Name: real-time quantitative measurement of tumor cell migration and invasion following synthetic mrna transfection
Uploaded: 2023-06-23T13:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Quantitative Measurement of Tumor Cell Migration and Invasion Following Synthetic mRNA Transfection at JoVE.com

De auteurs danken het Medical Writing Center van Children's Mercy Kansas City voor het redigeren van dit manuscript. Dit werk werd ondersteund door Natalie's A.R.T. Foundation (aan T.P.) en door een MCA Partners Advisory Board-subsidie van Children's Mercy Hospital (CMH) en het University of Kansas Cancer Center (KUCC) (aan TP).

1. Synthese van mRNA
OPMERKING: Voor de mRNA-synthese moeten alle reagentia en apparatuur speciaal worden behandeld om de RNases vóór gebruik te inactiveren. Zie de materiaaltabel voor meer informatie over alle materialen, instrumenten en reagentia die in dit protocol worden gebruikt.
<ol><li>Linearisatie van DNA OPMERKING: Muizen-cDNA's van CrkI en CrkL werden gekloond in de pFLAG-CMV-5a-expressievector om de FLAG-epitooptag toe te voegen aan ...

<ol>
	<li>Palmer, T. D., Ashby, W. J., Lewis, J. D., Zijlstra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+tumor+cell+motility+to+prevent+metastasis.">Targeting tumor cell motility to prevent metastasis.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (8), 568-581 (2011).</li><li>Eccles, S. A., Box, C., Court, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration/invasion+assays+and+their+application+in+cancer+drug+discovery.">Cell migration/invasion assays and their application in cancer drug discovery.</a> Biotechnology Annual Review. 11, 391-421 (2005).</li><li>Kluiver, T. A., Alieva, M., van Vuurden, D. G., Wehrens, E. J., Rios, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invaders+exposed:+Understanding+and+targeting+tumor+cell+invasion+in+diffuse+intrinsic+pontine+glioma.">Invaders exposed: Understanding and targeting tumor cell invasion in diffuse intrinsic pontine glioma.</a> Frontiers in Oncology. 10, 92 (2020).</li><li>Xie, Q., Mittal, S., Berens, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+adaptive+glioblastoma:+An+overview+of+proliferation+and+invasion.">Targeting adaptive glioblastoma: An overview of proliferation and invasion.</a> Neuro-Oncology. 16 (12), 1575-1584 (2014).</li><li>Wee, Y., Wang, T., Liu, Y., Li, X., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pan-cancer+study+of+copy+number+gain+and+up-regulation+in+human+oncogenes.">A pan-cancer study of copy number gain and up-regulation in human oncogenes.</a> Life Sciences. 211, 206-214 (2018).</li><li>Zhao, M., Liu, Y., Qu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+epithelial-mesenchymal+transition-related+genes+increases+with+copy+number+in+multiple+cancer+types.">Expression of epithelial-mesenchymal transition-related genes increases with copy number in multiple cancer types.</a> Oncotarget. 7 (17), 24688-24699 (2016).</li><li>Pijuan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+cell+migration,+invasion,+and+adhesion+assays:+From+cell+imaging+to+data+analysis.">In vitro cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 107 (2019).</li><li>Park, T., Large, N., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+glioblastoma+phenotypes+in+vitro+establishes+cell+migration+as+a+robust+readout+of+Crk+and+CrkL+activity.">Quantitative assessment of glioblastoma phenotypes in vitro establishes cell migration as a robust readout of Crk and CrkL activity.</a> The Journal of Biological Chemistry. 296, 100390 (2021).</li><li>Urcan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+xCELLigence+impedance+analysis+of+the+cytotoxicity+of+dental+composite+components+on+human+gingival+fibroblasts.">Real-time xCELLigence impedance analysis of the cytotoxicity of dental composite components on human gingival fibroblasts.</a> Dental Materials. 26 (1), 51-58 (2010).</li><li>Limame, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+dynamic+cell+viability,+migration+and+invasion+assessments+by+novel+real-time+technology+and+classic+endpoint+assays.">Comparative analysis of dynamic cell viability, migration and invasion assessments by novel real-time technology and classic endpoint assays.</a> PLoS One. 7 (10), e46536 (2012).</li><li>Mudduluru, G., Large, N., Park, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impedance-based+real-time+measurement+of+cancer+cell+migration+and+invasion.">Impedance-based real-time measurement of cancer cell migration and invasion.</a> Journal of Visualized Experiments. (158), e60997 (2020).</li><li>Feller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crk+family+adaptors-signalling+complex+formation+and+biological+roles.">Crk family adaptors-signalling complex formation and biological roles.</a> Oncogene. 20 (44), 6348-6371 (2001).</li><li>Park, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crk+and+CrkL+as+therapeutic+targets+for+cancer+treatment.">Crk and CrkL as therapeutic targets for cancer treatment.</a> Cells. 10 (4), 739 (2021).</li><li>Verbeke, R., Lentacker, I., De Smedt, S. C., Dewitte, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dawn+of+mRNA+vaccines:+The+COVID-19+case.">The dawn of mRNA vaccines: The COVID-19 case.</a> Journal of Controlled Release. 333, 511-520 (2021).</li><li>Heine, A., Juranek, S., Brossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+and+immunological+effects+of+mRNA+vaccines+in+malignant+diseases.">Clinical and immunological effects of mRNA vaccines in malignant diseases.</a> Molecular Cancer. 20 (1), 52 (2021).</li><li>Kwon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+synthetic+mRNA:+In+vitro+synthesis+of+mRNA+and+its+applications+in+regenerative+medicine.">Emergence of synthetic mRNA: In vitro synthesis of mRNA and its applications in regenerative medicine.</a> Biomaterials. 156, 172-193 (2018).</li><li>Campillo-Davo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ins+and+outs+of+messenger+RNA+electroporation+for+physical+gene+delivery+in+immune+cell-based+therapy.">The ins and outs of messenger RNA electroporation for physical gene delivery in immune cell-based therapy.</a> Pharmaceutics. 13 (3), 396 (2021).</li><li>Park, T., Koptyra, M., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+requires+CT10+regulator+of+kinase+(Crk)+and+Crk-like+(CrkL).">Fibroblast growth requires CT10 regulator of kinase (Crk) and Crk-like (CrkL).</a> The Journal of Biological Chemistry. 291 (51), 26273-26290 (2016).</li><li>Park, T. J., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+roles+of+Crk+and+CrkL+in+fibroblast+structure+and+motility.">Essential roles of Crk and CrkL in fibroblast structure and motility.