5.4K Views
•
06:43 min
•
July 27th, 2022
DOI :
July 27th, 2022
•0:05
Introduction
0:57
Fixation of Cell Pellet
1:31
Trimming and Processing of the Cell Pellet
3:23
Embedding of Cell Pellet
4:27
Sectioning of the Cell Pellet
5:01
Results: Generating Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Cell Pellet Controls for Immunohistochemistry
5:53
Conclusion
Transcript
Velkarakteriserede positive og negative cellepelletskontroller med definerede protein- eller transkriptionsekspressionsniveauer er afgørende for udvikling af immunohistokemiske assays. Denne protokol beskriver en proces til oprettelse og behandling af formelfaste, paraffinindlejrede cellepelletkontroller. Sådanne kontroller kan bruges til at karakterisere bindingsspecificiteten, mens der udvikles et nyt immunohistokemi-assay.
IHC-assays er afgørende for vores opdagelses- og biomarkørudviklingsindsats på tværs af terapeutiske områder, og udvikling af validerede kontroller er afgørende for udviklingen af disse assays. Det er vigtigt at opvarme hydroxyethyl agarosebaseret gel til mindst 40 grader Celsius, før den tilsættes til cellepelleten. Gelen skal blandes godt med cellerne, inden den størkner.
Begynd fikseringen af 293T-cellepellet ved at tilføje 30 ml 10% neutralt bufferet formalin til en tre milliliter cellepellet for at skabe et 10 til et fikseringsforhold til celle. Resuspend cellerne ved gentagne gange at vende det tætsluttende 50 milliliter rør, og lad dem sætte sig natten over ved stuetemperatur. For at forbedre fikseringen skal du øge forholdet mellem overflade og volumen ved at invertere røret den næste dag og resuere cellerne.
Efter 24 timers fiksering centrifugeres røret ved 930 gange G ved fem grader Celsius i 10 til 15 minutter. Sørg for, at cellepelleten er synlig, og fjern fikseringsmidlet ved at dekantere eller forsigtigt opsuge det ved hjælp af en steril overførselspipette. Tilsæt smeltet hydroxyethyl agarosebaseret gel ved 40 til 60 grader Celsius til pelleten ved et gel til celle pelletforhold.
Brug en ren fem tommer og to millimeter spids sterling sonde med et øje skyllet med ledningsvand for forsigtigt at røre indholdet af det 50 ml koniske rør, hvilket skaber en jævn suspension af faste celler i den smeltede gel i bunden. Efter jævnt suspension af de faste celler i den smeltede gel, skal du dække krønikerøret og placere det på den våde is i fem til 10 minutter. Når gelpelleten er størknet, skal du forsigtigt placere en ren mikrospatel langs siden af røret og forsigtigt udnytte pelleten uden at gennembore den.
Placer den størknede pellet på biopsipapiret. Brug en ren mikrospatel til at trimme cellepelleten i fire til fem millimeter tykke skiver, så den passer ind i en 26 millimeter gange 26 millimeter med fem millimeter vævskassette. Placer individuelle gelpelletskiver i midten af et stykke biopsipapir.
Fold de to modsatte sider, og pakk skiven ind i papir, inden du lægger den i en 26 x 26 x fem millimeter vævskassette. Luk låget. Placer den trimmede cellepillekassette i vævsprocessorens svar fyldt med 10% neutral bufferet formalin, og kør på en kort behandlingsplan.
Til indlejring af cellepelleten skal du placere de forarbejdede kassetter i indlejringscentrets holdeområde. Åbn vævskassettelåget, og fold forsigtigt biopsipapiret ud. Placer cellepillen i en lille 15 x 15 millimeter engangsindlejringsform i skåret side nedad.
Mens du forsigtigt holder cellepellet i bunden af formen med tang, tilsættes 62 grader Celsius vævsinfiltration eller indlejring af paraffin i formen og dækker cellepelleten. Flyt formen til en kold blok for at størkne paraffinen. Juster cellepellet, mens paraffinen størkner, og fastgør den i den passende position i bunden af formen.
Fjern låget fra kassetten. Placer kassettens bundside nedad oven på indlejringsformen, og tilsæt ekstra smeltet paraffin for at dække kassetten. Når paraffin er fyldt over vævskassetten, skal du returnere formen til den kolde blok til størkning.
Hent paraffinsektionerne forberedt ved hjælp af det roterende mikrotom fra flotationsbadet på positivt ladede dias. Placer den første sektion øverst på diaset inden for dækslip- og farvningsgrænsen, og placer derefter de næste sektioner serielt som den ene under den anden. Når du er færdig, tørres diasene først ved 23 grader Celsius i 24 timer og derefter ved 60 grader Celsius i 30 minutter.
Den indlejrede cellepellet, der blev fremstillet ved hjælp af denne metode, viste en jævn cellefordeling i hele sektionen med minimal celleklumpning og interaktioner i pelleten. Når immunmærkning blev visualiseret med den brune diaminobenzen, kromogenet og tre cellelinjer, blev der observeret forskellige niveauer af TEAD-transkriptionsfaktorekspressionen i kernen, lige fra nej til svag til det stærke udtryk. Inkorporering af cellepillerne i et mikroarray tillod evaluering af kontroller med varierende ekspressionsniveauer i samme dias uden variation i procedurerne.
Som vist i dette eksempel kan der ses negativ kontrol af PEG 10-mangelfulde museembryonale stamceller og positiv kontrol af 293T-celler, der overudtrykker PEG 10. Sikring af, at celler er fastgjort tilstrækkeligt og fordelt homogent i hele gelpelleten, skaber en ensartet standardiseret analysekontrol. Cellepillerne kan bruges som kontroller i downstream immunohistokemi og NC2 hybridiseringsassays med standard antigenhentnings- og mærkningsmetoder.
Cellepelletskontrol har muliggjort udviklingen af mange immunhistokemiske assays, især for nye eller minimalt karakteriserede proteiner. De tjener som veldefinerede kontroller, der kan hjælpe med at karakterisere antistofspecificitet.
Præsenteret her er en protokol til generering af formalinfikserede, paraffinindlejrede cellepelletkontroller til immunhistokemi.
Explore More Videos
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved