Name: real-time quantitative measurement of tumor cell migration and invasion following synthetic mrna transfection
Uploaded: 2023-06-23T13:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Quantitative Measurement of Tumor Cell Migration and Invasion Following Synthetic mRNA Transfection at JoVE.com

Gli autori ringraziano il Medical Writing Center del Children's Mercy Kansas City per aver curato questo manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione A.R.T. di Natalie (a T.P.) e da una sovvenzione del Comitato Consultivo dei Partner MCA da parte del Children's Mercy Hospital (CMH) e del Centro Oncologico dell'Università del Kansas (KUCC) (a T.P.).

1. Sintesi dell'mRNA
NOTA: Per la sintesi dell'mRNA, tutti i reagenti e le apparecchiature devono essere trattati in modo speciale per inattivare le RNasi prima dell'uso. Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli su tutti i materiali, gli strumenti e i reagenti utilizzati in questo protocollo.
<ol><li>Linearizzazione del DNA NOTA: I cDNA murini di CrkI e CrkL sono stati clonati nel vettore di espressione pFLAG-CMV-5a per aggiungere il tag de...

<ol>
	<li>Palmer, T. D., Ashby, W. J., Lewis, J. D., Zijlstra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+tumor+cell+motility+to+prevent+metastasis.">Targeting tumor cell motility to prevent metastasis.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (8), 568-581 (2011).</li><li>Eccles, S. A., Box, C., Court, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration/invasion+assays+and+their+application+in+cancer+drug+discovery.">Cell migration/invasion assays and their application in cancer drug discovery.</a> Biotechnology Annual Review. 11, 391-421 (2005).</li><li>Kluiver, T. A., Alieva, M., van Vuurden, D. G., Wehrens, E. J., Rios, A. 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C., Dewitte, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dawn+of+mRNA+vaccines:+The+COVID-19+case.">The dawn of mRNA vaccines: The COVID-19 case.</a> Journal of Controlled Release. 333, 511-520 (2021).</li><li>Heine, A., Juranek, S., Brossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+and+immunological+effects+of+mRNA+vaccines+in+malignant+diseases.">Clinical and immunological effects of mRNA vaccines in malignant diseases.</a> Molecular Cancer. 20 (1), 52 (2021).</li><li>Kwon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+synthetic+mRNA:+In+vitro+synthesis+of+mRNA+and+its+applications+in+regenerative+medicine.">Emergence of synthetic mRNA: In vitro synthesis of mRNA and its applications in regenerative medicine.</a> Biomaterials. 156, 172-193 (2018).</li><li>Campillo-Davo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ins+and+outs+of+messenger+RNA+electroporation+for+physical+gene+delivery+in+immune+cell-based+therapy.">The ins and outs of messenger RNA electroporation for physical gene delivery in immune cell-based therapy.</a> Pharmaceutics. 13 (3), 396 (2021).</li><li>Park, T., Koptyra, M., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+requires+CT10+regulator+of+kinase+(Crk)+and+Crk-like+(CrkL).">Fibroblast growth requires CT10 regulator of kinase (Crk) and Crk-like (CrkL).</a> The Journal of Biological Chemistry. 291 (51), 26273-26290 (2016).</li><li>Park, T. J., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+roles+of+Crk+and+CrkL+in+fibroblast+structure+and+motility.">Essential roles of Crk and CrkL in fibroblast structure and motility.</a> Oncogene. 33 (43), 5121-5132 (2014).</li><li>Chou, P. P., Jaynes, P. K., King, B. P., Chapman, E., Bailey, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+comparison+between+conventional+(method-I)+and+reverse+(method-Ii)+pipetting.">Precision comparison between conventional (method-I) and reverse (method-Ii) pipetting.</a> Clinical Chemistry. 30 (6), 958 (1984).</li><li>Pushparaj, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+the+micropipetting+techniques+in+biomedical+sciences:+A+fundamental+prerequisite+in+good+laboratory+practice.">Revisiting the micropipetting techniques in biomedical sciences: A fundamental prerequisite in good laboratory practice.</a> Bioinformation. 16 (1), 8-12 (2020).</li><li>Park, T. J., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crk+and+Crk-like+play+essential+overlapping+roles+downstream+of+disabled-1+in+the+Reelin+pathway.">Crk and Crk-like play essential overlapping roles downstream of disabled-1 in the Reelin pathway.</a> The Journal of Neuroscience. 28 (50), 13551-13562 (2008).</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRK+proteins+selectively+regulate+T+cell+migration+into+inflamed+tissues.">CRK proteins selectively regulate T cell migration into inflamed tissues.</a> The Journal of Clinical Investigation. 125 (3), 1019-1032 (2015).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+adaptor+protein+Crk+is+indispensable+for+malignant+feature+of+glioblastoma+cell+line+KMG4.">Signaling adaptor protein Crk is indispensable for malignant feature of glioblastoma cell line KMG4.