Name: real-time quantitative measurement of tumor cell migration and invasion following synthetic mrna transfection
Uploaded: 2023-06-23T13:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Quantitative Measurement of Tumor Cell Migration and Invasion Following Synthetic mRNA Transfection at JoVE.com

המחברים מודים למרכז לכתיבה רפואית ב-Children's Mercy Kansas City על עריכת כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי קרן A.R.T. של נטלי (ל- T.P.) ועל ידי מענק המועצה המייעצת של MCA Partners מבית החולים Children's Mercy Hospital (CMH) ומרכז הסרטן של אוניברסיטת קנזס (KUCC) (ל- T.P).

1. סינתזה של mRNA
הערה: עבור סינתזת mRNA, כל הריאגנטים והציוד חייבים להיות מטופלים במיוחד כדי להשבית את RNases לפני השימוש. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים על כל החומרים, המכשירים והריאגנטים המשמשים בפרוטוקול זה.
<ol><li>ליניאריזציה של DNA הערה: cDNA עכברי של CrkI ו- CrkL</...

<ol>
	<li>Palmer, T. D., Ashby, W. J., Lewis, J. D., Zijlstra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+tumor+cell+motility+to+prevent+metastasis.">Targeting tumor cell motility to prevent metastasis.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (8), 568-581 (2011).</li><li>Eccles, S. A., Box, C., Court, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration/invasion+assays+and+their+application+in+cancer+drug+discovery.">Cell migration/invasion assays and their application in cancer drug discovery.</a> Biotechnology Annual Review. 11, 391-421 (2005).</li><li>Kluiver, T. A., Alieva, M., van Vuurden, D. G., Wehrens, E. J., Rios, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invaders+exposed:+Understanding+and+targeting+tumor+cell+invasion+in+diffuse+intrinsic+pontine+glioma.">Invaders exposed: Understanding and targeting tumor cell invasion in diffuse intrinsic pontine glioma.</a> Frontiers in Oncology. 10, 92 (2020).</li><li>Xie, Q., Mittal, S., Berens, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+adaptive+glioblastoma:+An+overview+of+proliferation+and+invasion.">Targeting adaptive glioblastoma: An overview of proliferation and invasion.</a> Neuro-Oncology. 16 (12), 1575-1584 (2014).</li><li>Wee, Y., Wang, T., Liu, Y., Li, X., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pan-cancer+study+of+copy+number+gain+and+up-regulation+in+human+oncogenes.">A pan-cancer study of copy number gain and up-regulation in human oncogenes.</a> Life Sciences. 211, 206-214 (2018).</li><li>Zhao, M., Liu, Y., Qu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+epithelial-mesenchymal+transition-related+genes+increases+with+copy+number+in+multiple+cancer+types.">Expression of epithelial-mesenchymal transition-related genes increases with copy number in multiple cancer types.</a> Oncotarget. 7 (17), 24688-24699 (2016).</li><li>Pijuan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+cell+migration,+invasion,+and+adhesion+assays:+From+cell+imaging+to+data+analysis.">In vitro cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 107 (2019).</li><li>Park, T., Large, N., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+glioblastoma+phenotypes+in+vitro+establishes+cell+migration+as+a+robust+readout+of+Crk+and+CrkL+activity.">Quantitative assessment of glioblastoma phenotypes in vitro establishes cell migration as a robust readout of Crk and CrkL activity.</a> The Journal of Biological Chemistry. 296, 100390 (2021).</li><li>Urcan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+xCELLigence+impedance+analysis+of+the+cytotoxicity+of+dental+composite+components+on+human+gingival+fibroblasts.">Real-time xCELLigence impedance analysis of the cytotoxicity of dental composite components on human gingival fibroblasts.</a> Dental Materials. 26 (1), 51-58 (2010).</li><li>Limame, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+dynamic+cell+viability,+migration+and+invasion+assessments+by+novel+real-time+technology+and+classic+endpoint+assays.">Comparative analysis of dynamic cell viability, migration and invasion assessments by novel real-time technology and classic endpoint assays.</a> PLoS One. 7 (10), e46536 (2012).</li><li>Mudduluru, G., Large, N., Park, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impedance-based+real-time+measurement+of+cancer+cell+migration+and+invasion.">Impedance-based real-time measurement of cancer cell migration and invasion.</a> Journal of Visualized Experiments. (158), e60997 (2020).</li><li>Feller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crk+family+adaptors-signalling+complex+formation+and+biological+roles.">Crk family adaptors-signalling complex formation and biological roles.</a> Oncogene. 20 (44), 6348-6371 (2001).</li><li>Park, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crk+and+CrkL+as+therapeutic+targets+for+cancer+treatment.">Crk and CrkL as therapeutic targets for cancer treatment.</a> Cells. 10 (4), 739 (2021).</li><li>Verbeke, R., Lentacker, I., De Smedt, S. C., Dewitte, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dawn+of+mRNA+vaccines:+The+COVID-19+case.">The dawn of mRNA vaccines: The COVID-19 case.</a> Journal of Controlled Release. 333, 511-520 (2021).</li><li>Heine, A., Juranek, S., Brossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+and+immunological+effects+of+mRNA+vaccines+in+malignant+diseases.">Clinical and immunological effects of mRNA vaccines in malignant diseases.</a> Molecular Cancer. 20 (1), 52 (2021).</li><li>Kwon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+synthetic+mRNA:+In+vitro+synthesis+of+mRNA+and+its+applications+in+regenerative+medicine.">Emergence of synthetic mRNA: In vitro synthesis of mRNA and its applications in regenerative medicine.</a> Biomaterials. 156, 172-193 (2018).</li><li>Campillo-Davo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ins+and+outs+of+messenger+RNA+electroporation+for+physical+gene+delivery+in+immune+cell-based+therapy.">The ins and outs of messenger RNA electroporation for physical gene delivery in immune cell-based therapy.</a> Pharmaceutics. 13 (3), 396 (2021).</li><li>Park, T., Koptyra, M., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+requires+CT10+regulator+of+kinase+(Crk)+and+Crk-like+(CrkL).">Fibroblast growth requires CT10 regulator of kinase (Crk) and Crk-like (CrkL).</a> The Journal of Biological Chemistry. 291 (51), 26273-26290 (2016).</li><li>Park, T. J., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+roles+of+Crk+and+CrkL+in+fibroblast+structure+and+motility.">Essential roles of Crk and CrkL in fibroblast structure and motility.</a> Oncogene. 