</a> Oncogene. 33 (43), 5121-5132 (2014).</li><li>Chou, P. P., Jaynes, P. K., King, B. P., Chapman, E., Bailey, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+comparison+between+conventional+(method-I)+and+reverse+(method-Ii)+pipetting.">Precision comparison between conventional (method-I) and reverse (method-Ii) pipetting.</a> Clinical Chemistry. 30 (6), 958 (1984).</li><li>Pushparaj, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+the+micropipetting+techniques+in+biomedical+sciences:+A+fundamental+prerequisite+in+good+laboratory+practice.">Revisiting the micropipetting techniques in biomedical sciences: A fundamental prerequisite in good laboratory practice.</a> Bioinformation. 16 (1), 8-12 (2020).</li><li>Park, T. J., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crk+and+Crk-like+play+essential+overlapping+roles+downstream+of+disabled-1+in+the+Reelin+pathway.">Crk and Crk-like play essential overlapping roles downstream of disabled-1 in the Reelin pathway.</a> The Journal of Neuroscience. 28 (50), 13551-13562 (2008).</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRK+proteins+selectively+regulate+T+cell+migration+into+inflamed+tissues.">CRK proteins selectively regulate T cell migration into inflamed tissues.</a> The Journal of Clinical Investigation. 125 (3), 1019-1032 (2015).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+adaptor+protein+Crk+is+indispensable+for+malignant+feature+of+glioblastoma+cell+line+KMG4.">Signaling adaptor protein Crk is indispensable for malignant feature of glioblastoma cell line KMG4.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 362 (4), 976-981 (2007).</li><li>Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+regulation+of+Abl+kinase+by+Crk+Y251+and+Abi1+controls+invasive+phenotypes+in+glioblastoma.">Reciprocal regulation of Abl kinase by Crk Y251 and Abi1 controls invasive phenotypes in glioblastoma.</a> Oncotarget. 6 (35), 37792-37807 (2015).</li><li>Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crk+tyrosine+phosphorylation+regulates+PDGF-BB-inducible+Src+activation+and+breast+tumorigenicity+and+metastasis.">Crk tyrosine phosphorylation regulates PDGF-BB-inducible Src activation and breast tumorigenicity and metastasis.</a> Molecular Cancer Research. 16 (1), 173-183 (2018).</li><li>Raudenska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engine+shutdown:+Migrastatic+strategies+and+prevention+of+metastases.">Engine shutdown: Migrastatic strategies and prevention of metastases.</a> Trends in Cancer. 9 (4), 293-308 (2023).</li><li>Decaestecker, C., Debeir, O., Van Ham, P., Kiss, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+anti-migratory+drugs+be+screened+in+vitro?+A+review+of+2D+and+3D+assays+for+the+quantitative+analysis+of+cell+migration.">Can anti-migratory drugs be screened in vitro? A review of 2D and 3D assays for the quantitative analysis of cell migration.</a> Medicinal Research Reviews. 27 (2), 149-176 (2007).</li><li>Farasani, A., Darbre, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+exposure+to+triclosan+increases+migration+and+invasion+of+human+breast+epithelial+cells+in+vitro.">Long-term exposure to triclosan increases migration and invasion of human breast epithelial cells in vitro.</a> Journal of Applied Toxicology. 41 (7), 1115-1126 (2021).</li><li>Hanusova, V., Skalova, L., Kralova, V., Matouskova, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+flubendazole+on+adhesion+and+migration+in+SW480+and+SW620+colon+cancer+cells.">The effect of flubendazole on adhesion and migration in SW480 and SW620 colon cancer cells.</a> Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 18 (6), 837-846 (2018).</li><li>Lago-Baameiro, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PARK7/DJ-1+inhibition+decreases+invasion+and+proliferation+of+uveal+melanoma+cells.">PARK7/DJ-1 inhibition decreases invasion and proliferation of uveal melanoma cells.</a> Tumori. 109 (1), 47-53 (2023).</li><li>Escalona, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knock+down+of+TIMP-2+by+siRNA+and+CRISPR/Cas9+mediates+diverse+cellular+reprogramming+of+metastasis+and+chemosensitivity+in+ovarian+cancer.">Knock down of TIMP-2 by siRNA and CRISPR/Cas9 mediates diverse cellular reprogramming of metastasis and chemosensitivity in ovarian cancer.</a> Cancer Cell International. 22 (1), 422 (2022).</li><li>Mosca, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+S-adenosyl-L-methionine+on+the+invasion+and+migration+of+head+and+neck+squamous+cancer+cells+and+analysis+of+the+underlying+mechanisms.">Effects of S-adenosyl-L-methionine on the invasion and migration of head and neck squamous cancer cells and analysis of the underlying mechanisms.</a> International Journal of Oncology. 56 (5), 1212-1224 (2020).</li><li>Zhao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGI174+protein+and+its+functional+domain+peptides+exert+antitumour+effects+on+renal+cell+carcinoma.">VEGI174 protein and its functional domain peptides exert antitumour effects on renal cell carcinoma.</a> International Journal of Oncology. 54 (1), 390-398 (2019).</li><li>Witte, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta1-induced+cell+migration+in+pancreatic+carcinoma+cells+is+RAC1+and+NOX4-dependent+and+requires+RAC1+and+NOX4-dependent+activation+of+p38+MAPK.">TGF-beta1-induced cell migration in pancreatic carcinoma cells is RAC1 and NOX4-dependent and requires RAC1 and NOX4-dependent activation of p38 MAPK.</a> Oncology Reports. 38 (6), 3693-3701 (2017).</li><li>Bui, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+aquaporin+3+expression+by+the+AhR+pathway+is+critical+to+cell+migration.">Regulation of aquaporin 3 expression by the AhR pathway is critical to cell migration.</a> Toxicological Sciences. 149 (1), 158-166 (2016).</li><li>Tsuji, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+different+cell-detaching+methods+on+the+viability+and+cell+surface+antigen+expression+of+synovial+mesenchymal+stem+cells.">Effects of different cell-detaching methods on the viability and cell surface antigen expression of synovial mesenchymal stem cells.</a> Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).</li><li>Frandsen, S. K., McNeil, A. K., Novak, I., McNeil, P. L., Gehl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Difference+in+membrane+repair+capacity+between+cancer+cell+lines+and+a+normal+cell+line.">Difference in membrane repair capacity between cancer cell lines and a normal cell line.</a> The Journal of Membrane Biology. 249 (4), 569-576 (2016).</li></ol>