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 362 (4), 976-981 (2007).</li><li>Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+regulation+of+Abl+kinase+by+Crk+Y251+and+Abi1+controls+invasive+phenotypes+in+glioblastoma.">Reciprocal regulation of Abl kinase by Crk Y251 and Abi1 controls invasive phenotypes in glioblastoma.</a> Oncotarget. 6 (35), 37792-37807 (2015).</li><li>Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crk+tyrosine+phosphorylation+regulates+PDGF-BB-inducible+Src+activation+and+breast+tumorigenicity+and+metastasis.">Crk tyrosine phosphorylation regulates PDGF-BB-inducible Src activation and breast tumorigenicity and metastasis.</a> Molecular Cancer Research. 16 (1), 173-183 (2018).</li><li>Raudenska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engine+shutdown:+Migrastatic+strategies+and+prevention+of+metastases.">Engine shutdown: Migrastatic strategies and prevention of metastases.</a> Trends in Cancer. 9 (4), 293-308 (2023).</li><li>Decaestecker, C., Debeir, O., Van Ham, P., Kiss, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+anti-migratory+drugs+be+screened+in+vitro?+A+review+of+2D+and+3D+assays+for+the+quantitative+analysis+of+cell+migration.">Can anti-migratory drugs be screened in vitro? A review of 2D and 3D assays for the quantitative analysis of cell migration.</a> Medicinal Research Reviews. 27 (2), 149-176 (2007).</li><li>Farasani, A., Darbre, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+exposure+to+triclosan+increases+migration+and+invasion+of+human+breast+epithelial+cells+in+vitro.">Long-term exposure to triclosan increases migration and invasion of human breast epithelial cells in vitro.</a> Journal of Applied Toxicology. 41 (7), 1115-1126 (2021).</li><li>Hanusova, V., Skalova, L., Kralova, V., Matouskova, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+flubendazole+on+adhesion+and+migration+in+SW480+and+SW620+colon+cancer+cells.">The effect of flubendazole on adhesion and migration in SW480 and SW620 colon cancer cells.</a> Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 18 (6), 837-846 (2018).</li><li>Lago-Baameiro, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PARK7/DJ-1+inhibition+decreases+invasion+and+proliferation+of+uveal+melanoma+cells.">PARK7/DJ-1 inhibition decreases invasion and proliferation of uveal melanoma cells.</a> Tumori. 109 (1), 47-53 (2023).</li><li>Escalona, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knock+down+of+TIMP-2+by+siRNA+and+CRISPR/Cas9+mediates+diverse+cellular+reprogramming+of+metastasis+and+chemosensitivity+in+ovarian+cancer.">Knock down of TIMP-2 by siRNA and CRISPR/Cas9 mediates diverse cellular reprogramming of metastasis and chemosensitivity in ovarian cancer.</a> Cancer Cell International. 22 (1), 422 (2022).</li><li>Mosca, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+S-adenosyl-L-methionine+on+the+invasion+and+migration+of+head+and+neck+squamous+cancer+cells+and+analysis+of+the+underlying+mechanisms.">Effects of S-adenosyl-L-methionine on the invasion and migration of head and neck squamous cancer cells and analysis of the underlying mechanisms.</a> International Journal of Oncology. 56 (5), 1212-1224 (2020).</li><li>Zhao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGI174+protein+and+its+functional+domain+peptides+exert+antitumour+effects+on+renal+cell+carcinoma.">VEGI174 protein and its functional domain peptides exert antitumour effects on renal cell carcinoma.</a> International Journal of Oncology. 54 (1), 390-398 (2019).</li><li>Witte, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta1-induced+cell+migration+in+pancreatic+carcinoma+cells+is+RAC1+and+NOX4-dependent+and+requires+RAC1+and+NOX4-dependent+activation+of+p38+MAPK.">TGF-beta1-induced cell migration in pancreatic carcinoma cells is RAC1 and NOX4-dependent and requires RAC1 and NOX4-dependent activation of p38 MAPK.</a> Oncology Reports. 38 (6), 3693-3701 (2017).</li><li>Bui, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+aquaporin+3+expression+by+the+AhR+pathway+is+critical+to+cell+migration.">Regulation of aquaporin 3 expression by the AhR pathway is critical to cell migration.</a> Toxicological Sciences. 149 (1), 158-166 (2016).</li><li>Tsuji, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+different+cell-detaching+methods+on+the+viability+and+cell+surface+antigen+expression+of+synovial+mesenchymal+stem+cells.">Effects of different cell-detaching methods on the viability and cell surface antigen expression of synovial mesenchymal stem cells.</a> Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).</li><li>Frandsen, S. K., McNeil, A. K., Novak, I., McNeil, P. L., Gehl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Difference+in+membrane+repair+capacity+between+cancer+cell+lines+and+a+normal+cell+line.">Difference in membrane repair capacity between cancer cell lines and a normal cell line.</a> The Journal of Membrane Biology. 249 (4), 569-576 (2016).</li></ol>

