Name: real-time quantitative measurement of tumor cell migration and invasion following synthetic mrna transfection
Uploaded: 2023-06-23T13:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Quantitative Measurement of Tumor Cell Migration and Invasion Following Synthetic mRNA Transfection at JoVE.com

Yazarlar, bu makaleyi düzenlediği için Children's Mercy Kansas City'deki Tıbbi Yazım Merkezi'ne teşekkür eder. Bu çalışma, Natalie'nin A.R.T. Vakfı (T.P.'ye) ve Children's Mercy Hospital (CMH) ve Kansas Üniversitesi Kanser Merkezi'nden (KUCC) (T.P.'ye) MCA Partners Danışma Kurulu hibesi ile desteklenmiştir.

1. mRNA sentezi
NOT: mRNA sentezi için, kullanımdan önce RNazları etkisiz hale getirmek için tüm reaktifler ve ekipman özel olarak işlenmelidir. Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler, aletler ve reaktifler hakkında ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.
<ol><li>DNA'nın doğrusallaştırılması NOT: CrkI ve CrkL'nin fare cDNA'ları, C-terminalinde FLAG epitop etiketini eklemek için pFLAG-CMV-5a ekspresyon vektörüne klonland...

<ol>
	<li>Palmer, T. D., Ashby, W. J., Lewis, J. D., Zijlstra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+tumor+cell+motility+to+prevent+metastasis.">Targeting tumor cell motility to prevent metastasis.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (8), 568-581 (2011).</li><li>Eccles, S. A., Box, C., Court, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration/invasion+assays+and+their+application+in+cancer+drug+discovery.">Cell migration/invasion assays and their application in cancer drug discovery.</a> Biotechnology Annual Review. 11, 391-421 (2005).</li><li>Kluiver, T. A., Alieva, M., van Vuurden, D. G., Wehrens, E. J., Rios, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invaders+exposed:+Understanding+and+targeting+tumor+cell+invasion+in+diffuse+intrinsic+pontine+glioma.">Invaders exposed: Understanding and targeting tumor cell invasion in diffuse intrinsic pontine glioma.</a> Frontiers in Oncology. 10, 92 (2020).</li><li>Xie, Q., Mittal, S., Berens, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+adaptive+glioblastoma:+An+overview+of+proliferation+and+invasion.">Targeting adaptive glioblastoma: An overview of proliferation and invasion.</a> Neuro-Oncology. 16 (12), 1575-1584 (2014).</li><li>Wee, Y., Wang, T., Liu, Y., Li, X., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pan-cancer+study+of+copy+number+gain+and+up-regulation+in+human+oncogenes.">A pan-cancer study of copy number gain and up-regulation in human oncogenes.</a> Life Sciences. 211, 206-214 (2018).</li><li>Zhao, M., Liu, Y., Qu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+epithelial-mesenchymal+transition-related+genes+increases+with+copy+number+in+multiple+cancer+types.">Expression of epithelial-mesenchymal transition-related genes increases with copy number in multiple cancer types.</a> Oncotarget. 7 (17), 24688-24699 (2016).</li><li>Pijuan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+cell+migration,+invasion,+and+adhesion+assays:+From+cell+imaging+to+data+analysis.">In vitro cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 107 (2019).</li><li>Park, T., Large, N., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+glioblastoma+phenotypes+in+vitro+establishes+cell+migration+as+a+robust+readout+of+Crk+and+CrkL+activity.">Quantitative assessment of glioblastoma phenotypes in vitro establishes cell migration as a robust readout of Crk and CrkL activity.</a> The Journal of Biological Chemistry. 296, 100390 (2021).</li><li>Urcan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+xCELLigence+impedance+analysis+of+the+cytotoxicity+of+dental+composite+components+on+human+gingival+fibroblasts.">Real-time xCELLigence impedance analysis of the cytotoxicity of dental composite components on human gingival fibroblasts.</a> Dental Materials. 26 (1), 51-58 (2010).</li><li>Limame, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+dynamic+cell+viability,+migration+and+invasion+assessments+by+novel+real-time+technology+and+classic+endpoint+assays.">Comparative analysis of dynamic cell viability, migration and invasion assessments by novel real-time technology and classic endpoint assays.</a> PLoS One. 7 (10), e46536 (2012).</li><li>Mudduluru, G., Large, N., Park, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impedance-based+real-time+measurement+of+cancer+cell+migration+and+invasion.">Impedance-based real-time measurement of cancer cell migration and invasion.</a> Journal of Visualized Experiments. (158), e60997 (2020).</li><li>Feller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crk+family+adaptors-signalling+complex+formation+and+biological+roles.">Crk family adaptors-signalling complex formation and biological roles.</a> Oncogene. 20 (44), 6348-6371 (2001).</li><li>Park, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crk+and+CrkL+as+therapeutic+targets+for+cancer+treatment.">Crk and CrkL as therapeutic targets for cancer treatment.</a> Cells. 10 (4), 739 (2021).</li><li>Verbeke, R., Lentacker, I., De Smedt, S. C., Dewitte, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dawn+of+mRNA+vaccines:+The+COVID-19+case.">The dawn of mRNA vaccines: The COVID-19 case.</a> Journal of Controlled Release. 333, 511-520 (2021).</li><li>Heine, A., Juranek, S., Brossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+and+immunological+effects+of+mRNA+vaccines+in+malignant+diseases.">Clinical and immunological effects of mRNA vaccines in malignant diseases.</a> Molecular Cancer. 20 (1), 52 (2021).</li><li>Kwon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+synthetic+mRNA:+In+vitro+synthesis+of+mRNA+and+its+applications+in+regenerative+medicine.">Emergence of synthetic mRNA: In vitro synthesis of mRNA and its applications in regenerative medicine.</a> Biomaterials. 156, 172-193 (2018).</li><li>Campillo-Davo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ins+and+outs+of+messenger+RNA+electroporation+for+physical+gene+delivery+in+immune+cell-based+therapy.">The ins and outs of messenger RNA electroporation for physical gene delivery in immune cell-based therapy.</a> Pharmaceutics. 13 (3), 396 (2021).</li><li>Park, T., Koptyra, M., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+requires+CT10+regulator+of+kinase+(Crk)+and+Crk-like+(CrkL).">Fibroblast growth requires CT10 regulator of kinase (Crk) and Crk-like (CrkL).</a> The Journal of Biological Chemistry. 291 (51), 26273-26290 (2016).</li><li>Park, T. J., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+roles+of+Crk+and+CrkL+in+fibroblast+structure+and+motility.">Essential roles of Crk and CrkL in fibroblast structure and motility.