Name: real-time quantitative measurement of tumor cell migration and invasion following synthetic mrna transfection
Uploaded: 2023-06-23T13:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Quantitative Measurement of Tumor Cell Migration and Invasion Following Synthetic mRNA Transfection at JoVE.com

저자들은 이 원고를 편집해 준 Children's Mercy Kansas City의 Medical Writing Center에 감사를 표합니다. 이 작업은 Natalie's A.R.T. Foundation(T.P.)과 Children's Mercy Hospital(CMH) 및 University of Kansas Cancer Center(KUCC)의 MCA Partners Advisory Board 보조금(T.P.)의 지원을 받았습니다.

1. mRNA의 합성
참고: mRNA 합성을 위해 모든 시약과 장비는 사용하기 전에 RNase를 비활성화하도록 특수 처리해야 합니다. 이 프로토콜에 사용된 모든 재료, 기기 및 시약에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
<ol><li>DNA의 선형화 참고: CrkI 및 CrkL의 마우스 cDNA를 pFLAG-CMV-5a 발현 벡터로 클로닝하여 C-말단에 FLAG 에피토프 태그를 추가하고...

<ol>
	<li>Palmer, T. D., Ashby, W. J., Lewis, J. D., Zijlstra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+tumor+cell+motility+to+prevent+metastasis.">Targeting tumor cell motility to prevent metastasis.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (8), 568-581 (2011).</li><li>Eccles, S. A., Box, C., Court, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration/invasion+assays+and+their+application+in+cancer+drug+discovery.">Cell migration/invasion assays and their application in cancer drug discovery.</a> Biotechnology Annual Review. 11, 391-421 (2005).</li><li>Kluiver, T. A., Alieva, M., van Vuurden, D. G., Wehrens, E. J., Rios, A. 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N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+the+micropipetting+techniques+in+biomedical+sciences:+A+fundamental+prerequisite+in+good+laboratory+practice.">Revisiting the micropipetting techniques in biomedical sciences: A fundamental prerequisite in good laboratory practice.</a> Bioinformation. 16 (1), 8-12 (2020).</li><li>Park, T. J., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crk+and+Crk-like+play+essential+overlapping+roles+downstream+of+disabled-1+in+the+Reelin+pathway.">Crk and Crk-like play essential overlapping roles downstream of disabled-1 in the Reelin pathway.</a> The Journal of Neuroscience. 28 (50), 13551-13562 (2008).</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRK+proteins+selectively+regulate+T+cell+migration+into+inflamed+tissues.">CRK proteins selectively regulate T cell migration into inflamed tissues.</a> The Journal of Clinical Investigation. 125 (3), 1019-1032 (2015).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+adaptor+protein+Crk+is+indispensable+for+malignant+feature+of+glioblastoma+cell+line+KMG4.">Signaling adaptor protein Crk is indispensable for malignant feature of glioblastoma cell line KMG4.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 362 (4), 976-981 (2007).</li><li>Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+regulation+of+Abl+kinase+by+Crk+Y251+and+Abi1+controls+invasive+phenotypes+in+glioblastoma.">Reciprocal regulation of Abl kinase by Crk Y251 and Abi1 controls invasive phenotypes in glioblastoma.</a> Oncotarget. 6 (35), 37792-37807 (2015).</li><li>Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crk+tyrosine+phosphorylation+regulates+PDGF-BB-inducible+Src+activation+and+breast+tumorigenicity+and+metastasis.">Crk tyrosine phosphorylation regulates PDGF-BB-inducible Src activation and breast tumorigenicity and metastasis.</a> Molecular Cancer Research. 16 (1), 173-183 (2018).</li><li>Raudenska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engine+shutdown:+Migrastatic+strategies+and+prevention+of+metastases.">Engine shutdown: Migrastatic strategies and prevention of metastases.</a> Trends in Cancer. 9 (4), 293-308 (2023).</li><li>Decaestecker, C., Debeir, O., Van Ham, P., Kiss, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+anti-migratory+drugs+be+screened+in+vitro?+A+review+of+2D+and+3D+assays+for+the+quantitative+analysis+of+cell+migration.">Can anti-migratory drugs be screened in vitro? A review of 2D and 3D assays for the quantitative analysis of cell migration.</a> Medicinal Research Reviews. 27 (2), 149-176 (2007).</li><li>Farasani, A., Darbre, P. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knock+down+of+TIMP-2+by+siRNA+and+CRISPR/Cas9+mediates+diverse+cellular+reprogramming+of+metastasis+and+chemosensitivity+in+ovarian+cancer.">Knock down of TIMP-2 by siRNA and CRISPR/Cas9 mediates diverse cellular reprogramming of metastasis and chemosensitivity in ovarian cancer.</a> Cancer Cell International. 22 (1), 422 (2022).</li><li>Mosca, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+S-adenosyl-L-methionine+on+the+invasion+and+migration+of+head+and+neck+squamous+cancer+cells+and+analysis+of+the+underlying+mechanisms.">Effects of S-adenosyl-L-methionine on the invasion and migration of head and neck squamous cancer cells and analysis of the underlying mechanisms.</a> International Journal of Oncology. 56 (5), 1212-1224 (2020).</li><li>Zhao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGI174+protein+and+its+functional+domain+peptides+exert+antitumour+effects+on+renal+cell+carcinoma.">VEGI174 protein and its functional domain peptides exert antitumour effects on renal cell carcinoma.</a> International Journal of Oncology. 54 (1), 390-398 (2019).</li><li>Witte, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta1-induced+cell+migration+in+pancreatic+carcinoma+cells+is+RAC1+and+NOX4-dependent+and+requires+RAC1+and+NOX4-dependent+activation+of+p38+MAPK.">TGF-beta1-induced cell migration in pancreatic carcinoma cells is RAC1 and NOX4-dependent and requires RAC1 and NOX4-dependent activation of p38 MAPK.</a> Oncology Reports. 38 (6), 3693-3701 (2017).</li><li>Bui, L. 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L., Gehl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Difference+in+membrane+repair+capacity+between+cancer+cell+lines+and+a+normal+cell+line.">Difference in membrane repair capacity between cancer cell lines and a normal cell line.</a> The Journal of Membrane Biology. 249 (4), 569-576 (2016).</li></ol>

