定義されたタンパク質または転写産物の発現レベルを有する十分に特徴付けられた陽性および陰性の細胞ペレットコントロールは、免疫組織化学アッセイの開発に不可欠です。このプロトコルは、固定されたパラフィン包埋細胞ペレットコントロールの処方を作成および処理するためのプロセスを記載する。このようなコントロールは、新しい免疫組織化学アッセイを開発しながら結合特異性を特徴付けるために使用できます。
IHCアッセイは、治療領域全体での発見とバイオマーカー開発の取り組みに不可欠であり、これらのアッセイの開発には検証済みのコントロールの開発が不可欠です。ヒドロキシエチルアガロースベースのゲルをセルペレットに添加する前に、少なくとも摂氏40度に加熱することが不可欠です。ゲルは固化する前に細胞とよく混合されなければならない。
30ミリリットルの10%中性緩衝ホルマリンを3ミリリットルのセルペレットに加え、10対1の固定液と細胞の比率を作成することにより、293T細胞ペレットの固定を開始します。しっかりと蓋をした50ミリリットルのチューブを繰り返し反転させて細胞を再懸濁し、室温で一晩沈降させます。固定を改善するには、翌日チューブを反転させ、細胞を再懸濁することにより、表面と体積の比率を増やします。
24時間の固定後、チューブを摂氏5度で930倍Gで10〜15分間遠心分離します。細胞ペレットが見えることを確認し、滅菌トランスファーピペットを使用してデカントまたは慎重に吸引して固定液を取り除きます。溶融ヒドロキシエチルアガロースベースのゲルを摂氏40〜60度で、ゲルとセルペレットの比率で1〜4個でペレットに加えます。
水道水ですすいだ目できれいな5インチと2ミリメートルの先端スターリングプローブを使用して、50ミリリットルのコニカルチューブの内容物を静かに攪拌し、底部の溶融ゲルに固定された細胞の均一な懸濁液を作成します。固定した細胞を溶融ゲルに均等に懸濁した後、クロニクルチューブに蓋をして湿った氷の上に5〜10分間置きます。ゲルペレットが固まったら、チューブの側面に沿ってきれいなマイクロスパチュラを慎重に置き、ペレットを突き刺さずにそっと活用します。
固化したペレットを生検紙の上に置きます。きれいなマイクロスパチュラを使用して、細胞ペレットを4〜5ミリメートルの厚さのスライスにトリミングして、26ミリメートルx 26ミリメートルx 5ミリメートルの組織カセットに収めます。個々のゲルペレットスライスを生検紙の中央に置きます。
反対側の2つの側面を折り、スライスを紙で包んでから、26 x 26 x 5ミリメートルのティッシュカセットに入れます。ふたを閉めます。トリミングした細胞ペレットカセットを、10%中性緩衝ホルマリンを充填したティッシュプロセッサーレトルトに入れ、短い処理スケジュールで実行します。
セルペレットを包埋するには、処理されたカセットを包埋センターの保持領域に配置する。ティッシュカセットの蓋を開き、生検用紙を慎重に広げます。セルペレットを切断面を下にして15×15ミリメートルの小さな使い捨て埋め込み型に入れる。
細胞ペレットを鉗子で型底にそっと保持しながら、62°Cの組織浸潤またはパラフィンを型に埋め込み、細胞ペレットを覆います。金型をコールドブロックに移動して、パラフィンを固化させます。パラフィンが固化している間にセルペレットを調整し、金型の下部の適切な位置に固定します。
カセットから蓋を取り外します。カセットの下面を下にして埋め込み型の上に置き、カセットを覆うために溶融パラフィンを追加します。ティッシュカセットの上にパラフィンが充填されたら、金型をコールドブロックに戻して固化させます。
回転式ミクロトームを使用して調製したパラフィン切片を浮遊浴から正に帯電したスライドにピックアップします。最初のセクションをカバースリップと染色境界内のスライドの上部に配置し、次のセクションを上下に連続して配置します。完了したら、最初に摂氏23度で24時間、次に摂氏60度で30分間スライドを乾燥させます。
この方法を使用して調製された包埋細胞ペレットは、ペレット内の細胞凝集および相互作用を最小限に抑えながら、切片全体に均一な細胞分布を示した。茶色のジアミノベンゼン、色原体、および3つの細胞株で免疫標識を視覚化すると、核内でTEAD転写因子発現のレベルが、なしから弱い、強い発現までさまざまに観察されました。細胞ペレットをマイクロアレイに組み込むことで、手順を変化させることなく、同じスライド内で発現レベルを変化させたコントロールの評価が可能になりました。
本実施例に示すように、PEG10欠損マウス胚性幹細胞の陰性対照及びPEG10を過剰発現する293T細胞の陽性対照が見られる。細胞が適切に固定され、ゲルペレット全体に均一に分布していることを確認することで、均一な標準化されたアッセイコントロールが作成されます。細胞ペレットは、標準的な抗原賦活化および標識法を用いた下流の免疫組織化学およびNC2ハイブリダイゼーションアッセイのコントロールとして使用できます。
細胞ペレットコントロールにより、特に新規または最小限の特性評価のタンパク質について、多くの免疫組織化学アッセイの開発が可能になりました。それらは、抗体特異性の特性評価に役立つ明確に定義されたコントロールとして機能します。
