Name: generation of a mouse artificial decidualization model with ovariectomy for endometrial decidualization research
Uploaded: 2022-07-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of a Mouse Artificial Decidualization Model with Ovariectomy for Endometrial Decidualization Research at JoVE.com

Gli autori desiderano riconoscere il sostegno della National Nature Science Foundation of China (82001629, XQS), del Youth Program of Natural Science Foundation della provincia di Jiangsu (BK20200116, XQS) e del Jiangsu Province Postdoctoral Research Funding (2021K277B, XQS).

Tutti gli esperimenti sugli animali descritti sono stati approvati dal Comitato per l'uso e la cura degli animali della Scuola medica dell'Università di Nanchino (n. 20171202). Tutte le operazioni seguono le linee guida nazionali e dell'agenzia per la cura e l'uso degli animali.
NOTA: I topi sono stati allevati in un ambiente specifico privo di agenti patogeni (SPF), con una temperatura di 22 °C ± 1 °C, umidità relativa del 50% ± 1%, un ciclo luce/buio di 12 h/12 h e libero accesso al ci...

<ol>
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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+azo+dye+methods+for+histochemical+demonstration+of+alkaline+phosphatase.">Coupling azo dye methods for histochemical demonstration of alkaline phosphatase.</a> Nature. 170 (4327), 578-579 (1952).</li><li>Labarta, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+serum+and+endometrial+progesterone+in+determining+endometrial+receptivity.">Analysis of serum and endometrial progesterone in determining endometrial receptivity.</a> Human Reproduction. 36 (11), 2861-2870 (2021).</li></ol>

La decidualizzazione nei topi è un processo spontaneo che dipende dalla presenza di embrioni, che è diverso dagli esseri umani. Tuttavia, è stato scoperto che la stimolazione artificiale come l'iniezione uterina di perle di vetro e la lacerazione uterina può indurre la decidualizzazione dell'endometrio anziché degli embrioni. Inoltre, i ricercatori hanno scoperto che molti fattori potrebbero indurre deciduali o partecipare alla decidualizzazione, come l'iniezione di ormoni steroidei, prostaglandine e fattori inibito...