</a> Oncogene. 33 (43), 5121-5132 (2014).</li><li>Chou, P. P., Jaynes, P. K., King, B. P., Chapman, E., Bailey, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+comparison+between+conventional+(method-I)+and+reverse+(method-Ii)+pipetting.">Precision comparison between conventional (method-I) and reverse (method-Ii) pipetting.</a> Clinical Chemistry. 30 (6), 958 (1984).</li><li>Pushparaj, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+the+micropipetting+techniques+in+biomedical+sciences:+A+fundamental+prerequisite+in+good+laboratory+practice.">Revisiting the micropipetting techniques in biomedical sciences: A fundamental prerequisite in good laboratory practice.</a> Bioinformation. 16 (1), 8-12 (2020).</li><li>Park, T. J., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crk+and+Crk-like+play+essential+overlapping+roles+downstream+of+disabled-1+in+the+Reelin+pathway.">Crk and Crk-like play essential overlapping roles downstream of disabled-1 in the Reelin pathway.</a> The Journal of Neuroscience. 28 (50), 13551-13562 (2008).</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRK+proteins+selectively+regulate+T+cell+migration+into+inflamed+tissues.">CRK proteins selectively regulate T cell migration into inflamed tissues.</a> The Journal of Clinical Investigation. 125 (3), 1019-1032 (2015).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+adaptor+protein+Crk+is+indispensable+for+malignant+feature+of+glioblastoma+cell+line+KMG4.">Signaling adaptor protein Crk is indispensable for malignant feature of glioblastoma cell line KMG4.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 362 (4), 976-981 (2007).</li><li>Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+regulation+of+Abl+kinase+by+Crk+Y251+and+Abi1+controls+invasive+phenotypes+in+glioblastoma.">Reciprocal regulation of Abl kinase by Crk Y251 and Abi1 controls invasive phenotypes in glioblastoma.</a> Oncotarget. 6 (35), 37792-37807 (2015).</li><li>Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crk+tyrosine+phosphorylation+regulates+PDGF-BB-inducible+Src+activation+and+breast+tumorigenicity+and+metastasis.">Crk tyrosine phosphorylation regulates PDGF-BB-inducible Src activation and breast tumorigenicity and metastasis.</a> Molecular Cancer Research. 16 (1), 173-183 (2018).</li><li>Raudenska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engine+shutdown:+Migrastatic+strategies+and+prevention+of+metastases.">Engine shutdown: Migrastatic strategies and prevention of metastases.</a> Trends in Cancer. 9 (4), 293-308 (2023).</li><li>Decaestecker, C., Debeir, O., Van Ham, P., Kiss, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+anti-migratory+drugs+be+screened+in+vitro?+A+review+of+2D+and+3D+assays+for+the+quantitative+analysis+of+cell+migration.">Can anti-migratory drugs be screened in vitro? A review of 2D and 3D assays for the quantitative analysis of cell migration.</a> Medicinal Research Reviews. 27 (2), 149-176 (2007).</li><li>Farasani, A., Darbre, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+exposure+to+triclosan+increases+migration+and+invasion+of+human+breast+epithelial+cells+in+vitro.">Long-term exposure to triclosan increases migration and invasion of human breast epithelial cells in vitro.</a> Journal of Applied Toxicology. 41 (7), 1115-1126 (2021).</li><li>Hanusova, V., Skalova, L., Kralova, V., Matouskova, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+flubendazole+on+adhesion+and+migration+in+SW480+and+SW620+colon+cancer+cells.">The effect of flubendazole on adhesion and migration in SW480 and SW620 colon cancer cells.</a> Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 18 (6), 837-846 (2018).</li><li>Lago-Baameiro, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PARK7/DJ-1+inhibition+decreases+invasion+and+proliferation+of+uveal+melanoma+cells.">PARK7/DJ-1 inhibition decreases invasion and proliferation of uveal melanoma cells.</a> Tumori. 109 (1), 47-53 (2023).</li><li>Escalona, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knock+down+of+TIMP-2+by+siRNA+and+CRISPR/Cas9+mediates+diverse+cellular+reprogramming+of+metastasis+and+chemosensitivity+in+ovarian+cancer.">Knock down of TIMP-2 by siRNA and CRISPR/Cas9 mediates diverse cellular reprogramming of metastasis and chemosensitivity in ovarian cancer.</a> Cancer Cell International. 22 (1), 422 (2022).</li><li>Mosca, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+S-adenosyl-L-methionine+on+the+invasion+and+migration+of+head+and+neck+squamous+cancer+cells+and+analysis+of+the+underlying+mechanisms.">Effects of S-adenosyl-L-methionine on the invasion and migration of head and neck squamous cancer cells and analysis of the underlying mechanisms.</a> International Journal of Oncology. 56 (5), 1212-1224 (2020).</li><li>Zhao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGI174+protein+and+its+functional+domain+peptides+exert+antitumour+effects+on+renal+cell+carcinoma.">VEGI174 protein and its functional domain peptides exert antitumour effects on renal cell carcinoma.</a> International Journal of Oncology. 54 (1), 390-398 (2019).</li><li>Witte, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta1-induced+cell+migration+in+pancreatic+carcinoma+cells+is+RAC1+and+NOX4-dependent+and+requires+RAC1+and+NOX4-dependent+activation+of+p38+MAPK.">TGF-beta1-induced cell migration in pancreatic carcinoma cells is RAC1 and NOX4-dependent and requires RAC1 and NOX4-dependent activation of p38 MAPK.</a> Oncology Reports. 38 (6), 3693-3701 (2017).</li><li>Bui, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+aquaporin+3+expression+by+the+AhR+pathway+is+critical+to+cell+migration.">Regulation of aquaporin 3 expression by the AhR pathway is critical to cell migration.</a> Toxicological Sciences. 149 (1), 158-166 (2016).</li><li>Tsuji, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+different+cell-detaching+methods+on+the+viability+and+cell+surface+antigen+expression+of+synovial+mesenchymal+stem+cells.">Effects of different cell-detaching methods on the viability and cell surface antigen expression of synovial mesenchymal stem cells.</a> Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).</li><li>Frandsen, S. K., McNeil, A. K., Novak, I., McNeil, P. L., Gehl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Difference+in+membrane+repair+capacity+between+cancer+cell+lines+and+a+normal+cell+line.">Difference in membrane repair capacity between cancer cell lines and a normal cell line.</a> The Journal of Membrane Biology. 249 (4), 569-576 (2016).</li></ol>