Migratie en invasie zijn belangrijke kenmerken van tumorcellen. Het meten van de beweeglijkheid van tumorcellen en het begrijpen van het onderliggende mechanisme dat de beweeglijkheid van tumorcellen regelt, bieden cruciale inzichten in therapeutische interventies 2,27. Er zijn verschillende methoden ontwikkeld om celmigratie te bestuderen7. De wondgenezingstest met behulp van krassen of kweekinzetstukken is een eenvoudige en veelgebruikte...

De beweeglijkheid van tumorcellen speelt een cruciale rol bij metastase 1,2. De verspreiding van tumorcellen naar naburige en afgelegen gezonde weefsels maakt de behandeling van kanker moeilijk en draagt bij aan recidief 3,4. Daarom is het essentieel om de mechanismen van de beweeglijkheid van tumorcellen te begrijpen en relevante therapeutische strategieën te ontwikkelen. Aangezien veel tumorcellen veranderde genexpressieprofielen hebben, is het cruciaal om te begrijpen welke veranderingen in het genexpressieprofiel leiden tot een veranderde beweeglijkheid van de tumorcellen 5,6.
Er zijn verschillende testen ontwikkeld om celmigratie in vitro te meten. Sommige tests bieden slechts beperkte informatie omdat metingen alleen op specifieke tijdstippen mogelijk zijn, terwijl andere uitgebreide informatie bieden over de beweeglijkheid van tumorcellen in realtime7. Hoewel veel van deze tests op het gebied van celmotiliteit kwantitatieve resultaten kunnen opleveren op een bepaald moment of het eindpunt, geven ze onvoldoende gedetailleerde informatie over dynamische veranderingen in de snelheid van celmigratie gedurende de experimentele periode. Bovendien kan het moeilijk zijn om mogelijke veranderingen in de celmigratiesnelheid te onderzoeken, afhankelijk van het experimentele ontwerp, de celtypen en het aantal cellen. Bovendien kunnen de effecten van ongecompliceerde behandelingen worden onderzocht door de eenvoudige kwantificering van traditionele motiliteitstests, maar meer geavanceerde kwantificering kan nodig zijn om de complexe effecten van verschillende gecombineerde behandelingen te bestuderen8.
Er is een instrument ontwikkeld voor het bewaken van de elektrische stroom van een microtiterplaat die goed is bedekt met micro-elektroden9. De hechting van cellen aan het oppervlak van de put belemmert de elektronenstroom en de impedantie correleert met de kwantitatieve en kwalitatieve binding van de cellen. De aanwezigheid van de micro-elektroden op de bodem van de put maakt het mogelijk om de adhesie, verspreiding en proliferatie van cellen te meten. De aanwezigheid van de micro-elektroden onder een microporeus membraan van de bovenste kamer maakt het mogelijk om celmigratie en invasie in de onderste kamer te meten, waarbij de bovenste kamer is gecoat met extracellulaire matrix (ECM)-eiwitten om invasie mogelijk te maken10.
Eerder werd aangetoond dat op impedantie gebaseerde real-time metingen van tumorcelmigratie en -invasie real-time gegevens opleveren tijdens het hele experiment, evenals onmiddellijke vergelijkingen en kwantificeringen onder verschillende experimentele omstandigheden11. In dat methodedocument werd gen-knockdown geïnduceerd om de rol van eiwitten die van belang zijn bij de migratie en invasie van tumorcellen te testen. Aangezien een volwaardig gen-knockdown-effect onder de geteste experimentele omstandigheden 3-4 dagen duurde na elektroporatie met kleine interfererende RNA's (siRNA's)8, werden de cellen na de elektroporatie opnieuw geplateerd en 3 dagen later opnieuw geoogst voor de impedantie-gebaseerde real-time meting van tumorcelmigratie en -invasie.
CT10-regulator van kinase (Crk) en Crk-like (CrkL) zijn adaptoreiwitten die eiwit-eiwitinteracties stroomafwaarts van verschillende groeifactorreceptorkinaseroutes en niet-receptortyrosinekinaseroutes bemiddelen12. Verhoogde niveaus van Crk- en CrkL-eiwitten dragen bij aan een slechte prognose bij verschillende vormen van kanker bij de mens, waaronder glioblastoom13. Het is echter onduidelijk hoe verhoogde Crk- en CrkL-eiwitten leiden tot een slechte prognose. Daarom is het belangrijk om het effect van Crk- en CrkL-overexpressie op tumorcelfuncties te definiëren. Eerder werd een gen-knockdown-studie uitgevoerd om aan te tonen dat endogene niveaus van Crk- en CrkL-eiwitten nodig zijn voor glioblastoomcelmigratie en -invasie8. Hier is een aangepast testsysteem ontwikkeld om het effect van Crk- en CrkL-overexpressie op de migratie en invasie van tumorcellen aan te pakken.
Onlangs hebben de in vitro synthese van mRNA en de therapeutische toepassingen ervan hernieuwde aandacht getrokken door de ontwikkeling van de mRNA-vaccins tegen SARS-CoV-2 (beoordeeld door Verbeke et al.14). Bovendien is er opmerkelijke vooruitgang geboekt bij het gebruik van synthetisch mRNA bij kanker en andereziekten15,16. De elektroporatie van cellen is een effectieve methode om synthetisch mRNA af te leveren en voorbijgaande genetische modificatie te induceren (beoordeeld door Campillo-Davo et al.17), en het gebruik van synthetisch mRNA maakt snelle en efficiënte genexpressie in onsterfelijke fibroblasten mogelijk 18. Dit methodedocument combineert genoverexpressie met behulp van synthetisch mRNA met real-time celanalyses om migratie en invasie van tumorcellen te bestuderen. Het experimentele schema dat voor siRNA's wordt gebruikt, werkt echter niet met synthetische mRNA-transfectie, omdat het niveau van exogene eiwitten snel toeneemt en geleidelijk afneemt bij synthetische mRNA-transfectie18. Daarom is de methode aangepast om de real-time analyse van celmigratie en -invasie direct na de transfectie uit te voeren zonder de cellen extra te kweken.
Dit methodedocument toont aan dat het combineren van impedantie-gebaseerde real-time metingen met de transfectie van tumorcellen met synthetische mRNA's een snelle en uitgebreide analyse oplevert van de effecten van gen-upregulatie op tumorcelmigratie en -invasie. Dit methodedocument beschrijft gedetailleerde procedures om te meten hoe de migratie en invasie van glioblastoomcellen worden beïnvloed door de overexpressie van Crk en CrkL. Door de concentratie-afhankelijke effecten van synthetisch mRNA op tumorcelmigratie te onderzoeken, beschrijft het artikel duidelijk hoe een toename van eiwitniveaus de migratie van tumorcellen stimuleert. Daarnaast wordt een benadering gepresenteerd om de concentratie van de ECM-gel te variëren om de effecten van veranderingen in genexpressie op tumorcelinvasie te beoordelen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AlphaImager HP</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>92-13823-00</td>
			<td>Agarose gel imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-Tubulin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9026</td>
			<td>Used to detect &#945;-tubulin protein (dilution 1:3,000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CIM-plate 16</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc</td>
			<td>5665825001</td>
			<td>Cell invasion and migration plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crk antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610035</td>
			<td>Used to detect CrkI and CrkII proteins (dilution 1:1,500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CrkL antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-319</td>
