement of Cancer Cell Migration and Invasion

Impedans-baseret Real-time Måling af Kræft Cell Migration og Invasion

Cancer arises due to uncontrolled proliferation of cells initiated by genetic instability, mutations, and environmental and other stress factors. These ...

Measuring Real-time Drug Response in Organotypic Tumor Tissue Slices

Måling Real-time Drug Response i organotypic tumorvæv skiver

Tumor tissues are composed of cancerous cells, infiltrated immune cells, endothelial cells, fibroblasts, and extracellular matrix. This complex milieu ...