Göç ve invazyon tümör hücrelerinin önemli özellikleridir. Tümör hücrelerinin motilitesinin ölçülmesi ve tümör hücresi motilitesinin kontrol edilmesinin altında yatan mekanizmanın anlaşılması, terapötik müdahaleler hakkında kritik bilgiler sağlar 2,27. Hücre göçünü incelemek için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir7. Çizikler veya kültür ekleri kullanılarak yapılan yara iyileşme testi, boşluk kapanm...

Tümör hücresi motilitesi metastazda çok önemli bir rol oynar 1,2. Tümör hücrelerinin komşu ve uzak sağlıklı dokulara yayılması kanser tedavisini zorlaştırır ve nüksetmeye katkıda bulunur 3,4. Bu nedenle, tümör hücresi motilitesinin mekanizmalarını anlamak ve ilgili terapötik stratejiler geliştirmek esastır. Birçok tümör hücresi gen ekspresyon profillerini değiştirdiğinden, gen ekspresyon profilindeki hangi değişikliklerin tümör hücresi motilitesinindeğişmesine yol açtığını anlamak çok önemlidir 5,6.
Hücre göçünü in vitro olarak ölçmek için çeşitli testler geliştirilmiştir. Bazı tahliller, yalnızca belirli zaman noktalarında ölçümlere izin verdiği için yalnızca sınırlı bilgi sağlarken, diğerleri gerçek zamanlı olarak tümör hücresi motilitesi hakkında kapsamlı bilgi sunar7. Bu hücre motilite testlerinin birçoğu belirli bir zamanda veya son noktada nicel sonuçlar sağlayabilse de, deney süresi boyunca hücre göçü hızındaki dinamik değişiklikler hakkında yeterince ayrıntılı bilgi sağlayamamaktadır. Ek olarak, deneysel tasarıma, hücre tiplerine ve hücre sayılarına bağlı olarak hücre göç hızındaki potansiyel değişiklikleri incelemek zor olabilir. Ayrıca, komplike olmayan tedavilerin etkileri, geleneksel motilite testlerinin basit miktar tayini ile araştırılabilir, ancak çeşitli kombine tedavilerin karmaşık etkilerini incelemek için daha karmaşık miktar tayini gerekebilir8.
Mikroelektrotlarla kaplanmış bir mikrotitre plakasının elektrik akımını izlemek için bir cihaz geliştirilmiştir9. Hücrelerin kuyu yüzeyine yapışması elektron akışını engeller ve empedans, hücrelerin kantitatif ve nitel bağlanması ile ilişkilidir. Kuyu dibinde mikroelektrotların varlığı, hücre yapışmasının, yayılmasının ve çoğalmasının ölçülmesine izin verir. Üst kamaranın mikro gözenekli bir zarının altında mikroelektrotların varlığı, hücre göçünün ve alt bölmeye invazyonun ölçülmesine izin verir, üst bölme invazyona izin vermek için hücre dışı matris (ECM) proteinleri ile kaplanır10.
Daha önce, tümör hücresi göçü ve invazyonunun empedans tabanlı gerçek zamanlı ölçümlerinin, tüm deney boyunca gerçek zamanlı verilerin yanı sıra çeşitli deneysel koşullar altında anlık karşılaştırmalar ve nicelemeler sağladığı gösterilmiştir11. Bu yöntem makalesinde, tümör hücresi göçü ve istilasında ilgilenilen proteinlerin rolünü test etmek için gen yıkımı indüklendi. Test edilen deney koşulları altında tam gelişmiş bir gen yıkım etkisi, küçük enterferans yapan RNA'lar (siRNA'lar)8 ile elektroporasyondan 3-4 gün sonra sürdüğünden, hücreler elektroporasyondan sonra yeniden kaplandı ve tümör hücresi göçünün ve invazyonunun empedans tabanlı gerçek zamanlı ölçümü için 3 gün sonra yeniden toplandı.
Kinaz (Crk) ve Crk benzeri (CrkL) CT10 regülatörü, çeşitli büyüme faktörü reseptör kinaz yolaklarının ve reseptör olmayan tirozin kinaz yolaklarının12 aşağı akışında protein-protein etkileşimlerine aracılık eden adaptör proteinlerdir. Yüksek Crk ve CrkL protein seviyeleri, glioblastoma13 dahil olmak üzere birçok insan kanserinde kötü prognoza katkıda bulunur. Bununla birlikte, yüksek Crk ve CrkL proteinlerinin nasıl kötü bir prognoza yol açtığı açık değildir. Bu nedenle, Crk ve CrkL aşırı ekspresyonunun tümör hücre fonksiyonları üzerindeki etkisini tanımlamak önemlidir. Daha önce, glioblastoma hücre göçü ve invazyonu için endojen seviyelerde Crk ve CrkL proteinlerinin gerekli olduğunu göstermek için bir gen yıkım çalışması yapılmıştır8. Burada, Crk ve CrkL aşırı ekspresyonunun tümör hücresi göçü ve invazyonu üzerindeki etkisini ele almak için modifiye edilmiş bir test sistemi geliştirilmiştir.
Son zamanlarda, mRNA'nın in vitro sentezi ve terapötik uygulamaları, SARS-CoV-2'ye karşı mRNA aşılarının geliştirilmesi nedeniyle yeniden dikkat çekmiştir (Verbeke ve ark.14 tarafından gözden geçirilmiştir). Ayrıca kanser ve diğer hastalıklarda sentetik mRNA kullanımında kayda değer ilerlemeler kaydedilmiştir15,16. Hücrelerin elektroporasyonu, sentetik mRNA iletmek ve geçici genetik modifikasyonu indüklemek için etkili bir yöntemdir (Campillo-Davo ve ark.17 tarafından gözden geçirilmiştir) ve sentetik mRNA kullanımı, ölümsüzleştirilmiş fibroblastlardahızlı ve verimli gen ekspresyonunu sağlar 18. Bu yöntem makalesi, tümör hücresi göçünü ve invazyonunu incelemek için sentetik mRNA kullanarak gen aşırı ekspresyonunu gerçek zamanlı hücre analizleriyle birleştirir. Bununla birlikte, siRNA'lar için kullanılan deneysel şema, sentetik mRNA transfeksiyonu ile çalışmaz, çünkü eksojen proteinlerin seviyesi hızla artar ve sentetik mRNA transfeksiyonu18 üzerine kademeli olarak azalır. Bu nedenle, yöntem, hücreleri ek olarak kültürlemeden, transfeksiyondan hemen sonra hücre göçü ve istilasının gerçek zamanlı analizini gerçekleştirmek için değiştirilmiştir.
Bu yöntem makalesi, empedans tabanlı gerçek zamanlı ölçümlerin tümör hücrelerinin sentetik mRNA'larla transfeksiyonu ile birleştirilmesinin, gen yukarı regülasyonunun tümör hücresi göçü ve invazyonu üzerindeki etkilerinin hızlı ve kapsamlı bir analizini sağladığını göstermektedir. Bu yöntem belgesi, glioblastoma hücrelerinin göçünün ve istilasının Crk ve CrkL'nin aşırı ekspresyonundan nasıl etkilendiğini ölçmek için ayrıntılı prosedürleri açıklamaktadır. Makale, sentetik mRNA'nın tümör hücresi göçü üzerindeki konsantrasyona bağlı etkilerini inceleyerek, protein seviyelerindeki artışın tümör hücresi göçünü nasıl uyardığını açıkça açıklamaktadır. Ek olarak, gen ekspresyonundaki değişikliklerin tümör hücresi invazyonu üzerindeki etkilerini değerlendirmek için ECM jelinin konsantrasyonunu değiştiren bir yaklaşım sunulmaktadır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AlphaImager HP</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>92-13823-00</td>
			<td>Agarose gel imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-Tubulin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9026</td>
			<td>Used to detect &#945;-tubulin protein (dilution 1:3,000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CIM-plate 16</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc</td>
			<td>5665825001</td>
			<td>Cell invasion and migration plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crk antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610035</td>
			<td>Used to detect CrkI and CrkII proteins (dilution 1:1,500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CrkL antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-319</td>
			<td>Used to detect CrkL protein (dilution 1:1,500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>302002</td>