이동과 침입은 종양 세포의 중요한 특징입니다. 종양 세포의 운동성을 측정하고 종양 세포 운동성을 조절하는 근본적인 메커니즘을 이해하면 치료 개입에 대한 중요한 통찰력을 얻을 수 있습니다 2,27. 세포 이동을 연구하기 위해 몇 가지 방법이 개발되었다7. 스크래치 또는 배양 삽입물을 사용하는 상처 치유 분석은 간극 봉합의 대조 ...

종양 세포 운동성은 전이 1,2에 중요한 역할을 합니다. 종양 세포가 인접 및 원격 건강 조직으로 퍼지면 암 치료가 어려워지고 재발에 기여합니다 3,4. 따라서 종양 세포 운동성의 메커니즘을 이해하고 관련 치료 전략을 개발하는 것이 필수적입니다. 많은 종양 세포가 유전자 발현 프로파일을 변경했기 때문에 유전자 발현 프로파일의 어떤 변화가 종양 세포 운동성의 변화로 이어지는지 이해하는 것이 중요합니다 5,6.
in vitro에서 세포 이동을 측정하기 위해 여러 분석법이 개발되었습니다. 일부 분석법은 특정 시점에서만 측정이 가능하기 때문에 제한된 정보만 제공하는 반면, 다른 분석법은 종양 세포 운동성에 대한 포괄적인 정보를 실시간으로 제공한다7. 이러한 세포 운동성 분석의 대부분은 주어진 시간 또는 종말점에서 정량적 결과를 제공할 수 있지만 실험 기간 동안 세포 이동 속도의 동적 변화에 대한 충분히 자세한 정보를 제공하지 못합니다. 또한 실험 설계, 세포 유형 및 세포 수에 따라 세포 이동 속도의 잠재적 변화를 조사하기 어려울 수 있습니다. 또한, 복잡하지 않은 치료의 효과는 전통적인 운동성 분석의 간단한 정량화로 조사할 수 있지만, 다양한 복합 치료의 복잡한 효과를 연구하기 위해서는 보다 정교한 정량화가 필요할 수 있다8.
미세전극으로 덮인 마이크로타이터 플레이트 웰 바닥의 전류를 모니터링하는 기기가 개발되었다9. 우물 표면에 대한 세포의 접착은 전자 흐름을 방해하고 임피던스는 세포의 양적 및 질적 결합과 관련이 있습니다. 웰 바닥에 미세 전극이 있으면 세포 접착, 확산 및 증식을 측정할 수 있습니다. 상부 챔버의 미세 다공성 막 아래에 미세 전극이 존재하면 하부 챔버로의 세포 이동 및 침범을 측정할 수 있으며, 상부 챔버는 침범을 허용하기 위해 세포외 기질(ECM) 단백질로 코팅되어 있다10.
이전에는 종양 세포 이동 및 침습에 대한 임피던스 기반 실시간 측정이 전체 실험 동안 실시간 데이터를 제공할 뿐만 아니라 다양한 실험 조건 하에서 즉각적인 비교 및 정량화를 제공한다는 것이 입증되었습니다11. 이 방법 논문에서는 종양 세포 이동 및 침입에서 관심 단백질의 역할을 테스트하기 위해 유전자 녹다운을 유도했습니다. 테스트된 실험 조건에서 완전한 유전자 녹다운 효과는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 사용한 전기천공법 후 3-4일이 걸렸기 때문에8, 전기천공법 후 세포를 다시 도금하고 3일 후에 종양 세포 이동 및 침습의 임피던스 기반 실시간 측정을 위해 재수확했습니다.
키나아제(Crk) 및 Crk-유사(CrkL)의 CT10 조절자는 다양한 성장 인자 수용체 키나아제 경로 및 비수용체 티로신 키나아제 경로의 다운스트림에서 단백질-단백질 상호작용을 매개하는 어댑터 단백질이다12. Crk 및 CrkL 단백질의 수치가 높아지면 교모세포종을 포함한 여러 인간 암의 예후가 좋지 않습니다13. 그러나 Crk 및 CrkL 단백질의 증가가 어떻게 나쁜 예후로 이어지는지는 불분명합니다. 따라서 Crk 및 CrkL 과발현이 종양 세포 기능에 미치는 영향을 정의하는 것이 중요합니다. 이전에는 Crk 및 CrkL 단백질의 내인성 수준이 교모세포종 세포 이동 및 침습에 필요하다는 것을 입증하기 위해 유전자 knockdown 연구가 수행되었습니다8. 여기에서 종양 세포 이동 및 침습에 대한 Crk 및 CrkL 과발현의 영향을 해결하기 위해 수정된 분석 시스템이 개발되었습니다.
최근 SARS-CoV-2에 대한 mRNA 백신의 개발로 인해 mRNA의 체외 합성 및 치료 응용 분야가 다시 주목을 받고 있습니다(Verbeke et al.14 검토). 또한 암 및 기타 질병에서 합성 mRNA를 사용하는 데 있어 놀라운 발전이 이루어졌습니다15,16. 세포의 전기천공법은 합성 mRNA를 전달하고 일시적인 유전자 변형을 유도하는 효과적인 방법이며(Campillo-Davo et al.17에 의해 검토됨), 합성 mRNA의 사용은 불멸화된 섬유아세포에서 빠르고 효율적인 유전자 발현을 가능하게 한다 18. 이 방법 논문은 합성 mRNA를 사용한 유전자 과발현과 실시간 세포 분석을 결합하여 종양 세포 이동 및 침입을 연구합니다. 그러나, siRNA에 사용되는 실험 방식은 합성 mRNA 형질주입 시 외인성 단백질의 수준이 급격히 증가하고 점차적으로 감소하기 때문에 합성 mRNA 형질주입에는 효과가 없다18. 따라서, 세포를 추가로 배양하지 않고 형질주입 직후 세포 이동 및 침습에 대한 실시간 분석을 수행할 수 있도록 방법을 수정하였다.
이 분석법 논문은 임피던스 기반 실시간 측정과 종양 세포의 합성 mRNA의 transfection을 결합하면 종양 세포 이동 및 침습에 대한 유전자 상향 조절의 효과에 대한 빠르고 포괄적인 분석을 제공한다는 것을 보여줍니다. 이 분석법 논문은 교모세포종 세포의 이동 및 침습이 Crk 및 CrkL의 과발현에 의해 어떻게 영향을 받는지 측정하기 위한 자세한 절차를 설명합니다. 이 논문은 종양 세포 이동에 대한 합성 mRNA의 농도 의존적 효과를 조사함으로써 단백질 수준의 증가가 종양 세포 이동을 어떻게 자극하는지 명확하게 설명합니다. 또한, 종양 세포 침범에 대한 유전자 발현 변화의 영향을 평가하기 위해 ECM 겔의 농도를 변화시키는 접근법을 제시합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AlphaImager HP</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>92-13823-00</td>
			<td>Agarose gel imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-Tubulin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9026</td>
			<td>Used to detect &#945;-tubulin protein (dilution 1:3,000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CIM-plate 16</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc</td>
			<td>5665825001</td>
			<td>Cell invasion and migration plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crk antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610035</td>
			<td>Used to detect CrkI and CrkII proteins (dilution 1:1,500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CrkL antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-319</td>
			<td>Used to detect CrkL protein (dilution 1:1,500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>302002</td>
			<td>Cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td>Buffer used to wash cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30910.03</td>
			<td>Culture medium supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell VIOS 160i CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51030285</td>
			<td>CO2 incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW goat anti-mouse IgG secondary antibody</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td>926-32210</td>
			<td>Secondary antibody for Western blot analysis (dilution 1:10,000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW goat anti-rabbit IgG secondary antibody</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td>926-32211</td>
			<td>Secondary antibody for Western blot analysis&#160; (dilution 1:10,000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium chloride&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9480</td>
			<td>Used for RNA precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Extracellular matrix (ECM) gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAscript T7 transcription kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1334</td>
			<td>Used for RNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millennium RNA markers</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM7150</td>
			<td>Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini centrifuge</td>
			<td>ISC BioExpress</td>
			<td>C1301P-ISC</td>
			<td>Used to spin down cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse brain QUICK-Clone cDNA</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>637301</td>