33 (43), 5121-5132 (2014).</li><li>Chou, P. P., Jaynes, P. K., King, B. P., Chapman, E., Bailey, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+comparison+between+conventional+(method-I)+and+reverse+(method-Ii)+pipetting.">Precision comparison between conventional (method-I) and reverse (method-Ii) pipetting.</a> Clinical Chemistry. 30 (6), 958 (1984).</li><li>Pushparaj, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+the+micropipetting+techniques+in+biomedical+sciences:+A+fundamental+prerequisite+in+good+laboratory+practice.">Revisiting the micropipetting techniques in biomedical sciences: A fundamental prerequisite in good laboratory practice.</a> Bioinformation. 16 (1), 8-12 (2020).</li><li>Park, T. J., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crk+and+Crk-like+play+essential+overlapping+roles+downstream+of+disabled-1+in+the+Reelin+pathway.">Crk and Crk-like play essential overlapping roles downstream of disabled-1 in the Reelin pathway.</a> The Journal of Neuroscience. 28 (50), 13551-13562 (2008).</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRK+proteins+selectively+regulate+T+cell+migration+into+inflamed+tissues.">CRK proteins selectively regulate T cell migration into inflamed tissues.</a> The Journal of Clinical Investigation. 125 (3), 1019-1032 (2015).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+adaptor+protein+Crk+is+indispensable+for+malignant+feature+of+glioblastoma+cell+line+KMG4.">Signaling adaptor protein Crk is indispensable for malignant feature of glioblastoma cell line KMG4.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 362 (4), 976-981 (2007).</li><li>Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+regulation+of+Abl+kinase+by+Crk+Y251+and+Abi1+controls+invasive+phenotypes+in+glioblastoma.">Reciprocal regulation of Abl kinase by Crk Y251 and Abi1 controls invasive phenotypes in glioblastoma.</a> Oncotarget. 6 (35), 37792-37807 (2015).</li><li>Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crk+tyrosine+phosphorylation+regulates+PDGF-BB-inducible+Src+activation+and+breast+tumorigenicity+and+metastasis.">Crk tyrosine phosphorylation regulates PDGF-BB-inducible Src activation and breast tumorigenicity and metastasis.</a> Molecular Cancer Research. 16 (1), 173-183 (2018).</li><li>Raudenska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engine+shutdown:+Migrastatic+strategies+and+prevention+of+metastases.">Engine shutdown: Migrastatic strategies and prevention of metastases.</a> Trends in Cancer. 9 (4), 293-308 (2023).</li><li>Decaestecker, C., Debeir, O., Van Ham, P., Kiss, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+anti-migratory+drugs+be+screened+in+vitro?+A+review+of+2D+and+3D+assays+for+the+quantitative+analysis+of+cell+migration.">Can anti-migratory drugs be screened in vitro? A review of 2D and 3D assays for the quantitative analysis of cell migration.</a> Medicinal Research Reviews. 27 (2), 149-176 (2007).</li><li>Farasani, A., Darbre, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+exposure+to+triclosan+increases+migration+and+invasion+of+human+breast+epithelial+cells+in+vitro.">Long-term exposure to triclosan increases migration and invasion of human breast epithelial cells in vitro.</a> Journal of Applied Toxicology. 41 (7), 1115-1126 (2021).</li><li>Hanusova, V., Skalova, L., Kralova, V., Matouskova, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+flubendazole+on+adhesion+and+migration+in+SW480+and+SW620+colon+cancer+cells.">The effect of flubendazole on adhesion and migration in SW480 and SW620 colon cancer cells.</a> Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 18 (6), 837-846 (2018).</li><li>Lago-Baameiro, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PARK7/DJ-1+inhibition+decreases+invasion+and+proliferation+of+uveal+melanoma+cells.">PARK7/DJ-1 inhibition decreases invasion and proliferation of uveal melanoma cells.</a> Tumori. 109 (1), 47-53 (2023).</li><li>Escalona, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knock+down+of+TIMP-2+by+siRNA+and+CRISPR/Cas9+mediates+diverse+cellular+reprogramming+of+metastasis+and+chemosensitivity+in+ovarian+cancer.">Knock down of TIMP-2 by siRNA and CRISPR/Cas9 mediates diverse cellular reprogramming of metastasis and chemosensitivity in ovarian cancer.</a> Cancer Cell International. 22 (1), 422 (2022).</li><li>Mosca, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+S-adenosyl-L-methionine+on+the+invasion+and+migration+of+head+and+neck+squamous+cancer+cells+and+analysis+of+the+underlying+mechanisms.">Effects of S-adenosyl-L-methionine on the invasion and migration of head and neck squamous cancer cells and analysis of the underlying mechanisms.</a> International Journal of Oncology. 56 (5), 1212-1224 (2020).</li><li>Zhao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGI174+protein+and+its+functional+domain+peptides+exert+antitumour+effects+on+renal+cell+carcinoma.">VEGI174 protein and its functional domain peptides exert antitumour effects on renal cell carcinoma.</a> International Journal of Oncology. 54 (1), 390-398 (2019).</li><li>Witte, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta1-induced+cell+migration+in+pancreatic+carcinoma+cells+is+RAC1+and+NOX4-dependent+and+requires+RAC1+and+NOX4-dependent+activation+of+p38+MAPK.">TGF-beta1-induced cell migration in pancreatic carcinoma cells is RAC1 and NOX4-dependent and requires RAC1 and NOX4-dependent activation of p38 MAPK.</a> Oncology Reports. 38 (6), 3693-3701 (2017).</li><li>Bui, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+aquaporin+3+expression+by+the+AhR+pathway+is+critical+to+cell+migration.">Regulation of aquaporin 3 expression by the AhR pathway is critical to cell migration.</a> Toxicological Sciences. 149 (1), 158-166 (2016).</li><li>Tsuji, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+different+cell-detaching+methods+on+the+viability+and+cell+surface+antigen+expression+of+synovial+mesenchymal+stem+cells.">Effects of different cell-detaching methods on the viability and cell surface antigen expression of synovial mesenchymal stem cells.</a> Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).</li><li>Frandsen, S. K., McNeil, A. K., Novak, I., McNeil, P. L., Gehl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Difference+in+membrane+repair+capacity+between+cancer+cell+lines+and+a+normal+cell+line.">Difference in membrane repair capacity between cancer cell lines and a normal cell line.</a> The Journal of Membrane Biology. 249 (4), 569-576 (2016).</li></ol>