			<td>Cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td>Buffer used to wash cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30910.03</td>
			<td>Culture medium supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell VIOS 160i CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51030285</td>
			<td>CO2 incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW goat anti-mouse IgG secondary antibody</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td>926-32210</td>
			<td>Secondary antibody for Western blot analysis (dilution 1:10,000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW goat anti-rabbit IgG secondary antibody</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td>926-32211</td>
			<td>Secondary antibody for Western blot analysis&#160; (dilution 1:10,000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium chloride&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9480</td>
			<td>Used for RNA precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Extracellular matrix (ECM) gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAscript T7 transcription kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1334</td>
			<td>Used for RNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millennium RNA markers</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM7150</td>
			<td>Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini centrifuge</td>
			<td>ISC BioExpress</td>
			<td>C1301P-ISC</td>
			<td>Used to spin down cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse brain QUICK-Clone cDNA</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>637301</td>
			<td>Source of genes (inserts) for cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoQuant</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>M200PRO</td>
			<td>Nucleic acid quantification system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon electroporation system&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK5000</td>
			<td>Electroporation system1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon transfection system 10 &#181;L kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK1025</td>
			<td>Electroporation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon transfection system 100 &#181;L kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK10096</td>
			<td>Electroporation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NorthernMax denaturing gel buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM8676</td>
			<td>Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NorthernMax formaldehyde load dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM8552</td>
			<td>Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NorthernMax running buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM8671</td>
			<td>Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>W3331</td>
			<td>Used for various reactions during mRNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey CLx Imager</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td></td>
			<td>Imager for Western blot analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3.1/myc-His</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>V80020</td>
			<td>The vector into which inserts (mouse CrkI and CrkL cDNAs) were cloned</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFLAG-CMV-5a</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>E7523</td>
			<td>Source of the FLAG epitope tag</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:chloroform:isoamyl alcohol&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2069</td>
			<td>Used for DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PmeI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0560L</td>
			<td>Used to linearize the plasmids for mRNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(A) tailing kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1350</td>
			<td>Used for poly(A) tail reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene tissue culture dish (100 x 20 mm style)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353003</td>
			<td>Used for culturing cells before transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene tissue culture dish (35 x 10 mm style)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353001</td>
			<td>Used for culturing transfected cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25530049</td>
			<td>Used to remove protein in the reaction mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purifier Axiom Class II, Type C1</td>
			<td>Labconco Corporation</td>
			<td>304410001</td>
			<td>Biosafety cabinet for sterile handling of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resuspension Buffer R</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>A buffer included in the electroporation kits, MPK1025 and MPK10096. The buffer is used to resupend cells before electroporation, and its composition is proprietary information.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9780</td>
			<td>RNA decontamination solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scepter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>C85360</td>
			<td>Handheld automated cell counter&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ScriptCap 2&#39;-O-methyltransferase kit</td>
			<td>Cellscript</td>
			<td>C-SCMT0625</td>
			<td>Used for capping reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ScriptCap m7G capping system</td>
			<td>Cellscript</td>
			<td>C-SCCE0625</td>
			<td>Used for capping reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15553-035</td>
			<td>Detergent used for the proteinase K reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend XT centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75004532</td>
			<td>Benchtop centrifuge to spin down cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>Used for dissociation of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-118MG&#160;</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB15</td>
			<td>An adherent cell line derived from a human glioblastoma patient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinculin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V9131</td>
			<td>Used to detect vinculin protein (dilution 1:100,000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xCELLigence RTCA DP</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc</td>
			<td>380601050</td>
			<td>Instrument used for real-time cell analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1Electroporation parameters and other related information for various cell lines are available on the manufacturer&#39;s homepage (https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-culture/transfection/neon-transfection-system/neon-transfection-system-cell-line-data.html?).</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time quantitative measurement of tumor cell migration and invasion following synthetic mrna transfection