La migrazione e l'invasione sono caratteristiche importanti delle cellule tumorali. La misurazione della motilità delle cellule tumorali e la comprensione del meccanismo sottostante che controlla la motilità delle cellule tumorali forniscono informazioni critiche sugli interventi terapeutici 2,27. Sono stati sviluppati diversi metodi per studiare la migrazione cellulare7. Il test di guarigione delle ferite che utilizza graffi o inserti d...

La motilità delle cellule tumorali gioca un ruolo cruciale nelle metastasi 1,2. La diffusione delle cellule tumorali ai tessuti sani vicini e remoti rende difficile il trattamento del cancro e contribuisce alla recidiva 3,4. Pertanto, è essenziale comprendere i meccanismi della motilità delle cellule tumorali e sviluppare strategie terapeutiche pertinenti. Poiché molte cellule tumorali hanno profili di espressione genica alterati, è fondamentale capire quali cambiamenti nel profilo di espressione genica portano ad un'alterazione della motilità delle cellule tumorali 5,6.
Sono stati sviluppati diversi saggi per misurare la migrazione cellulare in vitro. Alcuni test forniscono solo informazioni limitate a causa della possibilità di misurazioni solo in punti temporali specifici, mentre altri offrono informazioni complete sulla motilità delle cellule tumorali in tempo reale7. Sebbene molti di questi saggi di motilità cellulare possano fornire risultati quantitativi in un dato momento o nel punto finale, non riescono a fornire informazioni sufficientemente dettagliate sui cambiamenti dinamici nel tasso di migrazione cellulare durante il periodo sperimentale. Inoltre, può essere difficile esaminare i potenziali cambiamenti nel tasso di migrazione cellulare a seconda del disegno sperimentale, dei tipi di cellule e del numero di cellule. Inoltre, gli effetti di trattamenti non complicati possono essere studiati con la semplice quantificazione dei tradizionali saggi di motilità, ma può essere necessaria una quantificazione più sofisticata per studiare gli effetti complessi di vari trattamenti combinati8.
E' stato messo a punto uno strumento per monitorare la corrente elettrica di una piastra per microtitolazione sul fondo di un pozzetto ricoperto di microelettrodi9. L'adesione delle cellule alla superficie del pozzetto ostacola il flusso di elettroni e l'impedenza è correlata al legame quantitativo e qualitativo delle cellule. La presenza dei microelettrodi sul fondo del pozzetto consente di misurare l'adesione, la diffusione e la proliferazione cellulare. La presenza dei microelettrodi sotto una membrana microporosa della camera superiore consente di misurare la migrazione e l'invasione cellulare nella camera inferiore, con la camera superiore rivestita con proteine della matrice extracellulare (ECM) per consentire l'invasione10.
In precedenza, è stato dimostrato che le misurazioni in tempo reale basate sull'impedenza della migrazione e dell'invasione delle cellule tumorali forniscono dati in tempo reale durante l'intero esperimento, nonché confronti e quantificazioni istantanei in varie condizioni sperimentali11. In quel documento, il knockdown genico è stato indotto per testare il ruolo delle proteine di interesse nella migrazione e nell'invasione delle cellule tumorali. Poiché un effetto di knockdown genico in piena regola nelle condizioni sperimentali testate ha richiesto 3-4 giorni dopo l'elettroporazione con piccoli RNA interferenti (siRNA)8, le cellule sono state ripiastrate dopo l'elettroporazione e riraccolte 3 giorni dopo per la misurazione in tempo reale basata sull'impedenza della migrazione e dell'invasione delle cellule tumorali.
CT10 regolatore della chinasi (Crk) e Crk-like (CrkL) sono proteine adattatrici che mediano le interazioni proteina-proteina a valle di varie vie chinasici del recettore del fattore di crescita e vie tirosin-chinasici non recettoriali12. Livelli elevati di proteine Crk e CrkL contribuiscono a una prognosi infausta in diversi tumori umani, tra cui il glioblastoma13. Tuttavia, non è chiaro come le proteine Crk e CrkL elevate portino a una prognosi infausta. Pertanto, è importante definire l'effetto della sovraespressione di Crk e CrkL sulle funzioni delle cellule tumorali. In precedenza, è stato eseguito uno studio di knockdown genico per dimostrare che i livelli endogeni delle proteine Crk e CrkL sono necessari per la migrazione e l'invasione delle cellule di glioblastoma8. Qui, è stato sviluppato un sistema di analisi modificato per affrontare l'effetto della sovraespressione di Crk e CrkL sulla migrazione e l'invasione delle cellule tumorali.
Recentemente, la sintesi in vitro dell'mRNA e le sue applicazioni terapeutiche hanno attirato una rinnovata attenzione a causa dello sviluppo dei vaccini a mRNA contro SARS-CoV-2 (revisionato da Verbeke et al.14). Inoltre, sono stati compiuti notevoli progressi nell'uso dell'mRNA sintetico nel cancro e in altre malattie15,16. L'elettroporazione delle cellule è un metodo efficace per fornire mRNA sintetico e indurre modificazioni genetiche transitorie (revisionato da Campillo-Davo et al.17), e l'uso di mRNA sintetico consente un'espressione genica rapida ed efficiente nei fibroblasti immortalizzati 18. Questo documento combina la sovraespressione genica utilizzando l'mRNA sintetico con analisi cellulari in tempo reale per studiare la migrazione e l'invasione delle cellule tumorali. Tuttavia, lo schema sperimentale utilizzato per i siRNA non funziona con la trasfezione di mRNA sintetico, poiché il livello di proteine esogene aumenta rapidamente e diminuisce gradualmente dopo la trasfezione di mRNA sintetico18. Pertanto, il metodo è stato modificato per eseguire l'analisi in tempo reale della migrazione e dell'invasione cellulare subito dopo la trasfezione senza coltivare ulteriormente le cellule.
Questo documento dimostra che la combinazione di misurazioni in tempo reale basate sull'impedenza con la trasfezione di cellule tumorali con mRNA sintetici fornisce un'analisi rapida e completa degli effetti della sovraregolazione genica sulla migrazione e sull'invasione delle cellule tumorali. Questo documento descrive procedure dettagliate per misurare come la migrazione e l'invasione delle cellule di glioblastoma sono influenzate dalla sovraespressione di Crk e CrkL. Esaminando gli effetti dipendenti dalla concentrazione dell'mRNA sintetico sulla migrazione delle cellule tumorali, l'articolo descrive chiaramente come un aumento dei livelli proteici stimoli la migrazione delle cellule tumorali. Inoltre, viene presentato un approccio di variazione della concentrazione del gel ECM per valutare gli effetti dei cambiamenti nell'espressione genica sull'invasione delle cellule tumorali.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AlphaImager HP</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>92-13823-00</td>
			<td>Agarose gel imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-Tubulin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9026</td>
			<td>Used to detect &#945;-tubulin protein (dilution 1:3,000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CIM-plate 16</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc</td>
			<td>5665825001</td>
			<td>Cell invasion and migration plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crk antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610035</td>