			<td>Used to detect CrkL protein (dilution 1:1,500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>302002</td>
			<td>Cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td>Buffer used to wash cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30910.03</td>
			<td>Culture medium supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell VIOS 160i CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51030285</td>
			<td>CO2 incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW goat anti-mouse IgG secondary antibody</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td>926-32210</td>
			<td>Secondary antibody for Western blot analysis (dilution 1:10,000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW goat anti-rabbit IgG secondary antibody</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td>926-32211</td>
			<td>Secondary antibody for Western blot analysis&#160; (dilution 1:10,000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium chloride&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9480</td>
			<td>Used for RNA precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Extracellular matrix (ECM) gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAscript T7 transcription kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1334</td>
			<td>Used for RNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millennium RNA markers</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM7150</td>
			<td>Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini centrifuge</td>
			<td>ISC BioExpress</td>
			<td>C1301P-ISC</td>
			<td>Used to spin down cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse brain QUICK-Clone cDNA</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>637301</td>
			<td>Source of genes (inserts) for cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoQuant</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>M200PRO</td>
			<td>Nucleic acid quantification system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon electroporation system&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK5000</td>
			<td>Electroporation system1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon transfection system 10 &#181;L kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK1025</td>
			<td>Electroporation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon transfection system 100 &#181;L kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK10096</td>
			<td>Electroporation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NorthernMax denaturing gel buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM8676</td>
			<td>Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NorthernMax formaldehyde load dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM8552</td>
			<td>Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NorthernMax running buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM8671</td>
			<td>Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>W3331</td>
			<td>Used for various reactions during mRNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey CLx Imager</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td></td>
			<td>Imager for Western blot analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3.1/myc-His</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>V80020</td>
			<td>The vector into which inserts (mouse CrkI and CrkL cDNAs) were cloned</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFLAG-CMV-5a</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>E7523</td>
			<td>Source of the FLAG epitope tag</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:chloroform:isoamyl alcohol&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2069</td>
			<td>Used for DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PmeI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0560L</td>
			<td>Used to linearize the plasmids for mRNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(A) tailing kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1350</td>
			<td>Used for poly(A) tail reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene tissue culture dish (100 x 20 mm style)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353003</td>
			<td>Used for culturing cells before transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene tissue culture dish (35 x 10 mm style)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353001</td>
			<td>Used for culturing transfected cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25530049</td>
			<td>Used to remove protein in the reaction mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purifier Axiom Class II, Type C1</td>
			<td>Labconco Corporation</td>
			<td>304410001</td>
			<td>Biosafety cabinet for sterile handling of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resuspension Buffer R</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>A buffer included in the electroporation kits, MPK1025 and MPK10096. The buffer is used to resupend cells before electroporation, and its composition is proprietary information.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9780</td>
			<td>RNA decontamination solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scepter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>C85360</td>
			<td>Handheld automated cell counter&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ScriptCap 2&#39;-O-methyltransferase kit</td>
			<td>Cellscript</td>
			<td>C-SCMT0625</td>
			<td>Used for capping reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ScriptCap m7G capping system</td>
			<td>Cellscript</td>
			<td>C-SCCE0625</td>
			<td>Used for capping reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15553-035</td>
			<td>Detergent used for the proteinase K reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend XT centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75004532</td>
			<td>Benchtop centrifuge to spin down cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>Used for dissociation of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-118MG&#160;</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB15</td>
			<td>An adherent cell line derived from a human glioblastoma patient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinculin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V9131</td>
			<td>Used to detect vinculin protein (dilution 1:100,000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xCELLigence RTCA DP</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc</td>
			<td>380601050</td>
			<td>Instrument used for real-time cell analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1Electroporation parameters and other related information for various cell lines are available on the manufacturer&#39;s homepage (https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-culture/transfection/neon-transfection-system/neon-transfection-system-cell-line-data.html?).</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time quantitative measurement of tumor cell migration and invasion following synthetic mrna transfection