Con lo sviluppo della tecnologia di riproduzione assistita dall'uomo, l'attuale tasso di gravidanza clinica di fecondazione in vitro-trasferimento di embrioni (IVF-ET) ha raggiunto o addirittura superato quello della gravidanza naturale. Nonostante ciò, molte pazienti nella pratica clinica della riproduzione assistita si sottopongono ancora a trasferimenti multipli di embrioni ma non riescono a ottenere la gravidanza come desiderato. Tuttavia, il suo specifico meccanismo molecolare non è ancora chiaro, quindi l'intervento clinico è inefficace, che è una delle sfide significative che la medicina riproduttiva deve affrontare 1,2.
I fattori endometriali rappresentano circa i due terzi delle cause del fallimento della fecondazione in vitro3. L'impianto dell'embrione umano è diviso in tre fasi: posizionamento, adesione e invasione 4,5,6. L'endometrio materno subisce una serie di cambiamenti per andare incontro all'arrivo dell'embrione. La formazione di un "periodo finestra" di impianto fornisce condizioni favorevoli per l'impianto dell'embrione 7,8.
Nella maggior parte dei mammiferi, dopo che la blastocisti aderisce all'epitelio luminale dell'utero, le cellule stromali che circondano la blastocisti iniziano rapidamente a proliferare e differenziarsi, e il rapido rimodellamento del mesenchima cambia la sua forma e funzione, portando all'impianto dell'embrione 5,9,10. Il rapido aumento del volume e del peso del sito consente alla blastocisti di essere incorporata nello stroma uterino, un processo noto come decidualizzazione11. Lo stroma endometriale si differenzia e si rimodella in preparazione alla gravidanza, mentre la transizione delle cellule stromali fornisce spazio e nuove connessioni di segnalazione per le cellule deciduali per svolgere le loro funzioni12,13. Le cellule stromali si trasformano in cellule deciduali e secernono molti fattori iconici come la prolattina (PRL), la proteina legante il fattore di crescita insulino-simile 1 (Igfbp1) e così via. Gli studi hanno dimostrato che la decidualizzazione anormale è una delle ragioni principali del fallimento dell'impianto dell'embrione, ma la causa della decidualizzazione anormale non è ancora chiara e deve essere ulteriormente chiarita 1,14.
Il modello di decidualizzazione artificiale del topo è essenziale per studiare il processo fisiologico e i meccanismi molecolari alla base della decidualizzazione. La decidualizzazione artificiale (AD) si riferisce principalmente al processo di decidualizzazione endometriale stabilito da metodi artificiali per simulare la gravidanza o il ciclo mestruale. In termini di morfologia, c'è poca differenza complessiva tra decidualizzazione della gravidanza e decidualizzazione artificiale15,16. Le ghiandole uterine esistono nell'endometrio prima della formazione decidua e scompaiono dopo la decidualizzazione. Per quanto riguarda l'espressione genica, è stata identificata solo una leggera differenza tra la decidualizzazione naturale della gravidanza (NPD) e l'AD15. Di conseguenza, il modello di decidualizzazione artificiale nei topi può simulare la decidualizzazione della gravidanza per esplorare la patogenesi sconosciuta e il nuovo trattamento delle malattie riproduttive umane.
NPD, AD e decidualizzazione in vitro (IVD) sono tre metodi per ottenere la decidualizzazione del topo. Il modello NPD dipende dalla gravidanza naturale ed è più vicino allo stato fisiologico materno, compresi gli effetti degli embrioni. Confrontare le differenze tra siti di impianto e non impianto è un approccio più fisiologico e conveniente per studiare la decidualizzazione. Il modello AD è stato sviluppato utilizzando un'iniezione intrauterina di olio di sesamo come stimolante per indurre la decidualizzazione in un topo femmina pseudogravido accoppiato con maschi vasectomizzati per evitare l'impatto degli embrioni. Entrambi i modelli NPD e AD svolgono ruoli essenziali in diversi scopi di ricerca, ma non possono evitare il fallimento dell'accoppiamento e le differenze all'interno del gruppo causate dalle diverse attività del metabolismo ormonale materno. IVD è un metodo che dipende dal trattamento combinato di estrogeni e progesterone a livello cellulare, che richiede condizioni sperimentali più rigorose e capacità operativa. Tuttavia, il modello in vitro non può simulare completamente la risposta deciduale in condizioni fisiologiche15. Pertanto, proponiamo un metodo di induzione semplice e migliorato modificato dall'AD tradizionale per ridurre l'effetto degli ormoni endogeni sulla decidualizzazione. Basato sul garantire il successo dell'induzione della decidualizzazione, è più vicino allo stato fisiologico e più adatto per esperimenti che devono escludere fattori embrionali.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Estrogen</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >E2758</td>
			<td >Hormone supplement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Progesterone</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P0130</td>
			<td>Hormone supplement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sesame oil&#160;</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>S3547</td>
			<td>Hormone supplement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium pentobarbital&#160;</td>
			<td >Dainippon Sumitomo Pharma Co.,Ltd.</td>
			<td ></td>
			<td>Anaesthesia</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Meloxicam injection</td>
			<td >Qilu Animal Health Products Co., Ltd</td>
			<td ></td>
			<td>Analgesia</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alkaline phophatase stain kit(kaplow&#39;s/azo coupling method)</td>
			<td >Solarbio</td>
			<td>G1480</td>
			<td>Alkaline phophatase stain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Eosin</td>
			<td >Servicebio</td>
			<td>G1005-2</td>
			<td>HE stain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hematoxylin</td>
			<td >Servicebio</td>
			<td >G1005-1</td>
			<td>HE stain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix</td>
			<td >Vazyme</td>
			<td>Q711-02</td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >70% ethanol</td>
			<td >Lircon</td>
			<td>ZH1120090</td>
			<td>Disinfect</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Iodophor</td>
			<td >Runzekang</td>
			<td >RZK-DF</td>
			<td>Disinfect</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Erythromycin Eye Ointment</td>
			<td >Guangzhou Baiyunshan</td>
			<td ></td>
			<td>Mice eyeball protect</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >4-0 suture</td>
			<td >Ethicon</td>
			<td >W329</td>
			<td>Incision suture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10% formalin</td>
			<td >Yulu</td>
			<td >L25010118</td>
			<td>Tissue fix</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Optimal cutting temperature compound</td>
			<td >Sakura</td>
			<td >4583</td>
			<td>Ssection</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trizol reagent</td>
			<td >Ambion</td>
			<td >15596018</td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of a mouse artificial decidualization model with ovariectomy for endometrial decidualization research