הגירה ופלישה הן תכונות חשובות של תאי גידול. מדידת התנועתיות של תאי הגידול והבנת המנגנון הבסיסי השולט בתנועתיות תאי הגידול מספקים תובנות קריטיות לגבי התערבויות טיפוליות 2,27. מספר שיטות פותחו לחקר נדידת תאים7. בדיקת ריפוי פצעים באמצעות שריטות או ...

תנועתיות תאי הגידול ממלאת תפקיד מכריע בגרורות 1,2. התפשטות תאי הגידול לרקמות בריאות שכנות ומרוחקות מקשה על הטיפול בסרטן ותורמת להישנות 3,4. לכן, חיוני להבין את מנגנוני תנועתיות תאי הגידול ולפתח אסטרטגיות טיפוליות רלוונטיות. מאחר שלתאי גידול רבים יש שינויים בפרופילי ביטוי הגנים, חיוני להבין אילו שינויים בפרופיל ביטוי הגנים מובילים לשינוי בתנועתיות תאי הגידול 5,6.
מספר בדיקות פותחו כדי למדוד נדידת תאים במבחנה. חלק מהבדיקות מספקות מידע מוגבל בלבד מכיוון שהן מאפשרות מדידות רק בנקודות זמן ספציפיות, בעוד שאחרות מציעות מידע מקיף על תנועתיות תאי הגידול בזמן אמת7. למרות שרבים ממבחני תנועתיות התא הללו יכולים לספק תוצאות כמותיות בזמן נתון או בנקודת הקצה, הם אינם מספקים מידע מפורט מספיק על שינויים דינמיים בקצב נדידת התאים במהלך תקופת הניסוי. בנוסף, ייתכן שיהיה קשה לבחון שינויים אפשריים בקצב נדידת התאים בהתאם לתכנון הניסוי, סוגי התאים ומספרי התאים. יתר על כן, ניתן לחקור את ההשפעות של טיפולים לא מסובכים על ידי כימות פשוט של מבחני תנועתיות מסורתיים, אך ייתכן שיהיה צורך בכימות מתוחכם יותר כדי לחקור את ההשפעות המורכבות של טיפולים משולבים שונים8.
פותח מכשיר לניטור הזרם החשמלי של צלחת מיקרוטיטר המכוסה היטב במיקרואלקטרודות9. היצמדות התאים לפני השטח של הבאר מעכבת את זרימת האלקטרונים, והעכבה מתואמת עם הקישור הכמותי והאיכותי של התאים. נוכחות המיקרואלקטרודות על קרקעית הבאר מאפשרת מדידה של הידבקות תאים, התפשטות והתפשטות. נוכחות המיקרואלקטרודות מתחת לקרום מיקרו-נקבובי של החדר העליון מאפשרת מדידה של נדידת תאים ופלישה לתוך החדר התחתון, כאשר החדר העליון מצופה בחלבוני מטריצה חוץ-תאיים (ECM) כדי לאפשר פלישה10.
בעבר, הוכח כי מדידות מבוססות עכבה בזמן אמת של נדידת תאי הגידול ופלישתם מספקות נתונים בזמן אמת במהלך הניסוי כולו, כמו גם השוואות וכימות מיידיות בתנאי ניסוי שונים11. במאמר שיטה זה, הושרה הפלת גנים כדי לבחון את תפקידם של חלבונים בעלי עניין בנדידת תאי גידול ופלישה. מכיוון שאפקט הפלה גנטי מלא בתנאי הניסוי שנבדקו לקח 3-4 ימים לאחר אלקטרופורציה עם רנ"א מפריע קטן (siRNAs)8, התאים צופו מחדש לאחר האלקטרופורציה ונקצרו מחדש 3 ימים לאחר מכן לצורך מדידה מבוססת עכבה בזמן אמת של נדידת תאי הגידול ופלישתם.
הרגולטור CT10 של קינאז (Crk) ודמוי Crk (CrkL) הם חלבוני מתאם המתווכים אינטראקציות חלבון-חלבון במורד הזרם של מסלולים שונים של קולטן גורם גדילה קינאז ומסלולים לא קולטנים טירוזין קינאז12. רמות גבוהות של חלבוני Crk ו-CrkL תורמות לפרוגנוזה גרועה במספר סוגי סרטן בבני אדם, כולל גליובלסטומה13. עם זאת, לא ברור כיצד חלבוני Crk ו-CrkL גבוהים מובילים לפרוגנוזה גרועה. לכן, חשוב להגדיר את ההשפעה של ביטוי יתר Crk ו- CrkL על תפקודי תאי הגידול. בעבר, בוצע מחקר הפלה גנטית כדי להדגים כי רמות אנדוגניות של חלבוני Crk ו- CrkL נדרשות עבור נדידת תאי גליובלסטומה ופלישה8. כאן, פותחה מערכת בדיקה שונה כדי להתמודד עם ההשפעה של ביטוי יתר Crk ו- CrkL על נדידת תאי הגידול ופלישה.
לאחרונה, הסינתזה במבחנה של mRNA ויישומיו הטיפוליים משכו תשומת לב מחודשת עקב פיתוח חיסוני mRNA נגד SARS-CoV-2 (נסקר על ידי Verbeke et al.14). בנוסף, התקדמות יוצאת דופן נעשתה בשימוש mRNA סינתטי בסרטן ומחלות אחרות15,16. אלקטרופורציה של תאים היא שיטה יעילה להעברת mRNA סינתטי ולהשראת שינוי גנטי חולף (נבדק על ידי Campillo-Davo et al.17), והשימוש ב-mRNA סינתטי מאפשר ביטוי גנים מהיר ויעיל בפיברובלסטים אימורטליים18. מאמר שיטה זה משלב ביטוי יתר של גנים באמצעות mRNA סינתטי עם אנליזות תאים בזמן אמת כדי לחקור נדידה ופלישה של תאי גידול. עם זאת, סכמת הניסוי המשמשת עבור siRNA אינה פועלת עם transfection mRNA סינתטי, כמו רמת חלבונים אקסוגניים עולה במהירות ויורדת בהדרגה עם transfection mRNA סינתטי18. לכן, השיטה שונתה כדי לבצע ניתוח בזמן אמת של נדידת תאים ופלישה מיד לאחר transfection מבלי בנוסף תרבית את התאים.
מאמר שיטה זה מדגים כי שילוב מדידות מבוססות עכבה בזמן אמת עם טרנספקציה של תאי גידול עם mRNA סינתטי מספק ניתוח מהיר ומקיף של ההשפעות של upregulation גנים על נדידת תאי הגידול ופלישה. מאמר שיטה זה מתאר נהלים מפורטים למדידת האופן שבו הגירה ופלישה של תאי גליובלסטומה מושפעים מביטוי יתר של Crk ו- CrkL. על ידי בחינת ההשפעות תלויות הריכוז של mRNA סינתטי על נדידת תאי גידול, המאמר מתאר בבירור כיצד עלייה ברמות החלבון מעודדת נדידת תאי גידול. בנוסף, מוצגת גישה של שינוי ריכוז ג'ל ECM כדי להעריך את ההשפעות של שינויים בביטוי גנים על פלישת תאי גידול.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AlphaImager HP</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>92-13823-00</td>
			<td>Agarose gel imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-Tubulin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9026</td>
			<td>Used to detect &#945;-tubulin protein (dilution 1:3,000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CIM-plate 16</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc</td>
			<td>5665825001</td>
			<td>Cell invasion and migration plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crk antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610035</td>
			<td>Used to detect CrkI and CrkII proteins (dilution 1:1,500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CrkL antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-319</td>
			<td>Used to detect CrkL protein (dilution 1:1,500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>302002</td>
			<td>Cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td>Buffer used to wash cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30910.03</td>
			<td>Culture medium supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell VIOS 160i CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51030285</td>
			<td>CO2 incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW goat anti-mouse IgG secondary antibody</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td>926-32210</td>
			<td>Secondary antibody for Western blot analysis (dilution 1:10,000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW goat anti-rabbit IgG secondary antibody</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td>926-32211</td>
			<td>Secondary antibody for Western blot analysis&#160; (dilution 1:10,000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium chloride&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9480</td>