Tümör hücreleri oldukça hareketli ve invazivdir ve değişmiş gen ekspresyon paternleri sergiler. Gen ekspresyonundaki değişikliklerin tümör hücresi göçünü ve invazyonunu nasıl düzenlediğinin bilinmesi, tümör hücresinin komşu sağlıklı dokulara infiltrasyon ve metastaz mekanizmalarını anlamak için gereklidir. Daha önce, tümör hücresi göçü ve invazyonunun empedans tabanlı gerçek zamanlı ölçümünün ardından gen yıkımının, tümör hücresi göçü ve invazyonu için gerekli genlerin tanımlanmasını sağladığı gösterilmişti. Son zamanlarda, SARS-CoV-2'ye karşı mRNA aşıları, terapötik amaçlar için sentetik mRNA kullanımına olan ilgiyi artırmıştır. Burada, sentetik mRNA kullanan yöntem, gen aşırı ekspresyonunun tümör hücresi göçü ve invazyonu üzerindeki etkisini incelemek için revize edildi. Bu çalışma, sentetik mRNA transfeksiyonu ve ardından empedans tabanlı gerçek zamanlı ölçüm ile yükseltilmiş gen ekspresyonunun tümör hücresi göçünü ve invazyonunu uyaran genlerin belirlenmesine yardımcı olabileceğini göstermektedir. Bu yöntem belgesi, değiştirilmiş gen ekspresyonunun tümör hücresi göçü ve invazyonu üzerindeki etkisini inceleme prosedürleri hakkında önemli ayrıntılar sağlar.

