Name: real-time quantitative measurement of tumor cell migration and invasion following synthetic mrna transfection
Uploaded: 2023-06-23T13:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Quantitative Measurement of Tumor Cell Migration and Invasion Following Synthetic mRNA Transfection at JoVE.com

Os autores agradecem ao Medical Writing Center at Children's Mercy Kansas City pela edição deste manuscrito. Este trabalho foi apoiado pela Fundação A.R.T. de Natalie (para T.P.) e por uma concessão do Conselho Consultivo de Parceiros da MCA do Children's Mercy Hospital (CMH) e do University of Kansas Cancer Center (KUCC) (para T.P.).

1. Síntese de mRNA
NOTA: Para a síntese de RNAm, todos os reagentes e equipamentos devem ser especialmente tratados para inativar as RNases antes do uso. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre todos os materiais, instrumentos e reagentes usados neste protocolo.
<ol><li>Linearização do DNA NOTA: Os cDNAs de camundongos de CrkI e CrkL foram clonados no vetor de expressão pFLAG-CMV-5a para adicionar o epítopo FLAG no terminal...

<ol>
	<li>Palmer, T. D., Ashby, W. J., Lewis, J. D., Zijlstra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+tumor+cell+motility+to+prevent+metastasis.">Targeting tumor cell motility to prevent metastasis.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (8), 568-581 (2011).</li><li>Eccles, S. A., Box, C., Court, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration/invasion+assays+and+their+application+in+cancer+drug+discovery.">Cell migration/invasion assays and their application in cancer drug discovery.</a> Biotechnology Annual Review. 11, 391-421 (2005).</li><li>Kluiver, T. A., Alieva, M., van Vuurden, D. G., Wehrens, E. J., Rios, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invaders+exposed:+Understanding+and+targeting+tumor+cell+invasion+in+diffuse+intrinsic+pontine+glioma.">Invaders exposed: Understanding and targeting tumor cell invasion in diffuse intrinsic pontine glioma.</a> Frontiers in Oncology. 10, 92 (2020).</li><li>Xie, Q., Mittal, S., Berens, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+adaptive+glioblastoma:+An+overview+of+proliferation+and+invasion.">Targeting adaptive glioblastoma: An overview of proliferation and invasion.</a> Neuro-Oncology. 16 (12), 1575-1584 (2014).</li><li>Wee, Y., Wang, T., Liu, Y., Li, X., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pan-cancer+study+of+copy+number+gain+and+up-regulation+in+human+oncogenes.">A pan-cancer study of copy number gain and up-regulation in human oncogenes.</a> Life Sciences. 211, 206-214 (2018).</li><li>Zhao, M., Liu, Y., Qu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+epithelial-mesenchymal+transition-related+genes+increases+with+copy+number+in+multiple+cancer+types.">Expression of epithelial-mesenchymal transition-related genes increases with copy number in multiple cancer types.</a> Oncotarget. 7 (17), 24688-24699 (2016).</li><li>Pijuan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+cell+migration,+invasion,+and+adhesion+assays:+From+cell+imaging+to+data+analysis.">In vitro cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 107 (2019).</li><li>Park, T., Large, N., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+glioblastoma+phenotypes+in+vitro+establishes+cell+migration+as+a+robust+readout+of+Crk+and+CrkL+activity.">Quantitative assessment of glioblastoma phenotypes in vitro establishes cell migration as a robust readout of Crk and CrkL activity.</a> The Journal of Biological Chemistry. 296, 100390 (2021).</li><li>Urcan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+xCELLigence+impedance+analysis+of+the+cytotoxicity+of+dental+composite+components+on+human+gingival+fibroblasts.">Real-time xCELLigence impedance analysis of the cytotoxicity of dental composite components on human gingival fibroblasts.</a> Dental Materials. 26 (1), 51-58 (2010).</li><li>Limame, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+dynamic+cell+viability,+migration+and+invasion+assessments+by+novel+real-time+technology+and+classic+endpoint+assays.">Comparative analysis of dynamic cell viability, migration and invasion assessments by novel real-time technology and classic endpoint assays.</a> PLoS One. 7 (10), e46536 (2012).</li><li>Mudduluru, G., Large, N., Park, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impedance-based+real-time+measurement+of+cancer+cell+migration+and+invasion.">Impedance-based real-time measurement of cancer cell migration and invasion.</a> Journal of Visualized Experiments. (158), e60997 (2020).</li><li>Feller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crk+family+adaptors-signalling+complex+formation+and+biological+roles.">Crk family adaptors-signalling complex formation and biological roles.</a> Oncogene. 20 (44), 6348-6371 (2001).</li><li>Park, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crk+and+CrkL+as+therapeutic+targets+for+cancer+treatment.">Crk and CrkL as therapeutic targets for cancer treatment.</a> Cells. 10 (4), 739 (2021).</li><li>Verbeke, R., Lentacker, I., De Smedt, S. C., Dewitte, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dawn+of+mRNA+vaccines:+The+COVID-19+case.">The dawn of mRNA vaccines: The COVID-19 case.</a> Journal of Controlled Release. 333, 511-520 (2021).</li><li>Heine, A., Juranek, S., Brossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+and+immunological+effects+of+mRNA+vaccines+in+malignant+diseases.">Clinical and immunological effects of mRNA vaccines in malignant diseases.</a> Molecular Cancer. 20 (1), 52 (2021).</li><li>Kwon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+synthetic+mRNA:+In+vitro+synthesis+of+mRNA+and+its+applications+in+regenerative+medicine.">Emergence of synthetic mRNA: In vitro synthesis of mRNA and its applications in regenerative medicine.</a> Biomaterials. 156, 172-193 (2018).</li><li>Campillo-Davo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ins+and+outs+of+messenger+RNA+electroporation+for+physical+gene+delivery+in+immune+cell-based+therapy.">The ins and outs of messenger RNA electroporation for physical gene delivery in immune cell-based therapy.</a> Pharmaceutics. 13 (3), 396 (2021).</li><li>Park, T., Koptyra, M., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+requires+CT10+regulator+of+kinase+(Crk)+and+Crk-like+(CrkL).">Fibroblast growth requires CT10 regulator of kinase (Crk) and Crk-like (CrkL).</a> The Journal of Biological Chemistry. 291 (51), 26273-26290 (2016).</li><li>Park, T. J., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+roles+of+Crk+and+CrkL+in+fibroblast+structure+and+motility.">Essential roles of Crk and CrkL in fibroblast structure and motility.