La decidualizzazione endometriale è un processo di differenziazione unico dell'endometrio, strettamente correlato alle mestruazioni e alla gravidanza. La compromissione della decidualizzazione porta a vari disturbi dell'endometrio, come l'infertilità, l'aborto spontaneo ricorrente e la nascita pretermine. Lo sviluppo e l'uso del modello di decidualizzazione endometriale negli studi riproduttivi sono stati un punto culminante per i ricercatori riproduttivi per molto tempo. Il topo è stato ampiamente utilizzato nello studio della riproduzione e della decidualizzazione. Esistono tre modelli murini ben consolidati per quanto riguarda la decidualizzazione, vale a dire la decidualizzazione naturale della gravidanza (NPD), la decidualizzazione artificiale (AD) e la decidualizzazione in vitro (IVD). Tra questi, AD è considerato un modello affidabile per la decidualizzazione del mouse, che è facile da implementare e vicino a NPD. Questo articolo si concentra su un metodo modificato del processo di generazione e applicazione del modello di decidualizzazione artificiale del topo con ovariectomia per evitare effetti ovarici, che possono ottenere risultati altamente riproducibili con piccole variazioni all'interno del gruppo. Questo metodo fornisce un modello animale buono e affidabile per lo studio della decidualizzazione endometriale.

Gli indici del modello di decidualizzazione del topo includono la morfologia generale dell'utero, il rapporto di massa dell'utero decidualizzato e non decidualizzato, la morfologia istologica dell'endometrio e il livello di espressione delle molecole marcatrici di decidualizzazione. La morfologia generale dell'utero artificiale decidualizzato dei topi indotto dall'olio è più vicina a quella dell'utero in gravidanza. Il corpo uterino diventa spesso e la cavità uterina diventa più piccola del lato non indotto. Il volum...

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Generation of a Mouse Artificial Decidualization Model with Ovariectomy for Endometrial Decidualization Research

Qui, descriviamo il metodo per generare un modello di decidualizzazione artificiale usando il topo ovariectomizzato, un classico esperimento di decidualizzazione endometriale nel campo di ricerca della decidualizzazione endometriale.

Generazione di un modello di decidualizzazione artificiale del topo con ovariectomia per la ricerca sulla decidualizzazione endometriale

Endometrial decidualization is a unique differentiation process of the endometrium, closely related to menstruation and pregnancy. Impairment of ...