Crk ve CrkL proteinleri, nöronlar22, T hücreleri23, fibroblastlar 18,19 ve çeşitli tümör hücreleri13 dahil olmak üzere birçok hücre tipinin hareketliliğinde önemli rol oynar. Glioblastoma24,25,26'da Crk ve CrkL proteinlerinin yükseldiği bildirildiğinden, Crk'nın bir ek varyantı olan ...

Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Quantitative Measurement of Tumor Cell Migration and Invasion Following Synthetic mRNA Transfection at JoVE.com

Real-Time Quantitative Measurement of Tumor Cell Migration and Invasion Following Synthetic mRNA Transfection

Birçok yukarı regüle edilmiş gen, tümör hücresi göçünü ve invazyonunu uyararak kötü prognoza yol açar. Hangi genlerin tümör hücresi göçünü ve invazyonunu düzenlediğini belirlemek çok önemlidir. Bu protokol, bir genin artan ekspresyonunun tümör hücrelerinin göçü ve invazyonu üzerindeki etkilerini gerçek zamanlı olarak araştırmak için bir yöntem sunar.

Sentetik mRNA Transfeksiyonunu Takiben Tümör Hücresi Migrasyonu ve İnvazyonunun Gerçek Zamanlı Kantitatif Ölçümü

Tumor cells are highly motile and invasive and display altered gene expression patterns. Knowledge of how changes in gene expression regulate tumor cell ...