</a> Oncogene. 33 (43), 5121-5132 (2014).</li><li>Chou, P. P., Jaynes, P. K., King, B. P., Chapman, E., Bailey, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+comparison+between+conventional+(method-I)+and+reverse+(method-Ii)+pipetting.">Precision comparison between conventional (method-I) and reverse (method-Ii) pipetting.</a> Clinical Chemistry. 30 (6), 958 (1984).</li><li>Pushparaj, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+the+micropipetting+techniques+in+biomedical+sciences:+A+fundamental+prerequisite+in+good+laboratory+practice.">Revisiting the micropipetting techniques in biomedical sciences: A fundamental prerequisite in good laboratory practice.</a> Bioinformation. 16 (1), 8-12 (2020).</li><li>Park, T. J., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crk+and+Crk-like+play+essential+overlapping+roles+downstream+of+disabled-1+in+the+Reelin+pathway.">Crk and Crk-like play essential overlapping roles downstream of disabled-1 in the Reelin pathway.</a> The Journal of Neuroscience. 28 (50), 13551-13562 (2008).</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRK+proteins+selectively+regulate+T+cell+migration+into+inflamed+tissues.">CRK proteins selectively regulate T cell migration into inflamed tissues.</a> The Journal of Clinical Investigation. 125 (3), 1019-1032 (2015).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+adaptor+protein+Crk+is+indispensable+for+malignant+feature+of+glioblastoma+cell+line+KMG4.">Signaling adaptor protein Crk is indispensable for malignant feature of glioblastoma cell line KMG4.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 362 (4), 976-981 (2007).</li><li>Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+regulation+of+Abl+kinase+by+Crk+Y251+and+Abi1+controls+invasive+phenotypes+in+glioblastoma.">Reciprocal regulation of Abl kinase by Crk Y251 and Abi1 controls invasive phenotypes in glioblastoma.</a> Oncotarget. 6 (35), 37792-37807 (2015).</li><li>Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crk+tyrosine+phosphorylation+regulates+PDGF-BB-inducible+Src+activation+and+breast+tumorigenicity+and+metastasis.">Crk tyrosine phosphorylation regulates PDGF-BB-inducible Src activation and breast tumorigenicity and metastasis.</a> Molecular Cancer Research. 16 (1), 173-183 (2018).</li><li>Raudenska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engine+shutdown:+Migrastatic+strategies+and+prevention+of+metastases.">Engine shutdown: Migrastatic strategies and prevention of metastases.</a> Trends in Cancer. 9 (4), 293-308 (2023).</li><li>Decaestecker, C., Debeir, O., Van Ham, P., Kiss, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+anti-migratory+drugs+be+screened+in+vitro?+A+review+of+2D+and+3D+assays+for+the+quantitative+analysis+of+cell+migration.">Can anti-migratory drugs be screened in vitro? A review of 2D and 3D assays for the quantitative analysis of cell migration.</a> Medicinal Research Reviews. 27 (2), 149-176 (2007).</li><li>Farasani, A., Darbre, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+exposure+to+triclosan+increases+migration+and+invasion+of+human+breast+epithelial+cells+in+vitro.">Long-term exposure to triclosan increases migration and invasion of human breast epithelial cells in vitro.</a> Journal of Applied Toxicology. 41 (7), 1115-1126 (2021).</li><li>Hanusova, V., Skalova, L., Kralova, V., Matouskova, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+flubendazole+on+adhesion+and+migration+in+SW480+and+SW620+colon+cancer+cells.">The effect of flubendazole on adhesion and migration in SW480 and SW620 colon cancer cells.</a> Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 18 (6), 837-846 (2018).</li><li>Lago-Baameiro, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PARK7/DJ-1+inhibition+decreases+invasion+and+proliferation+of+uveal+melanoma+cells.">PARK7/DJ-1 inhibition decreases invasion and proliferation of uveal melanoma cells.</a> Tumori. 109 (1), 47-53 (2023).</li><li>Escalona, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knock+down+of+TIMP-2+by+siRNA+and+CRISPR/Cas9+mediates+diverse+cellular+reprogramming+of+metastasis+and+chemosensitivity+in+ovarian+cancer.">Knock down of TIMP-2 by siRNA and CRISPR/Cas9 mediates diverse cellular reprogramming of metastasis and chemosensitivity in ovarian cancer.</a> Cancer Cell International. 22 (1), 422 (2022).</li><li>Mosca, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+S-adenosyl-L-methionine+on+the+invasion+and+migration+of+head+and+neck+squamous+cancer+cells+and+analysis+of+the+underlying+mechanisms.">Effects of S-adenosyl-L-methionine on the invasion and migration of head and neck squamous cancer cells and analysis of the underlying mechanisms.</a> International Journal of Oncology. 56 (5), 1212-1224 (2020).</li><li>Zhao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGI174+protein+and+its+functional+domain+peptides+exert+antitumour+effects+on+renal+cell+carcinoma.">VEGI174 protein and its functional domain peptides exert antitumour effects on renal cell carcinoma.</a> International Journal of Oncology. 54 (1), 390-398 (2019).</li><li>Witte, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta1-induced+cell+migration+in+pancreatic+carcinoma+cells+is+RAC1+and+NOX4-dependent+and+requires+RAC1+and+NOX4-dependent+activation+of+p38+MAPK.">TGF-beta1-induced cell migration in pancreatic carcinoma cells is RAC1 and NOX4-dependent and requires RAC1 and NOX4-dependent activation of p38 MAPK.</a> Oncology Reports. 38 (6), 3693-3701 (2017).</li><li>Bui, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+aquaporin+3+expression+by+the+AhR+pathway+is+critical+to+cell+migration.">Regulation of aquaporin 3 expression by the AhR pathway is critical to cell migration.</a> Toxicological Sciences. 149 (1), 158-166 (2016).</li><li>Tsuji, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+different+cell-detaching+methods+on+the+viability+and+cell+surface+antigen+expression+of+synovial+mesenchymal+stem+cells.">Effects of different cell-detaching methods on the viability and cell surface antigen expression of synovial mesenchymal stem cells.</a> Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).</li><li>Frandsen, S. K., McNeil, A. K., Novak, I., McNeil, P. L., Gehl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Difference+in+membrane+repair+capacity+between+cancer+cell+lines+and+a+normal+cell+line.">Difference in membrane repair capacity between cancer cell lines and a normal cell line.</a> The Journal of Membrane Biology. 249 (4), 569-576 (2016).</li></ol>