			<td>Used for RNA precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Extracellular matrix (ECM) gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAscript T7 transcription kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1334</td>
			<td>Used for RNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millennium RNA markers</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM7150</td>
			<td>Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini centrifuge</td>
			<td>ISC BioExpress</td>
			<td>C1301P-ISC</td>
			<td>Used to spin down cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse brain QUICK-Clone cDNA</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>637301</td>
			<td>Source of genes (inserts) for cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoQuant</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>M200PRO</td>
			<td>Nucleic acid quantification system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon electroporation system&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK5000</td>
			<td>Electroporation system1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon transfection system 10 &#181;L kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK1025</td>
			<td>Electroporation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon transfection system 100 &#181;L kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK10096</td>
			<td>Electroporation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NorthernMax denaturing gel buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM8676</td>
			<td>Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NorthernMax formaldehyde load dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM8552</td>
			<td>Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NorthernMax running buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM8671</td>
			<td>Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>W3331</td>
			<td>Used for various reactions during mRNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey CLx Imager</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td></td>
			<td>Imager for Western blot analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3.1/myc-His</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>V80020</td>
			<td>The vector into which inserts (mouse CrkI and CrkL cDNAs) were cloned</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFLAG-CMV-5a</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>E7523</td>
			<td>Source of the FLAG epitope tag</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:chloroform:isoamyl alcohol&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2069</td>
			<td>Used for DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PmeI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0560L</td>
			<td>Used to linearize the plasmids for mRNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(A) tailing kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1350</td>
			<td>Used for poly(A) tail reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene tissue culture dish (100 x 20 mm style)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353003</td>
			<td>Used for culturing cells before transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene tissue culture dish (35 x 10 mm style)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353001</td>
			<td>Used for culturing transfected cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25530049</td>
			<td>Used to remove protein in the reaction mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purifier Axiom Class II, Type C1</td>
			<td>Labconco Corporation</td>
			<td>304410001</td>
			<td>Biosafety cabinet for sterile handling of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resuspension Buffer R</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>A buffer included in the electroporation kits, MPK1025 and MPK10096. The buffer is used to resupend cells before electroporation, and its composition is proprietary information.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9780</td>
			<td>RNA decontamination solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scepter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>C85360</td>
			<td>Handheld automated cell counter&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ScriptCap 2&#39;-O-methyltransferase kit</td>
			<td>Cellscript</td>
			<td>C-SCMT0625</td>
			<td>Used for capping reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ScriptCap m7G capping system</td>
			<td>Cellscript</td>
			<td>C-SCCE0625</td>
			<td>Used for capping reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15553-035</td>
			<td>Detergent used for the proteinase K reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend XT centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75004532</td>
			<td>Benchtop centrifuge to spin down cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>Used for dissociation of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-118MG&#160;</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB15</td>
			<td>An adherent cell line derived from a human glioblastoma patient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinculin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V9131</td>
			<td>Used to detect vinculin protein (dilution 1:100,000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xCELLigence RTCA DP</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc</td>
			<td>380601050</td>
			<td>Instrument used for real-time cell analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1Electroporation parameters and other related information for various cell lines are available on the manufacturer&#39;s homepage (https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-culture/transfection/neon-transfection-system/neon-transfection-system-cell-line-data.html?).</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time quantitative measurement of tumor cell migration and invasion following synthetic mrna transfection