Bu protokol, duyum haberci RNA işleminin, hücre göçü ve invazyonunun empedans tabanlı gerçek zamanlı ölçümleri ile birleştirilmesinin, tümör hücresi göçünü ve invazyonunu uyaran genin tanımlanmasını kolaylaştırdığını göstermektedir. Empedans tabanlı gerçek zamanlı hücre analiz sistemi, gen ekspresyonu değişiklikleri üzerine tümör hücresi göçünün nicel, sürekli ve kapsamlı bir şekilde izlenmesini sağlar. Tümörleri aşırı eksprese eden ve tümör hücresi göçünü uyaran genler, kanser tedavisinde metastazı inhibe etmek için potansiyel hedef olarak tanımlanabilir.Başlamak için, plazmit DNA'yı kısıtlama enzimi ile doğrusallaştırmak için bir mikro santrifüj tüpüne 10 mikrolitre 10x reaksiyon tamponu, 1.5 mikrolitre PNE bir ve 10 mikrogram plazmit DNA ekleyin. Reaksiyon hacmini 100 mikrolitreye çıkarmak için nükleaz içermeyen su ekleyin. Reaksiyon karışımını gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe etmeden önce hafifçe vurarak ve döndürerek karıştırın.Yine, karıştırmadan ve döndürmeden önce reaksiyon karışımına beş mikrolitre% 10 SDS ve mililitre başına 20 miligram bir mikrolitre RNA dereceli proteinaz K ekleyin. 50 santigrat derecede 30 dakikalık inkübasyondan sonra, T7 RNA polimeraz aracılı RNA sentezi için bir mikro santrifüj tüpüne her biri 10x transkripsiyon tamponu, ATP, GTP, UTP, CTP ve T7'nin her biri iki mikrolitre ve bir mikrogram doğrusallaştırılmış DNA ekleyin. Reaksiyon hacmini 20 mikrolitreye çıkarmak için nükleaz içermeyen su ekleyin.Bir döndürmeden sonra, reaksiyon karışımını RNA sentezi için iki saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Ardından, döndürün ve bir mikrolitre DNA ekleyin ve şablon DNA'yı çıkarmak için 37 santigrat derecede 15 dakikalık inkübasyondan önce hafifçe vurun. Reaksiyon karışımına 10 mikrolitre 7.5 molar lityum klorür ekleyerek RNA'nın lityum klorür çökelmesine başlayın.Hafifçe vurup döndürdükten sonra, reaksiyon karışımını eksi 20 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Kapatmak için, RNA örneğini 65 santigrat derecede 10 dakika ısıtın ve ardından soğuması için buzun üzerine koyun. Ardından, kapatma reaksiyonu bileşenlerini ekleyin ve dokunarak karıştırın.Reaksiyon karışımını döndürün ve 37 santigrat derecede bir saat inkübe edin. Poli-A kuyruğu için, numuneyi döndürün ve poli-A kuyruğu reaksiyonu bileşenlerini ekleyin. Ardından dokunun, döndürün ve reaksiyon karışımını 37 santigrat derecede iki saat inkübe edin.Lityum klorür çökeltmesi ve sentetik mRNA'nın miktar tayini için 50 mikrolitre 7.5 molar lityum klorür ekleyin ve lityum klorür çökeltmesini gerçekleştirin. Dondurucudan bir miktar ECM jel stoğu çıkarın ve buz üzerinde tutun. Bir mikro santrifüj tüpünde 990 mikrolitre DMEM'i 10 mikrolitre ECM jeli ile karıştırarak litre başına 10 miligram ECM jelini çalışma konsantrasyonuna seyreltin.Nazik pipetleme ile karıştırın. CIM plakasının üst odasının 16 oyuğunun her birine 60 mikrolitre seyreltilmiş ECM jeli ekleyin. CIM plakasının üst haznesini, plaka kapağı kapalı olacak şekilde, bir jel tabakası oluşturmak için yaklaşık dört saat boyunca bir karbondioksit inkübatörü içindeki koruyucu plastik bir tabaka üzerine yerleştirin.Elektroporasyon için, her tüpteki tümör hücresi süspansiyonuna bir mililitre DPBS ekleyin. Hücre askıya alınmasına dokunun ve 10 saniye boyunca üç kez döndürün. Bir mikro pipet kullanarak süpernatanı çıkarın.10 mikrolitrede 0.1 milyon hücre elde etmek için hücre peletine 110 mikrolitre yeniden süspansiyon tamponu R ekleyin. İstenen ekspresyon seviyesine bağlı olarak mikrolitre başına 0.2 ila 20 nanogram konsantrasyon elde etmek için hücre peletine sentetik mRNA ekleyin. Hücre peletini hafifçe vurarak karıştırın ve yeniden süspanse edin.Daha sonra, hücre süspansiyonunun 10 mikrolitresini, her seferinde üç darbeyle 10 milisaniye boyunca 1.350 voltta bir elektroporasyon sistemi ile elektroporasyon yapın. Tamamlandığında, elektroporasyonlu hücreleri% 0.5 FBS içeren 1.1 mililitre DMEM içeren yeni bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Gerçek zamanlı hücre analiz yazılımı simgesine çift tıklayarak analiz programını açın.Varsayılan deneme modeli kurulumu seçeneğini açtıktan sonra, üç denemeyi ayrı ayrı çalıştırma seçeneğini belirleyin. Sayı sekmesine tıklayarak her bir yuvayı açın. Ardından, deneme notları sekmesini tıklayın.Klasörü seçin ve denemenin adını girerek verileri kaydedin. Düzen sekmesine tıklayın ve her tedavi koşulu için dörtlü yinelenen kuyuları ayarlamak için bir seferde dört kuyu seçin. Örnek bilgileri girin ve uygula'ya tıklayın.Program sekmesine tıklayın, ardından hücre empedans ölçümlerinin iki adımlı modunu ayarlamak için bir adım ekleyin. Ardından, ilk adımı ayarlamak için uygula'yı tıklayın. Tekrar bir adım ekle'ye tıklayın ve aralık için 10 dakika ve geçiş ve istila süresi için 48 saat girin.Ardından, ikinci adımı ayarlamak için uygula'ya tıklayın. Hücre empedans ölçümünden bir saat önce, CIM plakasının alt odasının kuyucuklarına% 10 serum veya diğer kemoterapi cezbedici maddeler içeren 160 mikrolitre DMEM ekleyin. İstila için ECM jel kaplı kuyucukları içeren üst bölmeyi veya alt bölme ile migrasyon için kaplanmamış kuyuları monte edin.Hücre migrasyon tahlili için, CIM plakasının üst odasının kuyucuklarına 50 mikrolitre düşük serum ortamı ekleyin. CIM plakasını ve sistemin kızağını CO2 inkübatörüne yerleştirin. Mesaj sekmesine tıklayın.Bağlantı tamam olduğunda, CIM plakası deney için hazırdır. CIM plakasını kültür durumuna alıştırmak için gerçek zamanlı hücre analizinden önce monte edilmiş CIM plakasını karbondioksit inkübatöründe 30 ila 60 dakika önceden inkübe edin. Temel okuma için, her kızak için başlat düğmesine tıklayın.Farklı kaydet penceresi görüntülendiğinde, temel okumayı gerçekleştirmek için deneysel dosyayı kaydedin. Hücre yerleşimi için, CIM plakasını yuvadan çıkarın ve plaka tutucudaki biyogüvenlik kabinine yerleştirin. Daha sonra, CIM plakasının üst odasının kuyucuklarına 100.000 hücre içeren 100 mikrolitre elektroporasyonlu hücre ekleyin ve CIM plakasını oda sıcaklığında 30 dakika boyunca biyogüvenlik kabininin altında bırakın.Tamamen monte edilmiş CIM plakasını ilgili kızağa geri hareket ettirerek hücre empedansını ölçün. Beşik başlatma düğmesine ve çizim sekmesine tıklayarak ikinci adım için hücre empedansı ölçümüne başlayın. Ardından tümünü ekle düğmesine basın ve verileri gerçek zamanlı olarak görselleştirmek için ortalama ve standart sapma kutularını seçin.U 118 mg glioblastoma hücrelerinin değişen konsantrasyonlarda sentetik çatlak bir mRNA ile elektroporasyonu, transfeksiyondan bir gün sonra bayrak etiketli çatlak bir proteinde konsantrasyona bağlı bir artışa neden oldu. Mikrolitre mRNA başına 0.2 ve iki nanogram, eksojen çatlak bir proteinin tespit edilemeyen veya mütevazı bir ekspresyonuna yol açtı. Mikrolitre mRNA başına 20 nanogram, endojen çatlak bir proteinden daha yüksek bir ekspresyon seviyesi ile sonuçlandı.Hücre göçü testi, elektroporasyonun mikrolitre çatlak başına 0.2 veya iki nanogram olduğunu, bir mRNA'nın hücre göçünü büyük ölçüde etkilemediğini gösterdi. Bununla birlikte, mikrolitre çatlak başına 20 nanogram bir mRNA ile elektroporasyon, iki ila 13 saat arasında daha fazla hücrenin göç etmesiyle hücre göçünün net bir şekilde uyarılmasına yol açtı ve glioblastoma hücre göçünün, çatlak bir protein seviyesindeki artışla uyarıldığını ortaya çıkardı. Sentetik çatlak L mRNA ile elektroporasyon, transfeksiyondan bir gün sonra bayrak etiketli çatlak L proteininin sağlam bir ekspresyonuna yol açtı.Kontrol hücrelerinin istilası, artan ECM protein konsantrasyonu ile yavaşladı. Eksprese eden hücreler üzerindeki çatlak L, hücre invazyonunda ECM jel konsantrasyonuna bağlı bir azalma gösterdi. Farklı ECM jel konsantrasyonlarında eksprese eden hücreler üzerindeki kontrol ve çatlak L arasındaki karşılaştırma, çatlak L aşırı ekspresyonunun genellikle ECM jel tabakası boyunca hücre invazyonunu uyardığını gösterdi.Sonuçlar ayrıca, iki hücre popülasyonunun, farklı zaman noktalarında artan ECM jel konsantrasyonundan farklı şekilde etkilendiğini göstermiştir. Hücreler, yeniden süspanse edilmiş R kabarcığı insan elektroporasyonunda hızlı, nazikçe ve tamamen yeniden süspanse edilmelidir, çünkü yeniden süspanse edilmiş R kabarcığındaki hücrelerin uzun süre inkübasyonu hücreleri sağlıksız hale getirir. Hızlı ve yavaş göç eden tümör hücreleri, iki hücre popülasyonu arasındaki farklılıkları karakterize etmek için izole edilebilir.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Evaluation of the Cell Invasion and Migration Process: A Comparison of the Video Microscope-based Scratch Wound Assay and the Boyden Chamber Assay