Migração e invasão são características importantes das células tumorais. A mensuração da motilidade das células tumorais e a compreensão do mecanismo subjacente que controla a motilidade das células tumorais fornecem informações críticas para intervenções terapêuticas 2,27. Vários métodos têm sido desenvolvidos para estudar a migração celular7. O ensaio de cicatrização de feridas com arranhões ou pastilhas de cultu...

A motilidade das células tumorais desempenha um papel crucial na metástase1,2. A disseminação de células tumorais para tecidos saudáveis vizinhos e remotos dificulta o tratamento do câncer e contribui para arecidiva3,4. Portanto, é essencial compreender os mecanismos de motilidade celular tumoral e desenvolver estratégias terapêuticas relevantes. Como muitas células tumorais apresentam perfis de expressão gênica alterados, é crucial entender quais alterações no perfil de expressão gênica levam à alteração da motilidade das célulastumorais5,6.
Vários ensaios têm sido desenvolvidos para medir a migração celular in vitro. Alguns ensaios fornecem apenas informações limitadas por permitirem apenas medições em momentos específicos, enquanto outros oferecem informações abrangentes sobre a motilidade celular tumoral em tempo real7. Embora muitos desses ensaios de motilidade celular possam fornecer resultados quantitativos em um determinado momento ou no desfecho, eles falham em fornecer informações suficientemente detalhadas sobre mudanças dinâmicas na taxa de migração celular ao longo do período experimental. Além disso, pode ser difícil examinar possíveis mudanças na taxa de migração celular dependendo do planejamento experimental, tipos de células e números de células. Além disso, os efeitos de tratamentos não complicados podem ser investigados pela simples quantificação de ensaios tradicionais de motilidade, mas quantificações mais sofisticadas podem ser necessárias para estudar os efeitos complexos de vários tratamentos combinados8.
Foi desenvolvido um instrumento para monitorar a corrente elétrica de uma placa de microtitulação coberta com microeletrodos9. A adesão das células à superfície do poço impede o fluxo de elétrons, e a impedância correlaciona-se com a ligação quantitativa e qualitativa das células. A presença dos microeletrodos no fundo do poço permite a medição da adesão, espalhamento e proliferação celular. A presença dos microeletrodos sob uma membrana microporosa da câmara superior permite medir a migração e invasão celular para a câmara inferior, com a câmara superior revestida com proteínas da matriz extracelular (MEC) para permitir a invasão10.
Anteriormente, foi demonstrado que medidas em tempo real baseadas em impedância da migração e invasão de células tumorais fornecem dados em tempo real durante todo o experimento, bem como comparações e quantificações instantâneas sob várias condiçõesexperimentais11. Nesse artigo, o knockdown gênico foi induzido para testar o papel de proteínas de interesse na migração e invasão de células tumorais. Como um efeito knockdown completo do gene nas condições experimentais testadas levou 3-4 dias após a eletroporação com pequenos RNAs interferentes (siRNAs)8, as células foram replaqueadas após a eletroporação e recolhidas 3 dias depois para a medição em tempo real baseada em impedância da migração e invasão de células tumorais.
CT10 regulador da quinase (Crk) e Crk-like (CrkL) são proteínas adaptadoras que medeiam interações proteína-proteína a jusante de várias vias da quinase do receptor do fator de crescimento e vias da tirosina quinase não-receptora12. Níveis elevados das proteínas Crk e CrkL contribuem para o mau prognóstico em vários cânceres humanos, incluindo o glioblastoma13. No entanto, não está claro como as proteínas Crk e CrkL elevadas levam a um prognóstico ruim. Portanto, é importante definir o efeito da superexpressão de Crk e CrkL sobre as funções das células tumorais. Anteriormente, um estudo de knockdown genético foi realizado para demonstrar que os níveis endógenos das proteínas Crk e CrkL são necessários para a migração e invasão de células de glioblastoma8. Aqui, um sistema de ensaio modificado foi desenvolvido para abordar o efeito da superexpressão de Crk e CrkL na migração e invasão de células tumorais.
Recentemente, a síntese in vitro de mRNA e suas aplicações terapêuticas têm chamado atenção renovada devido ao desenvolvimento das vacinas de mRNA contra SARS-CoV-2 (revisado por Verbeke et al.14). Além disso, avanços notáveis têm sido obtidos no uso do RNAm sintético em câncer e outras doenças15,16. A eletroporação de células é um método eficaz para liberar RNAm sintético e induzir modificações genéticas transitórias (revisado por Campillo-Davo et al.17), e o uso de RNAm sintético permite expressão gênica rápida e eficiente em fibroblastosimortalizados18. Este artigo de método combina a superexpressão gênica usando mRNA sintético com análises celulares em tempo real para estudar a migração e invasão de células tumorais. Entretanto, o esquema experimental utilizado para siRNAs não funciona com transfecção de RNAm sintético, pois o nível de proteínas exógenas aumenta rapidamente e diminui gradualmente com a transfecção de RNAm sintético18. Portanto, o método foi modificado para realizar a análise em tempo real da migração e invasão celular logo após a transfecção sem a cultura adicional das células.
Este artigo de método demonstra que a combinação de medidas em tempo real baseadas em impedância com a transfecção de células tumorais com mRNAs sintéticos fornece uma análise rápida e abrangente dos efeitos da upregulation gênica na migração e invasão de células tumorais. Este artigo descreve procedimentos detalhados para medir como a migração e invasão de células de glioblastoma são afetadas pela superexpressão de Crk e CrkL. Ao examinar os efeitos dependentes da concentração do mRNA sintético na migração de células tumorais, o artigo descreve claramente como um aumento nos níveis de proteína estimula a migração de células tumorais. Além disso, uma abordagem de variação da concentração do gel de MEC é apresentada para avaliar os efeitos de alterações na expressão gênica sobre a invasão de células tumorais.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AlphaImager HP</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>92-13823-00</td>
			<td>Agarose gel imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-Tubulin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9026</td>
			<td>Used to detect &#945;-tubulin protein (dilution 1:3,000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CIM-plate 16</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc</td>
			<td>5665825001</td>
			<td>Cell invasion and migration plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crk antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610035</td>
			<td>Used to detect CrkI and CrkII proteins (dilution 1:1,500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CrkL antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-319</td>