			<td>Used to detect CrkI and CrkII proteins (dilution 1:1,500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CrkL antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-319</td>
			<td>Used to detect CrkL protein (dilution 1:1,500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>302002</td>
			<td>Cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td>Buffer used to wash cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30910.03</td>
			<td>Culture medium supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell VIOS 160i CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51030285</td>
			<td>CO2 incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW goat anti-mouse IgG secondary antibody</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td>926-32210</td>
			<td>Secondary antibody for Western blot analysis (dilution 1:10,000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW goat anti-rabbit IgG secondary antibody</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td>926-32211</td>
			<td>Secondary antibody for Western blot analysis&#160; (dilution 1:10,000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium chloride&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9480</td>
			<td>Used for RNA precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Extracellular matrix (ECM) gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAscript T7 transcription kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1334</td>
			<td>Used for RNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millennium RNA markers</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM7150</td>
			<td>Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini centrifuge</td>
			<td>ISC BioExpress</td>
			<td>C1301P-ISC</td>
			<td>Used to spin down cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse brain QUICK-Clone cDNA</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>637301</td>
			<td>Source of genes (inserts) for cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoQuant</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>M200PRO</td>
			<td>Nucleic acid quantification system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon electroporation system&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK5000</td>
			<td>Electroporation system1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon transfection system 10 &#181;L kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK1025</td>
			<td>Electroporation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon transfection system 100 &#181;L kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK10096</td>
			<td>Electroporation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NorthernMax denaturing gel buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM8676</td>
			<td>Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NorthernMax formaldehyde load dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM8552</td>
			<td>Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NorthernMax running buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM8671</td>
			<td>Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>W3331</td>
			<td>Used for various reactions during mRNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey CLx Imager</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td></td>
			<td>Imager for Western blot analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3.1/myc-His</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>V80020</td>
			<td>The vector into which inserts (mouse CrkI and CrkL cDNAs) were cloned</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFLAG-CMV-5a</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>E7523</td>
			<td>Source of the FLAG epitope tag</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:chloroform:isoamyl alcohol&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2069</td>
			<td>Used for DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PmeI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0560L</td>
			<td>Used to linearize the plasmids for mRNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(A) tailing kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1350</td>
			<td>Used for poly(A) tail reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene tissue culture dish (100 x 20 mm style)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353003</td>
			<td>Used for culturing cells before transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene tissue culture dish (35 x 10 mm style)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353001</td>
			<td>Used for culturing transfected cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25530049</td>
			<td>Used to remove protein in the reaction mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purifier Axiom Class II, Type C1</td>
			<td>Labconco Corporation</td>
			<td>304410001</td>
			<td>Biosafety cabinet for sterile handling of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resuspension Buffer R</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>A buffer included in the electroporation kits, MPK1025 and MPK10096. The buffer is used to resupend cells before electroporation, and its composition is proprietary information.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9780</td>
			<td>RNA decontamination solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scepter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>C85360</td>
			<td>Handheld automated cell counter&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ScriptCap 2&#39;-O-methyltransferase kit</td>
			<td>Cellscript</td>
			<td>C-SCMT0625</td>
			<td>Used for capping reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ScriptCap m7G capping system</td>
			<td>Cellscript</td>
			<td>C-SCCE0625</td>
			<td>Used for capping reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15553-035</td>
			<td>Detergent used for the proteinase K reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend XT centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75004532</td>
			<td>Benchtop centrifuge to spin down cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>Used for dissociation of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-118MG&#160;</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB15</td>
			<td>An adherent cell line derived from a human glioblastoma patient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinculin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V9131</td>
			<td>Used to detect vinculin protein (dilution 1:100,000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xCELLigence RTCA DP</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc</td>
			<td>380601050</td>
			<td>Instrument used for real-time cell analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1Electroporation parameters and other related information for various cell lines are available on the manufacturer&#39;s homepage (https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-culture/transfection/neon-transfection-system/neon-transfection-system-cell-line-data.html?).</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time quantitative measurement of tumor cell migration and invasion following synthetic mrna transfection