Tumorcellen zijn zeer beweeglijk en invasief en vertonen veranderde genexpressiepatronen. Kennis van hoe veranderingen in genexpressie de migratie en invasie van tumorcellen reguleren, is essentieel voor het begrijpen van de mechanismen van tumorcelinfiltratie in naburige gezonde weefsels en metastase. Eerder werd aangetoond dat gen-knockdown, gevolgd door de impedantie-gebaseerde real-time meting van tumorcelmigratie en -invasie, de identificatie van de genen mogelijk maakt die nodig zijn voor tumorcelmigratie en -invasie. Onlangs hebben de mRNA-vaccins tegen SARS-CoV-2 de belangstelling voor het gebruik van synthetisch mRNA voor therapeutische doeleinden vergroot. Hier werd de methode met synthetisch mRNA herzien om het effect van genoverexpressie op de migratie en invasie van tumorcellen te bestuderen. Deze studie toont aan dat verhoogde genexpressie met synthetische mRNA-transfectie gevolgd door impedantie-gebaseerde real-time meting kan helpen bij het identificeren van de genen die de migratie en invasie van tumorcellen stimuleren. Dit methodedocument geeft belangrijke details over de procedures voor het onderzoeken van het effect van veranderde genexpressie op de migratie en invasie van tumorcellen.