La compromissione del decentramento porta al virus dei disturbi endometriali come nella fatalità, un aborto spontaneo ricorrente. Questo metodo fornisce un modello animale valido e affidabile per lo studio del decentramento endometriale. Questo modello di decentralizzazione artificiale con Ovariectomia può evitare l'influenza dell'angelina sugli ormoni che spesso possono risultati altamente riproducibili con piccole differenze all'interno del gruppo.Per iniziare a sterilizzare gli strumenti chirurgici con uno sterilizzatore ad alta temperatura e alta pressione un giorno prima dell'operazione. Applicare l'unguento protettivo per gli occhi ai bulbi oculari per prevenire la secchezza durante l'anestesia. Inizia l'operazione quando i topi sono completamente anestetizzati.Posizionare i topi in posizione prona sulla superficie operatoria e radersi i peli sulla schiena dopo averli bagnati con acqua saponata. Disinfettare la pelle con etanolo al 70%. Trova il sito di incisione dell'operazione a 0,5 centimetri sul bordo superiore della radice della coscia di entrambi gli arti posteriori paralleli alla colonna vertebrale.Prendi il sito di incisione come centro e disinfetta l'area di incisione con iodoporo, tre volte. Fai un'incisione longitudinale di circa 0,5 a un centimetro usando le forbici. Tagliare la fascia e separare passivamente i muscoli con una pinzetta.Trova un pezzo del cuscinetto di grasso bianco nel campo di incisione vicino al polo inferiore del rene attraverso il sottile strato muscolare. Bloccare la massa grassa con clip emostatiche e tirare l'ovaia avvolta dal cuscinetto di grasso dall'incisione. Bloccare la giunzione delle tube di Ovaio e Falloppio con pinzette curve e rimuovere l'ovaio lungo il peduncolo ovarico con le forbici.Interrompere il sanguinamento usando una penna elettrocoagulante o un ago di una siringa da un millilitro riscaldata sulla lampada ad alcool. Risciacquare l'incisione chirurgica con soluzione salina normale per prevenire l'adesione dei tessuti. Utilizzare una sutura 4-0 per seminare rispettivamente il muscolo e la pelle e disinfettare nuovamente l'incisione chirurgica con iodophor.Metti i topi in posizione prona nella gabbia e rianimali in un'incubatrice a 25 gradi Celsius. Dotato di sorgente luminosa e sistema di ventilazione per circa due ore. Prestare attenzione ai topi dopo l'operazione.Rimettili nel luogo di alimentazione originale da soli fino a quando non si riprendono completamente e dai loro abbastanza acqua e cibo. Per via sottocutanea iniettare 100 nanogrammi di estrogeni in 50 microlitri di olio di sesamo in ciascun topo per tre giorni seguiti da due giorni di riposo. Iniettare un milligrammo di progesterone e 10 nanogrammi di estrogeni in 50 microlitri di olio di sesamo in ciascun topo per altri tre giorni.Operare i topi per indurre il modello di residualizzazione artificiale sei ore dopo la terza iniezione combinata di estrogeni progesterone. Trova il corno dell'utero all'estremità inferiore delle tube di Falloppio e inietta lentamente 20 microlitri di olio di sesamo lungo il corno uterino. Spingere indietro il tessuto, suturare l'incisione e consentire al topo di recuperare.Fissare da tre a cinque millilitri di tessuto uterino con il 10% di formalina incorporata in paraffina e sezionarli. Colorare le sezioni con ematossilina ed eosina per osservare i cambiamenti morfologici. Incorporare altri tre-cinque millimetri di tessuto uterino in congelamento composto a temperatura di taglio ottimale in azoto liquido e conservare in un congelatore a meno 80 gradi Celsius.Congelare il tessuto in 10 micrometri e rilevare l'attività della fosfatasi alcalina nel tessuto uterino con il metodo di accoppiamento azoico. La morfologia generale dell'utero artificiale decentralizzato dei topi indotto dall'olio è più vicina a quella dell'utero in gravidanza. Il corpo uterino diventa spesso e la cavità uterina diventa più piccola del lato non indotto.Il volume e il peso del corno uterino indotto sono significativamente superiori a quelli del lato non indotto. La colorazione dell'ematossilina e dell'eosina del tessuto uterino ha mostrato che le ghiandole scompaiono e le cellule stromali endometriali finali sull'indotto strappato si differenziano in grandi cellule deciduali rotonde citoplasmatiche e multinucleate con confini cellulari poco chiari. Le sezioni laterali non indotte mostrano la morfologia del tessuto endometriale in uno stato fisiologico normale.Il risultato del metodo di accoppiamento azoico ha mostrato che il contenuto di fosfatasi alcalina del lato indotto dall'olio era significativamente superiore a quello del lato non indotto. I risultati della QPCR hanno mostrato che l'espressione di mRNA di PRL-8-A-2, ALPL e IGFBP-1 nel corno indotto era significativamente superiore a quella in quello non indotto, suggerendo che l'olio può indurre il decentramento artificiale nei topi. L'integrazione di Homo è un processo lungo che richiede particolare attenzione alla contaminazione tra gli omosessuali che è la chiave del successo.Sulla base di questo modello può essere eseguita l'iniezione di corno uterino di Adenovirus che può studiare il meccanismo rilevante di specifiche molecole che regolano la residualizzazione.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Frozen Buffy Coats using Non-integrating Episomal Plasmids

Generazione di pluripotenti indotte cellule staminali da congelata Buffy cappotti con non-integrazione episomiale Plasmidi

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

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Isolamento di mouse endometriale epiteliali e stromali cellule per<em&gt; In Vitro</em&gt; decidualizzazione

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Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

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Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

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Isolamento delle cellule stromali dell'endometrio umane per In Vitro decidualizzazione

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