תאי הגידול הם תנועתיים ופולשניים מאוד ומציגים דפוסי ביטוי גנים משתנים. הידע על האופן שבו שינויים בביטוי גנים מווסתים נדידה ופלישה של תאי גידול חיוני להבנת מנגנוני חדירת תאי הגידול לרקמות בריאות שכנות וגרורות. בעבר, הוכח כי הפלת גנים ואחריה מדידה מבוססת עכבה בזמן אמת של נדידת תאי הגידול ופלישתם, מאפשרת לזהות את הגנים הדרושים לנדידת תאי הגידול ולפלישתם. לאחרונה, חיסוני mRNA נגד SARS-CoV-2 הגבירו את העניין בשימוש ב- mRNA סינתטי למטרות טיפוליות. כאן, השיטה באמצעות mRNA סינתטי תוקנה כדי לחקור את ההשפעה של ביטוי יתר של גנים על נדידת תאי הגידול ופלישה. מחקר זה מדגים כי ביטוי גנים מוגבר עם טרנספקציה סינתטית של mRNA ואחריו מדידה בזמן אמת מבוססת עכבה עשויים לסייע בזיהוי הגנים המעודדים נדידת תאי גידול ופלישה. נייר שיטה זה מספק פרטים חשובים על ההליכים לבחינת ההשפעה של ביטוי גנים שונה על נדידת תאי הגידול ופלישתם.