Crk- en CrkL-eiwitten spelen een belangrijke rol in de beweeglijkheid van veel celtypen, waaronder neuronen22, T-cellen23, fibroblasten 18,19 en een verscheidenheid aan tumorcellen13. Aangezien is gemeld dat Crk- en CrkL-eiwitten verhoogd zijn in glioblastoom24,25,26, werden de effecten van de overexpressie van CrkI, een splice-variant van Crk<s...

Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Quantitative Measurement of Tumor Cell Migration and Invasion Following Synthetic mRNA Transfection at JoVE.com

Real-Time Quantitative Measurement of Tumor Cell Migration and Invasion Following Synthetic mRNA Transfection

Veel opgereguleerde genen stimuleren de migratie en invasie van tumorcellen, wat leidt tot een slechte prognose. Het is van cruciaal belang om te bepalen welke genen de migratie en invasie van tumorcellen reguleren. Dit protocol presenteert een methode om de effecten van de verhoogde expressie van een gen op de migratie en invasie van tumorcellen in realtime te onderzoeken.

Real-time kwantitatieve meting van tumorcelmigratie en -invasie na synthetische mRNA-transfectie

Tumor cells are highly motile and invasive and display altered gene expression patterns. Knowledge of how changes in gene expression regulate tumor cell ...