Le cellule tumorali sono altamente mobili e invasive e mostrano modelli di espressione genica alterati. La conoscenza di come i cambiamenti nell'espressione genica regolano la migrazione e l'invasione delle cellule tumorali è essenziale per comprendere i meccanismi di infiltrazione delle cellule tumorali nei tessuti sani vicini e le metastasi. In precedenza, è stato dimostrato che il knockdown genico seguito dalla misurazione in tempo reale basata sull'impedenza della migrazione e dell'invasione delle cellule tumorali consente l'identificazione dei geni necessari per la migrazione e l'invasione delle cellule tumorali. Recentemente, i vaccini a mRNA contro SARS-CoV-2 hanno aumentato l'interesse per l'utilizzo di mRNA sintetico per scopi terapeutici. Qui, il metodo che utilizza l'mRNA sintetico è stato rivisto per studiare l'effetto della sovraespressione genica sulla migrazione e l'invasione delle cellule tumorali. Questo studio dimostra che l'elevata espressione genica con trasfezione sintetica di mRNA seguita da una misurazione in tempo reale basata sull'impedenza può aiutare a identificare i geni che stimolano la migrazione e l'invasione delle cellule tumorali. Questo documento fornisce importanti dettagli sulle procedure per esaminare l'effetto dell'espressione genica alterata sulla migrazione e l'invasione delle cellule tumorali.