			<td>Source of genes (inserts) for cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoQuant</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>M200PRO</td>
			<td>Nucleic acid quantification system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon electroporation system&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK5000</td>
			<td>Electroporation system1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon transfection system 10 &#181;L kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK1025</td>
			<td>Electroporation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon transfection system 100 &#181;L kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK10096</td>
			<td>Electroporation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NorthernMax denaturing gel buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM8676</td>
			<td>Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NorthernMax formaldehyde load dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM8552</td>
			<td>Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NorthernMax running buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM8671</td>
			<td>Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>W3331</td>
			<td>Used for various reactions during mRNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey CLx Imager</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td></td>
			<td>Imager for Western blot analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3.1/myc-His</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>V80020</td>
			<td>The vector into which inserts (mouse CrkI and CrkL cDNAs) were cloned</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFLAG-CMV-5a</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>E7523</td>
			<td>Source of the FLAG epitope tag</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:chloroform:isoamyl alcohol&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2069</td>
			<td>Used for DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PmeI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0560L</td>
			<td>Used to linearize the plasmids for mRNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(A) tailing kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1350</td>
			<td>Used for poly(A) tail reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene tissue culture dish (100 x 20 mm style)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353003</td>
			<td>Used for culturing cells before transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene tissue culture dish (35 x 10 mm style)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353001</td>
			<td>Used for culturing transfected cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25530049</td>
			<td>Used to remove protein in the reaction mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purifier Axiom Class II, Type C1</td>
			<td>Labconco Corporation</td>
			<td>304410001</td>
			<td>Biosafety cabinet for sterile handling of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resuspension Buffer R</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>A buffer included in the electroporation kits, MPK1025 and MPK10096. The buffer is used to resupend cells before electroporation, and its composition is proprietary information.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9780</td>
			<td>RNA decontamination solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scepter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>C85360</td>
			<td>Handheld automated cell counter&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ScriptCap 2&#39;-O-methyltransferase kit</td>
			<td>Cellscript</td>
			<td>C-SCMT0625</td>
			<td>Used for capping reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ScriptCap m7G capping system</td>
			<td>Cellscript</td>
			<td>C-SCCE0625</td>
			<td>Used for capping reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15553-035</td>
			<td>Detergent used for the proteinase K reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend XT centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75004532</td>
			<td>Benchtop centrifuge to spin down cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>Used for dissociation of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-118MG&#160;</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB15</td>
			<td>An adherent cell line derived from a human glioblastoma patient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinculin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V9131</td>
			<td>Used to detect vinculin protein (dilution 1:100,000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xCELLigence RTCA DP</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc</td>
			<td>380601050</td>
			<td>Instrument used for real-time cell analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1Electroporation parameters and other related information for various cell lines are available on the manufacturer&#39;s homepage (https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-culture/transfection/neon-transfection-system/neon-transfection-system-cell-line-data.html?).</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time quantitative measurement of tumor cell migration and invasion following synthetic mrna transfection