חלבוני Crk ו-CrkL ממלאים תפקידים חשובים בתנועתיות של סוגי תאים רבים, כולל תאי עצב22, תאי T23, פיברובלסטים 18,19 ומגוון תאי גידול13. מאחר שחלבוני Crk ו-CrkL דווחו כבעלי רמות גבוהות בגליובלסטומה24,25,26, נחקרו במחקר זה ההשפע?...

Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Quantitative Measurement of Tumor Cell Migration and Invasion Following Synthetic mRNA Transfection at JoVE.com

Real-Time Quantitative Measurement of Tumor Cell Migration and Invasion Following Synthetic mRNA Transfection

גנים רבים מעודכנים, מעודדים נדידה ופלישה של תאי גידול, מה שמוביל לפרוגנוזה גרועה. קביעה אילו גנים מווסתים נדידה ופלישה של תאי גידול היא קריטית. פרוטוקול זה מציג שיטה לחקר ההשפעות של ביטוי מוגבר של גן על נדידה ופלישה של תאי גידול בזמן אמת.

מדידה כמותית בזמן אמת של נדידת תאי גידול ופלישת תאים סרטניים בעקבות טרנספקציה סינתטית של mRNA

Tumor cells are highly motile and invasive and display altered gene expression patterns. Knowledge of how changes in gene expression regulate tumor cell ...