Le proteine Crk e CrkL svolgono un ruolo importante nella motilità di molti tipi di cellule, tra cui i neuroni22, le cellule T23, i fibroblasti 18,19 e una varietà di cellule tumorali13. Poiché le proteine Crk e CrkL sono state segnalate per essere elevate nel glioblastoma24,25,26, in questo lavoro sono stati studiati gli effetti della sovraespressione di CrkI, una ...

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Real-Time Quantitative Measurement of Tumor Cell Migration and Invasion Following Synthetic mRNA Transfection

Molti geni sovraregolati stimolano la migrazione e l'invasione delle cellule tumorali, portando a una prognosi infausta. Determinare quali geni regolano la migrazione e l'invasione delle cellule tumorali è fondamentale. Questo protocollo presenta un metodo per studiare gli effetti dell'aumentata espressione di un gene sulla migrazione e l'invasione delle cellule tumorali in tempo reale.

Misurazione quantitativa in tempo reale della migrazione e dell'invasione delle cellule tumorali in seguito alla trasfezione sintetica di mRNA

Tumor cells are highly motile and invasive and display altered gene expression patterns. Knowledge of how changes in gene expression regulate tumor cell ...

Questo protocollo dimostra che la combinazione della transazione dell'RNA messaggero della sensazione con le misurazioni in tempo reale della migrazione e dell'invasione cellulare basate sull'impedenza facilita l'identificazione dei geni che stimolano la migrazione e l'invasione delle cellule tumorali. Il sistema di analisi cellulare in tempo reale basato sull'impedenza consente un monitoraggio quantitativo, continuo e completo della migrazione delle cellule tumorali in seguito alle variazioni dell'espressione genica. I geni che sovraesprimono i tumori e stimolano la migrazione delle cellule tumorali possono essere identificati come potenziali bersagli per inibire le metastasi nella terapia del cancro.Per iniziare, aggiungere 10 microlitri di tampone di reazione 10x, 1,5 microlitri di PNE one e 10 microgrammi di DNA plasmidico a una provetta da microcentrifuga per linearizzare il DNA plasmidico con l'enzima di restrizione. Aggiungere acqua priva di nucleasi per portare il volume di reazione a 100 microlitri. Mescolalo picchiettando e girandolo prima di incubare la miscela di reazione a 37 gradi Celsius durante la notte.Ancora una volta, centrifugare e aggiungere cinque microlitri di SDS al 10% e un microlitro di 20 milligrammi per millilitro di proteinasi K di grado RNA alla miscela di reazione prima di mescolarla e centrifugarla. Dopo 30 minuti di incubazione a 50 gradi Celsius, aggiungere due microlitri ciascuno di tampone di trascrizione 10x, ATP, GTP, UTP, CTP e T7 e un microgrammo di DNA linearizzato a una micro provetta da centrifuga per la sintesi dell'RNA mediata da RNA T7 polimerasi. Aggiungere acqua priva di nucleasi per portare il volume di reazione a 20 microlitri.Dopo una centrifuga, incubare la miscela di reazione a 37 gradi Celsius per due ore per la sintesi dell'RNA. Successivamente, centrifugare e aggiungere un microlitro di DNA e picchiettare prima di 15 minuti di incubazione a 37 gradi Celsius per rimuovere il DNA stampo. Iniziare la precipitazione del cloruro di litio dell'RNA aggiungendo 10 microlitri di cloruro di litio 7.5 molari alla miscela di reazione.Dopo aver picchiettato e centrifugato, incubare la miscela di reazione a meno 20 gradi Celsius per 30 minuti. Per il tappo, riscaldare il campione di RNA a 65 gradi Celsius per 10 minuti e poi metterlo su ghiaccio per il raffreddamento. Successivamente, aggiungere i componenti di reazione di tappatura e miscelare picchiettando.Centrifugare e incubare la miscela di reazione a 37 gradi Celsius per un'ora. Per la coda di poli-A, ruotare il campione e aggiungere i componenti di reazione di coda di poli-A. Quindi picchiettare, centrifugare e incubare la miscela di reazione a 37 gradi Celsius per due ore.Per la precipitazione del cloruro di litio e la quantificazione dell'mRNA sintetico, aggiungere 50 microlitri di cloruro di litio 7,5 molari ed eseguire la precipitazione del cloruro di litio. Rimuovere un'aliquota di gel ECM dal congelatore e conservarla in ghiaccio. Diluire i 10 milligrammi per litro di gel ECM a una concentrazione di lavoro mescolando 990 microlitri di DMEM con 10 microlitri di gel ECM in una micro provetta da centrifuga.Miscelare con pipettaggio delicato. Aggiungere 60 microlitri di gel ECM diluito a ciascuno dei 16 pozzetti della camera superiore della piastra CIM. Posizionare la camera superiore della piastra CIM con il coperchio della piastra su un foglio di plastica protettiva all'interno di un incubatore ad anidride carbonica per circa quattro ore per formare uno strato di gel.Per l'elettroporazione, aggiungere un millilitro di DPBS alla sospensione delle cellule tumorali in ciascuna provetta. Tocca la sospensione cellulare e gira verso il basso tre volte per 10 secondi. Rimuovere il surnatante utilizzando una micropipetta.Aggiungere 110 microlitri di tampone di risospensione R al pellet cellulare per ottenere 0,1 milioni di cellule in 10 microlitri. Aggiungere mRNA sintetico al pellet cellulare per ottenere la concentrazione da 0,2 a 20 nanogrammi per microlitro a seconda del livello di espressione desiderato. Mescolare e risospendere delicatamente il pellet cellulare picchiettando.Successivamente, elettropolizzare 10 microlitri di sospensione cellulare con un sistema di elettroporazione a 1, 350 volt per 10 millisecondi con tre impulsi ogni volta. Una volta