종양 세포는 운동성이 높고 침습적이며 변형된 유전자 발현 패턴을 나타냅니다. 유전자 발현의 변화가 종양 세포의 이동과 침입을 어떻게 조절하는지에 대한 지식은 종양 세포가 인접한 건강한 조직으로 침투하여 전이되는 메커니즘을 이해하는 데 필수적입니다. 이전에는 유전자 녹다운(knockdown)에 이은 임피던스 기반 종양 세포 이동 및 침습 실시간 측정을 통해 종양 세포 이동 및 침습에 필요한 유전자를 식별할 수 있음을 입증했습니다. 최근 SARS-CoV-2에 대한 mRNA 백신은 치료 목적으로 합성 mRNA를 사용하는 것에 대한 관심이 높아졌습니다. 여기서는 유전자 과발현이 종양 세포 이동 및 침습에 미치는 영향을 연구하기 위해 합성 mRNA를 이용한 방법을 수정하였다. 이 연구는 합성 mRNA transfection을 통한 유전자 발현 증가 후 임피던스 기반 실시간 측정이 종양 세포 이동 및 침입을 자극하는 유전자를 식별하는 데 도움이 될 수 있음을 보여줍니다. 이 방법 논문은 종양 세포 이동 및 침습에 대한 변경된 유전자 발현의 영향을 조사하는 절차에 대한 중요한 세부 정보를 제공합니다.