פרוטוקול זה מדגים כי שילוב של העברת רנ"א שליח תחושה עם מדידות מבוססות עכבה בזמן אמת של נדידת תאים ופלישה מקלים על זיהוי גנים המעודדים נדידת תאים סרטניים ופלישה. מערכת ניתוח תאים בזמן אמת מבוססת עכבה מאפשרת ניטור כמותי, רציף ומקיף של נדידת תאי הגידול בעקבות שינויים בביטוי גנים. גנים המבטאים יתר על המידה גידולים ומעודדים נדידת תאי גידול יכולים להיות מזוהים כמטרה פוטנציאלית לעיכוב גרורות בטיפול בסרטן.כדי להתחיל, הוסף 10 מיקרוליטר של חיץ תגובה 10x, 1.5 מיקרוליטר של PNE אחד, ו 10 מיקרוגרם של DNA פלסמיד לצינור מיקרו צנטריפוגה כדי ליניאריזציה של DNA פלסמיד עם אנזים הגבלה. הוסף מים ללא נוקלאז כדי להביא את נפח התגובה ל -100 מיקרוליטר. ערבבו אותו על ידי הקשה וסחיטה לפני הדגירה על תערובת התגובה ב 37 מעלות צלזיוס במשך הלילה.שוב, סובבו למטה והוסיפו חמישה מיקרוליטרים של 10% SDS, ומיקרוליטר אחד של 20 מיליגרם למיליליטר של פרוטאינאז K בדרגת RNA לתערובת התגובה לפני ערבוב וסיבוב כלפי מטה. לאחר 30 דקות של דגירה בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס, יש להוסיף שני מיקרוליטרים כל אחד של מאגר שעתוק 10x, ATP, GTP, UTP, CTP ו-T7, ומיקרוגרם אחד של DNA ליניארי לצינור מיקרו-צנטריפוגה עבור סינתזת RNA בתיווך T7 RNA פולימראז. הוסף מים ללא נוקלאז כדי להביא את נפח התגובה ל -20 מיקרוליטר.לאחר ספין, לדגור על תערובת התגובה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים עבור סינתזת RNA. לאחר מכן, סובבו למטה והוסיפו מיקרוליטר אחד של דנ"א והקישו לפני 15 דקות דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי להסיר את הדנ"א של התבנית. התחל את משקעי הליתיום כלוריד של הרנ"א על ידי הוספת 10 מיקרוליטר של 7.5 ליתיום כלוריד מולארי לתערובת התגובה.לאחר הקשה וסחרור, יש לדגור על תערובת התגובה בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. למכסה, מחממים את דגימת הרנ"א בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולאחר מכן מניחים אותה על קרח לקירור. לאחר מכן, הוסף רכיבי תגובת מכסה וערבב על ידי הקשה.סובבו מטה ודגרו על תערובת התגובה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה. עבור poly-A tailing, סובב את הדגימה כלפי מטה והוסף את רכיבי תגובת הזנב poly-A. לאחר מכן טפחו, סובבו כלפי מטה ודגרו על תערובת התגובה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים.עבור משקעים ליתיום כלורי וכימות של mRNA סינתטי, להוסיף 50 מיקרוליטר של 7.5 ליתיום כלוריד מולארי ולבצע את משקעי ליתיום כלוריד. הסר aliquot של ציר ג'ל ECM מהמקפיא ולשמור אותו על קרח. לדלל את 10 מיליגרם לליטר ג'ל ECM לריכוז עבודה על ידי ערבוב 990 מיקרוליטר של DMEM עם 10 מיקרוליטר של ג'ל ECM בצינור מיקרו צנטריפוגה.מערבבים על ידי פיפטינג עדין. הוסף 60 מיקרוליטר של ג'ל ECM מדולל לכל אחת מ -16 הבארות של החדר העליון של צלחת CIM. הניחו את החדר העליון של צלחת CIM עם כיסוי הצלחת על יריעת פלסטיק מגנה בתוך אינקובטור פחמן דו חמצני למשך כארבע שעות ליצירת שכבת ג'ל.עבור אלקטרופורציה, הוסף מיליליטר אחד של DPBS לתרחיף תאי הגידול בכל צינור. הקש על מתלה התא וסובב מטה שלוש פעמים למשך 10 שניות. מוציאים את הסופרנאטנט בעזרת מיקרו פיפטה.הוסף 110 מיקרוליטר של חיץ תרחיף R לכדורית התא כדי לקבל 0.1 מיליון תאים ב -10 מיקרוליטר. הוסף mRNA סינתטי לכדורית התא כדי לקבל ריכוז של 0.2 עד 20 ננוגרם למיקרוליטר בהתאם לרמת הביטוי הרצויה. ערבבו והשעו מחדש את כדורית התא בעדינות על ידי הקשה.לאחר מכן, electroporate 10 מיקרוליטר של השעיית התא עם מערכת electroporation ב 1, 350 וולט במשך 10 אלפיות השנייה עם שלוש פעימות בכל פעם. לאחר שתסיים, העבר את התאים המחושלים לצינור מיקרו צנטריפוגה חדש עם 1.1 מיליליטר DMEM המכיל 0.5% FBS. פתח את תוכנית הניתוח על ידי לחיצה כפולה על סמל התוכנה לניתוח תאים בזמן אמת.לאחר פתיחת אפשרות ברירת המחדל להגדרת תבנית ניסוי, בחר באפשרות להפעלת שלושה ניסויים בנפרד. פתח כל עריסה על ידי לחיצה על כרטיסיית המספרים. לאחר מכן, לחץ על הכרטיסיה הערות ניסוי.בחר בתיקייה ושמור את הנתונים על-ידי הזנת שם הניסוי. לחץ על כרטיסיית הפריסה ובחר ארבע בארות בכל פעם כדי להגדיר את ארבע הבארות הכפולות עבור כל תנאי טיפול. הזן את המידע לדוגמה ולחץ על החל.לחץ על הכרטיסיה לוח זמנים ולאחר מכן הוסף שלב כדי להגדיר את המצב הדו-שלבי של מדידות עכבת התא. לאחר מכן, לחץ על החל כדי להגדיר את השלב הראשון. לחץ על הוסף שלב שוב והזן 10 דקות למרווח ו -48 שעות למשך ההגירה והפלישה.לאחר מכן, לחץ על החל כדי להגדיר את השלב השני. שעה לפני מדידת עכבת התא, הוסף 160 מיקרוליטר DMEM המכיל 10% סרום או מושכי כימותרפיה אחרים לבארות של החדר התחתון של צלחת CIM. להרכיב את החדר העליון המכיל בארות מצופות ג'ל ECM לפלישה או בארות לא מצופות להגירה עם החדר התחתון.לבדיקת נדידת תאים, הוסף 50 מיקרוליטר של מדיום סרום נמוך לבארות של החדר העליון של צלחת CIM. מקם את צלחת CIM ואת עריסת המערכת באינקובטור CO2. לחץ על כרטיסיית ההודעה.ברגע שהחיבור תקין, מוצגת הודעה, לוח CIM מוכן לניסוי. יש לדגור מראש על צלחת CIM שהורכבה באינקובטור הפחמן הדו-חמצני למשך 30 עד 60 דקות לפני ניתוח התאים בזמן אמת כדי להתאים את צלחת CIM למצב התרבית. לקריאת קו הבסיס, לחץ על לחצן התחל עבור כל עריסה.כאשר החלון שמירה בשם מופיע, שמור את הקובץ הניסיוני כדי לבצע את קריאת קו הבסיס. להושבה בתאים, הסר את צלחת CIM מהעריסה והנח אותה בארון הבטיחות הביולוגית על מחזיק הצלחת. לאחר מכן הוסף 100 מיקרוליטר של תאים מחושמלים המכילים 100, 000 תאים לבארות של החדר העליון של צלחת CIM, והשאיר את צלחת CIM מתחת לארון הבטיחות הביולוגית למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.מדוד את עכבת התא על-ידי הזזת לוח CIM שהורכב במלואו בחזרה לעריסה המתאימה. התחל את מדידת עכבת התא לשלב השני על ידי לחיצה על כפתור התחל העריסה ועל הכרטיסייה התוויית. לאחר מכן לחץ על הלחצן הוסף הכל ובחר את תיבות הממוצע וסטיית התקן כדי להמחיש את הנתונים בזמן אמת.אלקטרופורציה של תאי גליובלסטומה U 118 מ"ג עם ריכוזים משתנים של קראק סינתטי mRNA אחד הביאה לעלייה תלוית ריכוז בקראק מסומן בחלבון אחד יום לאחר ההדבקה. 0.2 ושני ננוגרם למיקרוליטר mRNA הובילו לביטוי צנוע או בלתי ניתן לגילוי של הסדק האקסוגני חלבון אחד. 20 ננוגרם למיקרוליטר mRNA הביא לרמת ביטוי גבוהה יותר מאשר הקראק האנדוגני חלבון אחד.בדיקת נדידת התאים הצביעה על כך שהאלקטרופורציה הייתה 0.2 או שני ננוגרם לכל סדק מיקרוליטר, mRNA אחד לא השפיע באופן משמעותי על נדידת תאים. עם זאת, אלקטרופורציה עם 20 ננוגרם לכל סדק מיקרוליטר mRNA אחד הובילה לגירוי ברור של נדידת תאים, כאשר תאים נוספים נדדו בין שעתיים ל -13 שעות וחשפו כי נדידת תאי גליובלסטומה עוררה על ידי העלייה בסדק ברמת חלבון אחד. האלקטרופורציה עם סדק סינתטי L mRNA הובילה לביטוי חזק של דגל מתויג סדק L חלבון יום לאחר טרנספקציה.הפלישה של תאי הבקרה הואטה עם ריכוז חלבון ECM מוגבר. סדק L מעל תאים מבטאים הראה ירידה תלוית ריכוז ג'ל ECM בפלישת תאים. ההשוואה בין הבקרה לבין סדק L על פני תאים המבטאים תאים בריכוזי ג'ל ECM שונים הצביעה על כך שביטוי יתר של סדק L עורר בדרך כלל פלישה של תאים דרך שכבת הג'ל ECM.התוצאות גם הצביעו על כך ששתי אוכלוסיות התאים הושפעו באופן דיפרנציאלי מעלייה בריכוז ג'ל ECM בנקודות זמן שונות. תאים צריכים להיות מושעים מחדש במהירות, בעדינות, ולחלוטין בבועה R מרחפת אנשים electroporation כי דגירה ארוכה של תאים בבועה R מרחף מחדש עושה תאים לא בריאים. ניתן לבודד תאי גידול נודדים במהירות ובאיטיות כדי לאפיין הבדלים בין שתי אוכלוסיות התאים.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Evaluation of the Cell Invasion and Migration Process: A Comparison of the Video Microscope-based Scratch Wound Assay and the Boyden Chamber Assay