Cep işgali ve geçiş işlemi değerlendirilmesi: Video mikroskop esaslı çizik karşılaştırılması tahlil ve Boyden odası tahlil yara

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration ...

Serum and Plasma Copy Number Detection Using Real-time PCR

Serum ve plazma kopya sayı algılama gerçek zamanlı PCR kullanarak

Serum and plasma cell free DNA (cfDNA) has been shown as an informative, non-invasive source of biomarkers for cancer diagnosis, prognosis, monitoring, ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Canlı hücre görüntüleme deneyleri için çalışma Glioblastoma Beyin tümör kök hücre göç ve işgali

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Gerçek zamanlı hafiye-in Vitro tümör hücre Apoptosis içinde CD8 tarafından indüklenen+ T hücreleri Myeloid hücrelerin tümör infiltre bağışıklık baskılayıcı işlevlerini çalışmaya

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager

Otomatik bir canlı hücre Imager kullanarak basit geçiş/işgali iş akışı

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great ...

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

Üç boyutlu Küroid Istilası tahlil tam ınsan tümör tabanlı matris

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...

Real-Time Monitoring of Human Glioma Cell Migration on Dorsal Root Ganglion Axon-Oligodendrocyte Co-Cultures

Dorsal Kök Ganglion Akson-Oligodendrocyte Co-Kültürler İnsan Glioma Hücre Göç Gerçek Zamanlı İzleme

Glioblastoma is one of the most aggressive human cancers due to extensive cellular heterogeneity and the migration properties of hGCs. In order to better ...

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

Migrastatik İnhibitörlerin 3Boyutlu Tümör Spheroid İnvazyonu Üzerine Etkilerinin Yüksek Çözünürlüklü Konfokal Mikroskopi Ile Karakterizasyonu

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

Impedance-based Real-time Measurement of Cancer Cell Migration and Invasion

Empedans tabanlı Gerçek Zamanlı Kanser Hücre Göçü ve İstilası Ölçümü

Cancer arises due to uncontrolled proliferation of cells initiated by genetic instability, mutations, and environmental and other stress factors. These ...

Measuring Real-time Drug Response in Organotypic Tumor Tissue Slices

Organotipik Tümör Doku Dilimlerinde Gerçek Zamanlı İlaç Yanıtının Ölçülmesi

Tumor tissues are composed of cancerous cells, infiltrated immune cells, endothelial cells, fibroblasts, and extracellular matrix. This complex milieu ...