Crk 및 CrkL 단백질은 뉴런22, T 세포23, 섬유아세포 18,19 및 다양한 종양 세포13를 포함한 많은 세포 유형의 운동성에 중요한 역할을 한다. Crk 및 CrkL 단백질이 교모세포종24,25,26에서 상승하는 것으로 보고되었기 때문에 Crk의 접합 변?...

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Real-Time Quantitative Measurement of Tumor Cell Migration and Invasion Following Synthetic mRNA Transfection

상향 조절된 많은 유전자는 종양 세포의 이동과 침입을 자극하여 예후를 악화시킵니다. 어떤 유전자가 종양 세포의 이동과 침입을 조절하는지 알아내는 것은 매우 중요합니다. 이 프로토콜은 종양 세포의 이동 및 침입에 대한 유전자 발현 증가의 효과를 실시간으로 조사하는 방법을 제시합니다.

합성 mRNA transfection 후 종양 세포 이동 및 침습의 실시간 정량 측정

Tumor cells are highly motile and invasive and display altered gene expression patterns. Knowledge of how changes in gene expression regulate tumor cell ...

이 프로토콜은 감각 메신저 RNA 트랜잭션과 임피던스 기반 세포 이동 및 침습 실시간 측정을 결합하면 종양 세포 이동 및 침입을 자극하는 유전자의 식별을 용이하게 할 수 있음을 보여줍니다. 임피던스 기반 실시간 세포 분석 시스템은 유전자 발현 변화에 따른 종양 세포 이동을 정량적이고 연속적이며 포괄적으로 모니터링할 수 있습니다. 종양을 과도하게 발현하고 종양 세포 이동을 자극하는 유전자는 암 치료에서 전이를 억제하는 잠재적 표적이 될 수 있습니다.먼저, 10x 반응 완충액 10마이크로리터, PNE 원 1.5마이크로리터, 플라스미드 DNA 10마이크로그램을 마이크로 원심분리 튜브에 첨가하여 플라스미드 DNA를 제한효소로 선형화합니다. 뉴클레아제 유리수를 첨가하여 반응 부피를 100마이크로리터로 만듭니다. 섭씨 37도에서 밤새 반응 혼합물을 배양하기 전에 두드려서 회전시켜 혼합합니다.다시, 스핀 다운하고 10 % SDS의 5 마이크로 리터와 RNA 등급 proteinase K의 밀리 리터 당 20 밀리그램의 1 마이크로 리터를 반응 혼합물에 첨가하여 혼합하고 스핀 다운합니다. 섭씨 50도에서 30분 동안 배양한 후 10x 전사 완충액, ATP, GTP, UTP, CTP 및 T7 각각 2마이크로리터와 선형화된 DNA 1마이크로그램을 T7 RNA 중합효소 매개 RNA 합성을 위한 마이크로 원심분리 튜브에 추가합니다. 뉴클레아제 유리수를 첨가하여 반응 부피를 20마이크로리터로 만듭니다.스핀 다운 후 RNA 합성을 위해 반응 혼합물을 섭씨 37도에서 2시간 동안 배양합니다. 다음으로, 스핀다운하여 1마이크로리터의 DNA를 추가하고 섭씨 37도에서 15분 동안 배양하기 전에 탭하여 템플릿 DNA를 제거합니다. 반응 혼합물에 10마이크로리터의 7.5몰 염화 리튬을 첨가하여 RNA의 염화 리튬 침전을 시작합니다.탭하고 회전시킨 후 반응 혼합물을 섭씨 영하 20도에서 30분 동안 배양합니다. 캡핑을 위해 RNA 샘플을 섭씨 65도에서 10분 동안 가열한 다음 얼음 위에 올려 냉각합니다. 