fatto, trasferire le celle elettroporate in una nuova provetta da microcentrifuga con 1,1 millilitri di DMEM contenente lo 0,5% di FBS. Aprire il programma di analisi facendo doppio clic sull'icona del software di analisi cellulare in tempo reale.Dopo aver aperto l'opzione di impostazione predefinita del modello di esperimento, selezionare l'opzione per eseguire tre esperimenti separatamente. Aprire ogni base facendo clic sulla scheda del numero. Quindi, fai clic sulla scheda Note dell'esperimento.Seleziona la cartella e salva i dati inserendo il nome dell'esperimento. Fare clic sulla scheda layout e selezionare quattro pozzetti alla volta per impostare i quattro pozzetti duplicati per ciascuna condizione di trattamento. Inserisci le informazioni del campione e fai clic su Applica.Fare clic sulla scheda Pianificazione, quindi aggiungere un passaggio per impostare la modalità a due fasi delle misurazioni dell'impedenza della cella. Quindi, fai clic su Applica per impostare il primo passaggio. Fai di nuovo clic su aggiungi un passaggio e inserisci 10 minuti per l'intervallo e 48 ore per la durata della migrazione e dell'invasione.Quindi, fai clic su Applica per impostare il secondo passaggio. Un'ora prima della misurazione dell'impedenza cellulare, aggiungere 160 microlitri di DMEM contenente il 10% di siero o altri attrattivi chemioterapici nei pozzetti della camera inferiore della piastra CIM. Assemblare la camera superiore contenente i pozzetti rivestiti in gel ECM per l'invasione o i pozzetti non rivestiti per la migrazione con la camera inferiore.Per il saggio di migrazione cellulare, aggiungere 50 microlitri di terreno sierico a basso contenuto di terreno ai pozzetti della camera superiore della piastra CIM. Posizionare la piastra CIM e la culla del sistema nell'incubatore a CO2. Fare clic sulla scheda del messaggio.Una volta che la connessione è corretta, viene visualizzato il messaggio, la piastra CIM è pronta per l'esperimento. Pre-incubare la piastra CIM assemblata nell'incubatore ad anidride carbonica per 30-60 minuti prima dell'analisi cellulare in tempo reale per acclimatare la piastra CIM alle condizioni di coltura. Per la lettura della linea di base, fare clic sul pulsante di avvio per ciascuna base.Quando viene visualizzata la finestra Salva con nome, salvare il file sperimentale per eseguire la lettura della linea di base. Per l'alloggiamento delle celle, rimuovere la piastra CIM dalla culla e posizionarla nell'armadio di biosicurezza sul supporto della piastra. Quindi aggiungere 100 microlitri di celle elettroporate contenenti 100.000 cellule nei pozzetti della camera superiore della piastra CIM e lasciare la piastra CIM sotto l'armadio di biosicurezza per 30 minuti a temperatura ambiente.Misurare l'impedenza della cella riportando la piastra CIM completamente assemblata nella rispettiva base. Iniziare la misurazione dell'impedenza della cella per il secondo passaggio facendo clic sul pulsante di avvio della base e sulla scheda del grafico. Quindi fare clic sul pulsante Aggiungi tutto e selezionare le caselle media e deviazione standard per visualizzare i dati in tempo reale.L'elettroporazione di cellule di glioblastoma U 118 mg con concentrazioni variabili di mRNA di crack sintetico ha provocato un aumento dipendente dalla concentrazione della proteina di crack one marcata con flag un giorno dopo la trasfezione. 0,2 e due nanogrammi per microlitro di mRNA hanno portato a un'espressione non rilevabile o modesta della proteina esogena crack one. 20 nanogrammi per microlitro di mRNA hanno determinato un livello di espressione più elevato rispetto alla proteina endogena crack one.Il test di migrazione cellulare ha indicato che l'elettroporazione era di 0,2 o due nanogrammi per microlitro di crack, un mRNA non ha influenzato notevolmente la migrazione cellulare. Tuttavia, l'elettroporazione con 20 nanogrammi per microlitro di mRNA ha portato a una chiara stimolazione della migrazione cellulare con più cellule che migrano tra due e 13 ore, rivelando che la migrazione delle cellule di glioblastoma è stata stimolata dall'aumento del livello della proteina del crack uno. L'elettroporazione con mRNA sintetico della cricca L ha portato ad una robusta espressione della proteina L della cricca marcata con bandiera un giorno dopo la trasfezione.L'invasione delle cellule di controllo è rallentata con l'aumento della concentrazione di proteina ECM. Il crack L sulle cellule esprimenti ha mostrato una diminuzione dipendente dalla concentrazione del gel ECM nell'invasione cellulare. Il confronto tra le cellule di controllo e quelle che sovraesprimono la fessura L a diverse concentrazioni di gel ECM ha indicato che la sovraespressione della fessura L ha generalmente stimolato l'invasione cellulare attraverso lo strato di gel ECM.I risultati hanno anche suggerito che le due popolazioni cellulari sono state influenzate in modo differenziato dall'aumento della concentrazione di gel ECM in diversi punti temporali. Le cellule devono essere risospese rapidamente, delicatamente e completamente nell'elettroporazione delle persone con bolla R risospesa perché la lunga incubazione delle cellule nella bolla risospesa R rende le cellule malsane. Le cellule tumorali a migrazione rapida e lenta possono essere isolate per caratterizzare le differenze tra le due popolazioni cellulari.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Evaluation of the Cell Invasion and Migration Process: A Comparison of the Video Microscope-based Scratch Wound Assay and the Boyden Chamber Assay