			<td>Used to detect CrkL protein (dilution 1:1,500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>302002</td>
			<td>Cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td>Buffer used to wash cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30910.03</td>
			<td>Culture medium supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell VIOS 160i CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51030285</td>
			<td>CO2 incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW goat anti-mouse IgG secondary antibody</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td>926-32210</td>
			<td>Secondary antibody for Western blot analysis (dilution 1:10,000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW goat anti-rabbit IgG secondary antibody</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td>926-32211</td>
			<td>Secondary antibody for Western blot analysis&#160; (dilution 1:10,000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium chloride&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9480</td>
			<td>Used for RNA precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Extracellular matrix (ECM) gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAscript T7 transcription kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1334</td>
			<td>Used for RNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millennium RNA markers</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM7150</td>
			<td>Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini centrifuge</td>
			<td>ISC BioExpress</td>
			<td>C1301P-ISC</td>
			<td>Used to spin down cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse brain QUICK-Clone cDNA</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>637301</td>
			<td>Source of genes (inserts) for cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoQuant</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>M200PRO</td>
			<td>Nucleic acid quantification system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon electroporation system&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK5000</td>
			<td>Electroporation system1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon transfection system 10 &#181;L kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK1025</td>
			<td>Electroporation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon transfection system 100 &#181;L kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK10096</td>
			<td>Electroporation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NorthernMax denaturing gel buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM8676</td>
			<td>Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NorthernMax formaldehyde load dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM8552</td>
			<td>Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NorthernMax running buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM8671</td>
			<td>Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>W3331</td>
			<td>Used for various reactions during mRNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey CLx Imager</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td></td>
			<td>Imager for Western blot analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3.1/myc-His</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>V80020</td>
			<td>The vector into which inserts (mouse CrkI and CrkL cDNAs) were cloned</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFLAG-CMV-5a</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>E7523</td>
			<td>Source of the FLAG epitope tag</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:chloroform:isoamyl alcohol&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2069</td>
			<td>Used for DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PmeI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0560L</td>
			<td>Used to linearize the plasmids for mRNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(A) tailing kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1350</td>
			<td>Used for poly(A) tail reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene tissue culture dish (100 x 20 mm style)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353003</td>
			<td>Used for culturing cells before transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene tissue culture dish (35 x 10 mm style)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353001</td>
			<td>Used for culturing transfected cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25530049</td>
			<td>Used to remove protein in the reaction mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purifier Axiom Class II, Type C1</td>
			<td>Labconco Corporation</td>
			<td>304410001</td>
			<td>Biosafety cabinet for sterile handling of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resuspension Buffer R</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>A buffer included in the electroporation kits, MPK1025 and MPK10096. The buffer is used to resupend cells before electroporation, and its composition is proprietary information.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9780</td>
			<td>RNA decontamination solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scepter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>C85360</td>
			<td>Handheld automated cell counter&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ScriptCap 2&#39;-O-methyltransferase kit</td>
			<td>Cellscript</td>
			<td>C-SCMT0625</td>
			<td>Used for capping reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ScriptCap m7G capping system</td>
			<td>Cellscript</td>
			<td>C-SCCE0625</td>
			<td>Used for capping reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15553-035</td>
			<td>Detergent used for the proteinase K reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend XT centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75004532</td>
			<td>Benchtop centrifuge to spin down cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>Used for dissociation of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-118MG&#160;</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB15</td>
			<td>An adherent cell line derived from a human glioblastoma patient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinculin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V9131</td>
			<td>Used to detect vinculin protein (dilution 1:100,000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xCELLigence RTCA DP</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc</td>
			<td>380601050</td>
			<td>Instrument used for real-time cell analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1Electroporation parameters and other related information for various cell lines are available on the manufacturer&#39;s homepage (https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-culture/transfection/neon-transfection-system/neon-transfection-system-cell-line-data.html?).</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time quantitative measurement of tumor cell migration and invasion following synthetic mrna transfection