다음으로, 캡핑 반응 성분을 추가하고 탭하여 혼합합니다.반응 혼합물을 회전시키고 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다. poly-A tailing의 경우 샘플을 스핀 다운하고 poly-A tailing 반응 성분을 추가합니다. 그런 다음 탭하고 회전시킨 다음 반응 혼합물을 섭씨 37도에서 2시간 동안 배양합니다.염화 리튬 침전 및 합성 mRNA의 정량화를 위해 50 마이크로 리터의 7.5 몰 염화 리튬을 첨가하고 염화 리튬 침전을 수행한다. 냉동실에서 ECM 겔 스톡의 부분 표본을 꺼내 얼음 위에 보관하십시오. 마이크로 원심분리기 튜브에 990마이크로리터의 DMEM과 10마이크로리터의 ECM 겔을 혼합하여 리터당 10밀리그램의 ECM 겔을 작동 농도로 희석합니다.부드러운 피펫팅으로 혼합합니다. 희석된 ECM 겔 60마이크로리터를 CIM 플레이트 상부 챔버의 16개 웰 각각에 추가합니다. 플레이트 커버가 벗겨진 CIM 플레이트의 상부 챔버를 이산화탄소 인큐베이터 내부의 보호 플라스틱 시트에 약 4시간 동안 놓아 겔 층을 형성합니다.전기천공법의 경우 각 튜브의 종양 세포 현탁액에 1mL의 DPBS를 추가합니다. 셀 서스펜션을 탭하고 10초 동안 세 번 회전합니다. 마이크로 피펫을 사용하여 상층액을 제거합니다.110 마이크로리터의 재현탁 완충액 R을 세포 펠릿에 첨가하여 10 마이크로리터에 0.1백만 개의 세포를 얻습니다. 세포 펠릿에 합성 mRNA를 첨가하여 원하는 발현 수준에 따라 마이크로리터 농도당 0.2 내지 20 나노그램을 얻는다. 세포 펠릿을 가볍게 혼합하고 두드려 재현탁시킵니다.다음으로, 3 개의 펄스로 10 밀리 초 동안 10 밀리 초 동안 electroporation 시스템으로 셀 현탁액의 10 마이크로 리터를 전기 천공법으로 매번 전기 포레이션합니다. 완료되면 전기 천공된 셀을 0.5%FBS를 포함하는 1.1밀리리터의 DMEM이 있는 새로운 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 실시간 세포 분석 소프트웨어 아이콘을 두 번 클릭하여 분석 프로그램을 엽니다.기본 실험 패턴 설정 옵션을 연 후 세 가지 실험을 개별적으로 실행하는 옵션을 선택합니다. 번호 탭을 클릭하여 각 크래들을 엽니다. 그런 다음 실험 노트 탭을 클릭합니다.폴더를 선택하고 실험 이름을 입력하여 데이터를 저장합니다. 레이아웃 탭을 클릭하고 한 번에 4개의 웰을 선택하여 각 처리 조건에 대해 쿼드 중복 웰을 설정합니다. 샘플 정보를 입력하고 적용을 클릭합니다.일정 탭을 클릭한 다음 단계를 추가하여 셀 임피던스 측정의 2단계 모드를 설정합니다. 그런 다음 적용을 클릭하여 첫 번째 단계를 설정합니다. 단계 추가를 다시 클릭하고 간격에 10분, 이동 및 침입 기간에 48시간을 입력합니다.그런 다음 적용을 클릭하여 두 번째 단계를 설정합니다. 세포 임피던스 측정 1시간 전에 10% 혈청 또는 기타 화학 유인 물질이 포함된 160마이크로리터의 DMEM을 CIM 플레이트의 하부 챔버 웰에 추가합니다. 침습을 위한 ECM 겔 코팅 웰 또는 하부 챔버와의 이동을 위한 코팅되지 않은 웰이 포함된 상부 챔버를 조립합니다.세포 이동 분석을 위해 50마이크로리터의 저혈청 배지를 CIM 플레이트의 상부 챔버 웰에 추가합니다. CIM 플레이트와 시스템의 크래들을 CO2 인큐베이터에 놓습니다. 메시지 탭을 클릭합니다.