Dit protocol toont aan dat het combineren van sensatieboodschapper-RNA-transactie met impedantiegebaseerde real-time metingen van celmigratie en -invasie de identificatie van genen vergemakkelijkt die de migratie en invasie van tumorcellen stimuleren. Het op impedantie gebaseerde real-time celanalysesysteem maakt kwantitatieve, continue en uitgebreide monitoring van tumorcelmigratie bij veranderingen in genexpressie mogelijk. Genen die tumoren tot overexpressie brengen en de migratie van tumorcellen stimuleren, kunnen worden geïdentificeerd als potentieel doelwit om metastase bij kankertherapie te remmen.Voeg om te beginnen 10 microliter 10x reactiebuffer, 1,5 microliter PNE-DNA en 10 microgram plasmide-DNA toe aan een microcentrifugebuis om het plasmide-DNA te lineariseren met het restrictie-enzym. Voeg nucleasevrij water toe om het reactievolume op 100 microliter te brengen. Meng het door erop te tikken en het naar beneden te draaien voordat het reactiemengsel een nacht bij 37 graden Celsius wordt geïncubeerd.Nogmaals, draai naar beneden en voeg vijf microliter 10% SDS en één microliter van 20 milligram per milliliter RNA-kwaliteit proteïnase K toe aan het reactiemengsel voordat u het mengt en afdraait. Voeg na 30 minuten incubatie bij 50 graden Celsius twee microliters 10x transcriptiebuffer, ATP, GTP, UTP, CTP en T7, en één microgram gelineariseerd DNA toe aan een microcentrifugebuis voor T7 RNA-polymerase-gemedieerde RNA-synthese. Voeg nucleasevrij water toe om het reactievolume op 20 microliter te brengen.Na een spin-down incubeer je het reactiemengsel gedurende twee uur bij 37 graden Celsius voor RNA-synthese. Draai vervolgens naar beneden en voeg een microliter DNA toe en tik vóór 15 minuten incubatie bij 37 graden Celsius om het sjabloon-DNA te verwijderen. Begin met de lithiumchlorideprecipitatie van het RNA door 10 microliter 7,5 molair lithiumchloride aan het reactiemengsel toe te voegen.Na het tikken en centrifugeren, incubeer je het reactiemengsel gedurende 30 minuten bij min 20 graden Celsius. Verwarm het RNA-monster voor het afdekken gedurende 10 minuten op 65 graden Celsius en plaats het vervolgens op ijs om af te koelen. Voeg vervolgens de componenten van de afdekreactie toe en meng door te tikken.Draai naar beneden en incubeer het reactiemengsel gedurende een uur bij 37 graden Celsius. Voor poly-A-residu draait u het monster naar beneden en voegt u de poly-A-residureactiecomponenten toe. Tik vervolgens op, draai naar beneden en incubeer het reactiemengsel gedurende twee uur bij 37 graden Celsius.Voor lithiumchlorideprecipitatie en kwantificering van het synthetische mRNA voegt u 50 microliter 7,5 molair lithiumchloride toe en voert u de lithiumchlorideprecipitatie uit. Haal een hoeveelheid ECM-gelbouillon uit de vriezer en bewaar deze op ijs. Verdun de 10 milligram per liter ECM-gel tot een werkconcentratie door 990 microliter DMEM te mengen met 10 microliter ECM-gel in een microcentrifugebuisje.Meng door voorzichtig pipetteren. Voeg 60 microliter verdunde ECM-gel toe aan elk van de 16 putjes van de bovenste kamer van de CIM-plaat. Plaats de bovenste kamer van de CIM-plaat met het plaatdeksel eraf op een beschermend plastic vel in een kooldioxide-incubator gedurende ongeveer vier uur om een gellaag te vormen.Voeg voor elektroporatie één milliliter DPBS toe aan de tumorcelsuspensie in elke buis. Tik op de celophanging en draai drie keer gedurende 10 seconden naar beneden. Verwijder het supernatans met behulp van een micropipet.Voeg 110 microliter resuspensiebuffer R toe aan de celpellet om 0,1 miljoen cellen in 10 microliter te verkrijgen. Voeg synthetisch mRNA toe aan de celkorrel om de concentratie van 0,2 tot 20 nanogram per microliter te verkrijgen, afhankelijk van het gewenste expressieniveau. Meng en resuspendeer de celpellet voorzichtig door te tikken.Elektropoleren vervolgens 10 microliter van de celsuspensie met een elektroporatiesysteem op 1.350 volt gedurende 10 milliseconden met telkens drie pulsen. Als u klaar bent, brengt u de geëlektropoleerde cellen over in een nieuwe microcentrifugebuis met 1,1 milliliter DMEM die 0,5% FBS bevat. Open het analyseprogramma door te dubbelklikken op het pictogram van de real-time celanalysesoftware.Nadat u de standaardoptie voor het instellen van het experimentpatroon hebt geopend, selecteert u de optie om drie experimenten afzonderlijk uit te voeren. Open elke houder door op het tabblad met nummers te klikken. Klik vervolgens op het tabblad Experimentnotities.Selecteer de map en sla de gegevens op door de naam van het experiment in te voeren. Klik op het tabblad Lay-out en selecteer vier putjes tegelijk om de vier dubbele putjes voor elke behandelingsaandoening in te stellen. Voer de voorbeeldinformatie in en klik op toepassen.Klik op het tabblad schema en voeg vervolgens een stap toe om de tweestapsmodus van de celimpedantiemetingen in te stellen. Klik vervolgens op toepassen om de eerste stap in te stellen. Klik nogmaals op voeg een stap toe en voer 10 minuten in voor het interval en 48 uur voor de duur van migratie en invasie.Klik vervolgens op toepassen om de tweede stap in te stellen. Voeg een uur voor de celimpedantiemeting 160 microliter DMEM met 10% serum of andere chemolokstoffen toe aan de putjes van de onderste kamer van de CIM-plaat. Monteer de bovenste kamer met de ECM-gelgecoate putten voor invasie of ongecoate putten voor migratie met de onderste kamer.Voeg voor de celmigratietest 50 microliter laag serummedium toe aan de putjes van de bovenste kamer van de CIM-plaat. Plaats de CIM-plaat en de houder van het systeem in de CO2-incubator. Klik op het tabblad Bericht.Zodra de verbinding in orde is, wordt het bericht weergegeven, de CIM-plaat is klaar voor het experiment. Pre-incubeer de geassembleerde CIM-plaat in de kooldioxide-incubator gedurende 30 tot 60 minuten vóór de real-time celanalyse om de CIM-plaat te laten wennen aan de kweekconditie. Voor de basismeting klikt u op de startknop voor elke houder.Wanneer het venster Opslaan als wordt weergegeven, slaat u het experimentele bestand op om de basislijnmeting uit te voeren. Voor het plaatsen van cellen verwijdert u de CIM-plaat uit de houder en plaatst u deze in de bioveiligheidskast op de plaathouder. Voeg vervolgens 100 microliter geëlektropoleerde cellen met 100.000 cellen toe aan de putjes van de bovenste kamer van de CIM-plaat en laat de CIM-plaat 30 minuten onder de bioveiligheidskast bij kamertemperatuur staan.Meet de celimpedantie door de volledig geassembleerde CIM-plaat terug te plaatsen in de betreffende houder. Begin de celimpedantiemeting voor de tweede stap door op de startknop van de wieg en op het tabblad Plot te klikken. Klik vervolgens op de knop Alles toevoegen en selecteer de vakjes Gemiddelde en standaarddeviatie om de gegevens in realtime te visualiseren.De elektroporatie van U 118 mg glioblastoomcellen met verschillende concentraties synthetisch crack één mRNA resulteerde in een concentratie-afhankelijke toename van flag tagged crack one-eiwit één dag na transfectie. 0,2 en twee nanogram per microliter mRNA leidden tot een niet-detecteerbare of bescheiden expressie van het exogene crack one-eiwit. 20 nanogram per microliter mRNA resulteerde in een hoger expressieniveau dan het endogene crack one-eiwit.De celmigratietest gaf aan dat de elektroporatie 0,2 of twee nanogram per microliter was, één mRNA had geen grote invloed op de celmigratie. Elektroporatie met 20 nanogram per microliter crack één mRNA leidde echter tot een duidelijke stimulatie van celmigratie, waarbij meer cellen migreerden tussen twee en 13 uur, waaruit bleek dat glioblastoomcelmigratie werd gestimuleerd door de toename van het crack één-eiwitniveau. De elektroporatie met synthetisch crack L-mRNA leidde een dag na transfectie tot een robuuste expressie van flag tagged crack L-eiwit.De invasie van de controlecellen vertraagde met de verhoogde ECM-eiwitconcentratie. Crack L-cellen die te veel tot expressie brengen, vertoonden een ECM-gelconcentratie-afhankelijke afname van celinvasie. De vergelijking tussen de controlegroep en de cellen die over de huid van crack L tot expressie komen bij verschillende ECM-gelconcentraties, gaf aan dat overexpressie van crack L over het algemeen de celinvasie door de ECM-gellaag stimuleerde.De resultaten suggereerden ook dat de twee celpopulaties differentieel werden beïnvloed door het verhogen van de ECM-gelconcentratie op verschillende tijdstippen. Cellen moeten snel, voorzichtig en volledig worden geresuspendeerd in de geresuspendeerde bubbel R mensen elektroporatie omdat lange incubatie van cellen in de geresuspendeerde bubbel R cellen ongezond maakt. Snel en langzaam migrerende tumorcellen kunnen worden geïsoleerd om verschillen tussen de twee celpopulaties te karakteriseren.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Evaluation of the Cell Invasion and Migration Process: A Comparison of the Video Microscope-based Scratch Wound Assay and the Boyden Chamber Assay