As células tumorais são altamente móveis e invasivas e apresentam padrões alterados de expressão gênica. O conhecimento de como as alterações na expressão gênica regulam a migração e invasão de células tumorais é essencial para a compreensão dos mecanismos de infiltração de células tumorais em tecidos saudáveis vizinhos e metástases. Anteriormente, foi demonstrado que o knockdown gênico seguido da medição em tempo real baseada em impedância da migração e invasão de células tumorais permite a identificação dos genes necessários para a migração e invasão de células tumorais. Recentemente, as vacinas de mRNA contra SARS-CoV-2 aumentaram o interesse em usar mRNA sintético para fins terapêuticos. Aqui, o método usando mRNA sintético foi revisado para estudar o efeito da superexpressão gênica na migração e invasão de células tumorais. Este estudo demonstra que a expressão gênica elevada com transfecção de RNAm sintético seguida de medição em tempo real baseada em impedância pode ajudar a identificar os genes que estimulam a migração e invasão de células tumorais. Este artigo fornece detalhes importantes sobre os procedimentos para examinar o efeito da expressão gênica alterada na migração e invasão de células tumorais.

As proteínas Crk e CrkL desempenham papéis importantes na motilidade de muitos tipos celulares, incluindo neurônios22, células T23, fibroblastos 18,19 e uma variedade de células tumorais13. Uma vez que as proteínas Crk e CrkL foram relatadas como elevadas no glioblastoma24,25,26, os efeitos da superexpressão de CrkI, uma variante de emenda de Crk<sup class="xref...

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Real-Time Quantitative Measurement of Tumor Cell Migration and Invasion Following Synthetic mRNA Transfection

Muitos genes regulados estimulam a migração e invasão de células tumorais, levando a um prognóstico ruim. Determinar quais genes regulam a migração e invasão de células tumorais é fundamental. Este protocolo apresenta um método para investigar os efeitos do aumento da expressão de um gene sobre a migração e invasão de células tumorais em tempo real.

Mensuração Quantitativa em Tempo Real da Migração e Invasão de Células Tumorais Após Transfecção de RNAm Sintético

Tumor cells are highly motile and invasive and display altered gene expression patterns. Knowledge of how changes in gene expression regulate tumor cell ...