연결이 정상이면 CIM 플레이트를 실험할 준비가 되었다는 메시지가 표시됩니다. CIM 플레이트를 배양 조건에 적응시키기 위해 실시간 세포 분석 전에 조립된 CIM 플레이트를 이산화탄소 인큐베이터에서 30-60분 동안 사전 배양합니다. 기준선 판독값을 보려면 각 크래들의 시작 버튼을 클릭합니다.다른 이름으로 저장 창이 나타나면 실험 파일을 저장하여 기준 읽기를 수행합니다. 셀 안착의 경우 크래들에서 CIM 플레이트를 제거하고 플레이트 홀더의 생물 안전 캐비닛에 놓습니다. 그런 다음 100, 000 세포를 포함하는 전기 천공 셀의 100 마이크로 리터를 CIM 플레이트의 상부 챔버의 우물에 추가하고 CIM 플레이트를 실온에서 30 분 동안 생물 안전 캐비닛에 남겨 둡니다.완전히 조립된 CIM 플레이트를 해당 크래들로 다시 이동하여 셀 임피던스를 측정합니다. 크래들 시작 버튼과 플롯 탭을 클릭하여 두 번째 단계의 셀 임피던스 측정을 시작합니다. 그런 다음 모두 추가 버튼을 클릭하고 평균 및 표준 편차 상자를 선택하여 데이터를 실시간으로 시각화합니다.다양한 농도의 합성 크랙 1 mRNA를 사용한 U 118 mg 교모세포종 세포의 전기천공법은 형질주입 1일 후 플래그 태그 크랙 1 단백질의 농도 의존적 증가를 초래했습니다. 마이크로리터 mRNA 당 0.2 및 2 나노그램은 외인성 균열 1 단백질의 검출 불가능하거나 겸손한 발현을 유도했습니다. 마이크로리터 mRNA 당 20 나노그램은 내인성 균열 1 단백질보다 발현 수준이 높았습니다.세포 이동 분석은 electroporation이 마이크로리터 균열 당 0.2 또는 2 나노그램이었다는 것을 나타냈고, 1개의 mRNA는 세포 이동에 크게 영향을 미치지 않았다. 그러나, 마이크로리터 균열 당 20 nanograms 1 mRNA를 가진 electroporation는 교모세포종 세포 이동이 균열 하나 단백질 수준에 있는 증가에 의해 자극되었다는 것을 계시하는 2 그리고 13 시간 사이 이동하는 세포를 더를 가진 세포 이동의 명확한 자극으로 이끌어 냈습니다. 합성 크랙 L mRNA를 사용한 전기천공법은 형질주입 1일 후 플래그 태그가 붙은 크랙 L 단백질의 강력한 발현을 유도했습니다.대조 세포의 침입은 ECM 단백질 농도가 증가함에 따라 느려졌습니다. 발현 세포에 대한 균열 L은 세포 침습에서 ECM 겔 농도 의존적 감소를 보여주었습니다. 서로 다른 ECM 겔 농도에서 발현하는 세포에 대한 대조군과 크랙 L의 비교는 크랙 L 과발현이 일반적으로 ECM 겔 층을 통한 세포 침입을 자극한다는 것을 나타냈습니다.결과는 또한 두 세포 집단이 서로 다른 시점에서 ECM 겔 농도를 증가시킴으로써 차별적으로 영향을 받는다는 것을 시사했습니다. 재부유된 기포 R에서 세포를 오래 배양하면 세포가 건강하지 않기 때문에 세포는 재부유된 기포 R 사람들 전기천공법에서 빠르고 부드럽게, 완전하게 재현탁되어야 합니다. 빠르게 이동하는 종양 세포와 느리게 이동하는 종양 세포를 분리하여 두 세포 집단 간의 차이를 특성화할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Evaluation of the Cell Invasion and Migration Process: A Comparison of the Video Microscope-based Scratch Wound Assay and the Boyden Chamber Assay