הערכה של הפלישה התא, תהליך ההעברה: השוואה של השריטה מבוסס-מיקרוסקופ וידאו פצע Assay ואת וזמינותו קאמרית בוידן

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration ...

Serum and Plasma Copy Number Detection Using Real-time PCR

סרום ו פלזמה עותק מספר זיהוי באמצעות PCR בזמן אמת

Serum and plasma cell free DNA (cfDNA) has been shown as an informative, non-invasive source of biomarkers for cancer diagnosis, prognosis, monitoring, ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

מבחני הדמיה לחיות תאים מחקר המוח גליובלסטומה גידול תאי גזע ההעברה, הפלישה

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

זיהוי בזמן אמת של הגידול Vitro תאים אפופטוזיס שנגזרות CD8+ T תאים ללמוד פונקציות החיסונית מדכא גידולים הסתננות התאים מיאלואידית

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager

זרימת עבודה פשוטה הגירה/הפלישה באמצעות Imager אוטומטיות של תאים חיים

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great ...

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

מטריקס מבוסס על גידול אדם במלואו באופן שלוש מימדי הפלישה ספרואיד שיטת

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...

Real-Time Monitoring of Human Glioma Cell Migration on Dorsal Root Ganglion Axon-Oligodendrocyte Co-Cultures

ניטור בזמן אמת של הגירה של תא האדם Glioma על גבי גנגליון שורש-אוליגודנדרוציטים שיתוף תרבויות

Glioblastoma is one of the most aggressive human cancers due to extensive cellular heterogeneity and the migration properties of hGCs. In order to better ...

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

אפיון ההשפעות של מעכבי Migrastatic על הפלישה 3D הגידול ספרואיד על ידי מיקרוסקופ Confocal וקד ברזולוציה גבוהה

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

Impedance-based Real-time Measurement of Cancer Cell Migration and Invasion

עכבה מבוססי מדידה בזמן אמת של סרטן הגירה תאים ופלישה

Cancer arises due to uncontrolled proliferation of cells initiated by genetic instability, mutations, and environmental and other stress factors. These ...

Measuring Real-time Drug Response in Organotypic Tumor Tissue Slices

מדידת תגובת התרופה בזמן אמת בפרוסות רקמה אורגנוטימית לגידול

Tumor tissues are composed of cancerous cells, infiltrated immune cells, endothelial cells, fibroblasts, and extracellular matrix. This complex milieu ...