Este protocolo demonstra que a combinação da transação do RNA mensageiro da sensação com medidas de impedância em tempo real da migração e invasão celular facilita a identificação de genes que estimulam a migração e invasão de células tumorais. O sistema de análise celular em tempo real baseado em impedância permite o monitoramento quantitativo, contínuo e abrangente da migração de células tumorais após alterações na expressão gênica. Genes que expressam tumores em excesso e estimulam a migração de células tumorais podem ser identificados como alvo potencial para inibir metástases na terapia do câncer.Para começar, adicione 10 microlitros de tampão de reação 10x, 1,5 microlitros de PNE e 10 microgramas de DNA plasmidial a um tubo de microcentrífuga para linearizar o DNA plasmidial com a enzima de restrição. Adicione água livre de nuclease para trazer o volume de reação para 100 microlitros. Misture batendo e girando para baixo antes de incubar a mistura de reação a 37 graus Celsius durante a noite.Novamente, gire para baixo e adicione cinco microlitros de 10% SDS, e um microlitro de 20 miligramas por mililitro de proteína K de grau RNA à mistura de reação antes de misturá-la e girá-la para baixo. Após 30 minutos de incubação a 50 graus Celsius, adicionar dois microlitros cada de 10x tampão de transcrição, ATP, GTP, UTP, CTP e T7, e um micrograma de um DNA linearizado a um tubo de microcentrífuga para síntese de RNA polimerase T7. Adicione água livre de nuclease para trazer o volume de reação para 20 microlitros.Após um spin down, incubar a mistura de reação a 37 graus Celsius por duas horas para síntese de RNA. Em seguida, gire para baixo e adicione um microlitro de DNAs e toque antes de 15 minutos de incubação a 37 graus Celsius para remover o DNA modelo. Comece a precipitação de cloreto de lítio do RNA adicionando 10 microlitros de cloreto de lítio 7,5 molares à mistura de reação.Depois de bater e girar, incube a mistura de reação a menos 20 graus Celsius por 30 minutos. Para tampar aqueça a amostra de RNA a 65 graus Celsius por 10 minutos e, em seguida, coloque-a no gelo para resfriamento. Em seguida, adicione os componentes de reação de tampa e misture tocando.Gire e incube a mistura de reação a 37 graus Celsius por uma hora. Para rejeitos poli-A, gire a amostra e adicione os componentes da reação de rejeito poli-A. Em seguida, toque, gire para baixo e incube a mistura de reação a 37 graus Celsius por duas horas.Para precipitação de cloreto de lítio e quantificação do mRNA sintético, adicionar 50 microlitros de cloreto de lítio 7,5 molares e realizar a precipitação de cloreto de lítio. Retire uma alíquota de caldo de gel ECM do congelador e mantenha-a no gelo. Diluir o gel de ECM de 10 miligramas por litro para uma concentração de trabalho misturando 990 microlitros de DMEM com 10 microlitros de gel de ECM em um tubo de microcentrífuga.Misture por pipetagem suave. Adicionar 60 microlitros de gel de ECM diluído a cada um dos 16 poços da câmara superior da placa CIM. Coloque a câmara superior da placa CIM com a tampa da placa em uma folha plástica protetora dentro de uma incubadora de dióxido de carbono por aproximadamente quatro horas para formar uma camada de gel.Para eletroporação, adicionar um mililitro de DPBS à suspensão de células tumorais em cada tubo. Toque na suspensão da célula e gire para baixo três vezes por 10 segundos. Retire o sobrenadante usando uma micropipeta.Adicione 110 microlitros de tampão de ressuspensão R ao pellet celular para obter 0,1 milhão de células em 10 microlitros. Adicione mRNA sintético ao pellet celular para obter a concentração de 0,2 a 20 nanogramas por microlitro, dependendo do nível de expressão desejado. Misture e ressuspenda o pellet de células suavemente batendo no botão.Em seguida, eletroporar 10 microlitros da suspensão celular com um sistema de eletroporação a 1.350 volts por 10 milissegundos com três pulsos de cada vez. Uma vez feito, transferir as células eletroporosas para um novo tubo de microcentrífuga com 1,1 mililitros de DMEM contendo 0,5% de SFB. Abra o programa de análise clicando duas vezes no ícone do software de análise de células em tempo real.Depois de abrir a opção de configuração de padrão de experimento padrão, selecione a opção para executar três experimentos separadamente. Abra cada berço clicando na aba número. Em seguida, clique na guia de anotações do experimento.Selecione a pasta e salve os dados inserindo o