셀 침공 및 마이그레이션 프로세스의 평가: 비디오 현미경-기반 스크래치의 비교 분석 결과 및 Boyden 챔버 분석 결과 상처

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration ...

연구

암 연구학

Serum and Plasma Copy Number Detection Using Real-time PCR

혈 청 및 혈장 복사 번호 검출 실시간 PCR를 사용 하 여

Serum and plasma cell free DNA (cfDNA) has been shown as an informative, non-invasive source of biomarkers for cancer diagnosis, prognosis, monitoring, ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

라이브 셀 이미징 분석 실험 연구 세포종 뇌 종양 줄기 세포 이동과 내 습을

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

실시간 탐지의 체 외 종양 세포 Apoptosis에 CD8에 의해 유도 된+ T 세포 종양 침투 골수성 세포의 면역 진압 기능 연구

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager

자동된 라이브 셀 이미징 사용 하 여 간단한 마이그레이션/침공 워크플로

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great ...

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

3 차원 세 포스 페 로이드 침입 분석에서 완전 한 인간 종양 기반 매트릭스

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...

Real-Time Monitoring of Human Glioma Cell Migration on Dorsal Root Ganglion Axon-Oligodendrocyte Co-Cultures

등쪽 뿌리 신경절 축삭-올리고젠드로시트 공동 배양에 대한 인간 신경교종 세포 이동의 실시간 모니터링

Glioblastoma is one of the most aggressive human cancers due to extensive cellular heterogeneity and the migration properties of hGCs. In order to better ...

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

고분해능 공초점 현미경검사법에 의한 3D 종양 스페로이드 침습에 대한 Migrastatic 억제제의 특성화

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

Impedance-based Real-time Measurement of Cancer Cell Migration and Invasion

암세포 이동 및 침입에 대한 임피던스 기반 실시간 측정

Cancer arises due to uncontrolled proliferation of cells initiated by genetic instability, mutations, and environmental and other stress factors. These ...

Measuring Real-time Drug Response in Organotypic Tumor Tissue Slices

오르가노티픽 종양 조직 슬라이스에서 실시간 약물 반응 측정

Tumor tissues are composed of cancerous cells, infiltrated immune cells, endothelial cells, fibroblasts, and extracellular matrix. This complex milieu ...