Evaluatie van de invasie van de cel en het migratieproces: een vergelijking van de Video Microscoop gebaseerde kras wond Assay en de bepaling van Boyden kamer

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration ...

Serum and Plasma Copy Number Detection Using Real-time PCR

Serum en Plasma kopiëren nummer detectie met behulp van PCR in real time

Serum and plasma cell free DNA (cfDNA) has been shown as an informative, non-invasive source of biomarkers for cancer diagnosis, prognosis, monitoring, ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Live-cel Imaging tests studie Glioblastoma Brain Tumor stamcel migratie en invasie

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real-time detectie van In Vitro Tumor cel Apoptosis geïnduceerd door CD8+ T cellen te bestuderen immuun onderdrukkende functies van Tumor-infiltreren myeloïde cellen

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager

Een eenvoudige migratie/invasie Workflow met behulp van een geautomatiseerde Live-cel Imager

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great ...

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

Volledig menselijke tumor-gebaseerde matrijs in driedimensionele sferoïde invasie assay

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...

Real-Time Monitoring of Human Glioma Cell Migration on Dorsal Root Ganglion Axon-Oligodendrocyte Co-Cultures

Real-time monitoring van menselijke Glioom Celmigratie op Rugwortel ganglion axon-oligodendrocyte co-culturen

Glioblastoma is one of the most aggressive human cancers due to extensive cellular heterogeneity and the migration properties of hGCs. In order to better ...

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

Karakterisering van de effecten van migraine remmers op de invasie van 3D-tumor Spheroid door confocale microscopie met hoge resolutie

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

Impedance-based Real-time Measurement of Cancer Cell Migration and Invasion

Impedantie-gebaseerde Real-time meting van kanker cel migratie en invasie

Cancer arises due to uncontrolled proliferation of cells initiated by genetic instability, mutations, and environmental and other stress factors. These ...

Measuring Real-time Drug Response in Organotypic Tumor Tissue Slices

Het meten van real-time drug respons in organotypic Tumor Tissue Slices

Tumor tissues are composed of cancerous cells, infiltrated immune cells, endothelial cells, fibroblasts, and extracellular matrix. This complex milieu ...