Valutazione del processo di migrazione e l'invasione delle cellule: un confronto dello Scratch Video basati su microscopio ferita test e le analisi della camera di Boyden

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

Serum and Plasma Copy Number Detection Using Real-time PCR

Siero e Plasma copia numero rilevazione mediante PCR in tempo reale

Serum and plasma cell free DNA (cfDNA) has been shown as an informative, non-invasive source of biomarkers for cancer diagnosis, prognosis, monitoring, ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Analisi Live Cell Imaging Studio Glioblastoma cerebrale tumore cellule staminali migrazione e invasione

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Rilevazione in tempo reale nell'apoptosi delle cellule tumorali in Vitro indotta da CD8+ T cellule per studiare funzioni immuni soppressive di tumore-infiltrazione di cellule mieloidi

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager

Un flusso di lavoro semplice migrazione/invasione utilizzando un Imager di vivere-cella automatizzata

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great ...

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

Matrice a base di tumore umano in un saggio di invasione sferoide tridimensionale

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...

Real-Time Monitoring of Human Glioma Cell Migration on Dorsal Root Ganglion Axon-Oligodendrocyte Co-Cultures

Monitoraggio in tempo reale della migrazione delle cellule del Glioma umano sulle coculture di Asse-Olgon-Oligodendroce

Glioblastoma is one of the most aggressive human cancers due to extensive cellular heterogeneity and the migration properties of hGCs. In order to better ...

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

Caratterizzazione degli effetti degli inibitori espastatici sull'invasione 3D dello spheroid del tumore mediante microscopia confocale ad alta risoluzione

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

Impedance-based Real-time Measurement of Cancer Cell Migration and Invasion

Misurazione in tempo reale dell'invasione e dell'invasione delle cellule tumorali basata sull'impedimento

Cancer arises due to uncontrolled proliferation of cells initiated by genetic instability, mutations, and environmental and other stress factors. These ...

Measuring Real-time Drug Response in Organotypic Tumor Tissue Slices

Misurazione della risposta dei farmaci in tempo reale nelle fette di tessuto tumorale organotipico

Tumor tissues are composed of cancerous cells, infiltrated immune cells, endothelial cells, fibroblasts, and extracellular matrix. This complex milieu ...