nome do experimento. Clique na guia layout e selecione quatro poços de cada vez para configurar os poços quádruplos duplicados para cada condição de tratamento. Insira as informações da amostra e clique em aplicar.Clique na guia agendar e, em seguida, adicione uma etapa para configurar o modo de duas etapas das medições de impedância da célula. Em seguida, clique em aplicar para configurar a primeira etapa. Clique em adicionar uma etapa novamente e insira 10 minutos para o intervalo e 48 horas para a duração da migração e invasão.Em seguida, clique em aplicar para configurar a segunda etapa. Uma hora antes da medição da impedância celular, adicionar 160 microlitros de DMEM contendo 10% de soro ou outros atrativos quimioterápicos aos poços da câmara inferior da placa CIM. Montar a câmara superior contendo os poços revestidos em gel de MEC para invasão ou poços não revestidos para migração com a câmara inferior.Para o ensaio de migração celular, adicionar 50 microlitros de soro baixo aos orifícios da câmara superior da placa CIM. Coloque a placa CIM e o berço do sistema na incubadora de CO2. Clique na guia mensagem.Uma vez que a conexão está bem, a mensagem é exibida, a placa CIM está pronta para o experimento. Pré-incubar a placa CIM montada na incubadora de dióxido de carbono por 30 a 60 minutos antes da análise celular em tempo real para aclimatar a placa CIM à condição de cultura. Para a leitura da linha de base, clique no botão Iniciar para cada suporte.Quando a janela salvar como for exibida, salve o arquivo experimental para executar a leitura da linha de base. Para assentos celulares, retire a placa CIM do berço e coloque-a no armário de biossegurança no suporte da placa. Em seguida, adicione 100 microlitros de células eletroporosas contendo 100.000 células aos poços da câmara superior da placa CIM e deixe a placa CIM sob o gabinete de biossegurança por 30 minutos à temperatura ambiente.Meça a impedância da célula movendo a placa CIM totalmente montada de volta para o respectivo berço. Comece a medição da impedância da célula para a segunda etapa clicando no botão de início do suporte e na guia de plotagem. Em seguida, clique no botão adicionar tudo e selecione as caixas de média e desvio padrão para visualizar os dados em tempo real.A eletroporação de células de glioblastoma U 118 mg com concentrações variáveis de crack sintético um mRNA resultou em um aumento dependente da concentração em flag tagged crack uma proteína um dia após a transfecção. 0,2 e dois nanogramas por microlitro de mRNA levaram a uma expressão indetectável ou modesta da proteína exógena crack um. 20 nanogramas por microlitro de mRNA resultaram em um nível de expressão mais alto do que a proteína endógena crack um.O ensaio de migração celular indicou que a eletroporação foi de 0,2 ou dois nanogramas por microlitro de crack um mRNA não afetou muito a migração celular. No entanto, a eletroporação com 20 nanogramas por microlitro de crack um mRNA levou a uma clara estimulação da migração celular com mais células migrando entre duas e 13 horas, revelando que a migração celular de glioblastoma foi estimulada pelo aumento no nível de proteína de crack um. A eletroporação com mRNA de L-crack sintético levou a uma expressão robusta da proteína flag tagged crack L um dia após a transfecção.A invasão das células controle diminuiu com o aumento da concentração de proteínas da MEC. A fissura L sobre a expressão das células mostrou uma diminuição dependente da concentração do gel de MEC na invasão celular. A comparação entre o controle e o L da fissura sobre a expressão de células em diferentes concentrações de gel de MEC indicou que a superexpressão de L de trinca geralmente estimula a invasão celular através da camada de gel de MEC.Os resultados também sugeriram que as duas populações celulares foram afetadas diferencialmente pelo aumento da concentração de gel de MEC em diferentes momentos. As células devem ser ressuspensas rapidamente, suavemente e completamente na eletroporação da bolha R ressuspensa, porque a longa incubação das células na bolha R ressuspensa torna as células insalubres. Células tumorais de migração rápida e lenta podem ser isoladas para caracterizar diferenças entre as duas populações celulares.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Evaluation of the Cell Invasion and Migration Process: A Comparison of the Video Microscope-based Scratch Wound Assay and the Boyden Chamber Assay

Avaliação do processo de migração e invasão celular: uma comparação da risque baseado no microscópio a ferida do ensaio e o ensaio de câmara Boyden

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration ...

Pesquisa do câncer

Serum and Plasma Copy Number Detection Using Real-time PCR

Soro e Plasma cópia número deteção usando PCR em tempo real

Serum and plasma cell free DNA (cfDNA) has been shown as an informative, non-invasive source of biomarkers for cancer diagnosis, prognosis, monitoring, ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Imagem latente da viver-pilha ensaios de migração de células-tronco do estudo Glioblastoma cerebral Tumor e invasão

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Detecção de tempo real em Vitro Tumor celular apoptose induzida por CD8+ T células para estudar as funções imunológicas supressora de Tumor infiltrando células mieloides

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager

Um fluxo de trabalho simples migração/invasão usando um automatizado Imager viver-pilha

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great ...

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

Matriz tumor-baseada inteiramente humana no ensaio tridimensional da invasão de spheroid

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...

Real-Time Monitoring of Human Glioma Cell Migration on Dorsal Root Ganglion Axon-Oligodendrocyte Co-Cultures

Monitoramento em tempo real da migração humana de células glioma em co-culturas de raiz dorsal Ganglion Axon-Oligodendrocyte

Glioblastoma is one of the most aggressive human cancers due to extensive cellular heterogeneity and the migration properties of hGCs. In order to better ...

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

Caracterização dos efeitos de inibidores de Migrastatic na invasão do spheroid do tumor 3D pela microscopia confocal de alta resolução

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

Impedance-based Real-time Measurement of Cancer Cell Migration and Invasion

Medição em tempo real da migração e invasão de células cancerígenas

Cancer arises due to uncontrolled proliferation of cells initiated by genetic instability, mutations, and environmental and other stress factors. These ...

Measuring Real-time Drug Response in Organotypic Tumor Tissue Slices

Medição da resposta de drogas em tempo real em fatias de tecido tumoral organotípico

Tumor tissues are composed of cancerous cells, infiltrated immune cells, endothelial cells, fibroblasts, and extracellular matrix. This complex milieu ...