Name: generation of a mouse artificial decidualization model with ovariectomy for endometrial decidualization research
Uploaded: 2022-07-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of a Mouse Artificial Decidualization Model with Ovariectomy for Endometrial Decidualization Research at JoVE.com

Os autores desejam agradecer o apoio da National Nature Science Foundation of China (82001629, XQS), do Programa Jovem da Fundação de Ciências Naturais da Província de Jiangsu (BK20200116, XQS) e do Financiamento de Pesquisa de Pós-doutorado da Província de Jiangsu (2021K277B, XQS).

Todos os experimentos com animais descritos foram aprovados pelo Comitê de Uso e Cuidado de Animais do Hospital da Torre de Tambor Afiliado da Faculdade de Medicina da Universidade de Nanjing (nº 20171202). Todas as operações seguem os cuidados e uso adequado dos animais e as diretrizes nacionais.
NOTA: Os camundongos foram criados em ambiente específico livre de patógenos (FPS), com temperatura de 22 °C ± 1 °C, umidade relativa do ar de 50% ± 1%, ciclo claro/escuro de 12 h/12 h e li...

<ol>
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A decidualização em camundongos é um processo espontâneo que depende da presença de embriões, o que é diferente dos humanos. No entanto, verificou-se que a estimulação artificial, como a injeção uterina de contas de vidro e laceração uterina, pode induzir a decidualização do endométrio em vez de embriões. Além disso, pesquisadores descobriram que muitos fatores poderiam induzir a decidualização ou participar da decidualização, como a injeção de hormônios esteroides, prostaglandinas e fatores inib...

Com o desenvolvimento da tecnologia de reprodução assistida por humanos, a atual taxa clínica de gestação de fertilização in vitro-transferência embrionária (FIV-TE) atingiu ou até mesmo excedeu a da gravidez natural. Apesar disso, muitas pacientes na prática clínica de reprodução assistida ainda são submetidas a múltiplas transferências de embriões, mas não conseguem engravidar como desejado. No entanto, seu mecanismo molecular específico ainda não está claro, de modo que a intervenção clínica é ineficaz, o que é um dos desafios significativos enfrentados pela medicinareprodutiva1,2.
Os fatores endometriais são responsáveis por cerca de dois terços das causas de falha da FIV3. A implantação do embrião humano é dividida em três etapas: posicionamento, adesão e invasão 4,5,6. O endométrio materno passa por uma série de mudanças para atender a chegada do embrião. A formação de um "período de janela" de implantação proporciona condições favoráveis para a implantação embrionária 7,8.
Na maioria dos mamíferos, após a adesão do blastocisto ao epitélio luminal do útero, as células estromais ao redor do blastocisto rapidamente começam a proliferar e se diferenciar, e a rápida remodelação do mesênquima muda sua forma e função, levando à implantação embrionária 5,9,10. O rápido aumento do volume e do peso do sítio permite que o blastocisto fique embutido no estroma uterino, processo conhecido como decidualização11. O estroma endometrial diferencia e remodela na preparação para a gestação, enquanto a transição das células estromais fornece espaço e novas conexões de sinalização para que as células deciduais desempenhem suas funções12,13. As células estromais se transformam em células deciduais e secretam muitos fatores icônicos, como prolactina (PRL), proteína ligadora do fator de crescimento semelhante à insulina 1 (Igfbp1), e assim por diante. Estudos têm mostrado que a decidualização anormal é uma das principais razões para o fracasso da implantação embrionária, mas a causa da decidualização anormal ainda não está clara e precisa ser mais bem elucidada 1,14.
O modelo de decidualização artificial em camundongos é essencial para estudar o processo fisiológico e os mecanismos moleculares subjacentes à decidualização. A decidualização artificial (DA) refere-se principalmente ao processo de decidualização endometrial estabelecido por métodos artificiais para simular a gravidez ou o ciclo menstrual. Em termos morfológicos, há pouca diferença global entre a decidualização da gestação e a decidualização artificial15,16. As glândulas uterinas existem no endométrio antes da forma de decídua e desaparecem após a decidualização. Em relação à expressão gênica, apenas uma pequena diferença é identificada entre a decidualização natural da gravidez (DNP) e aDA15. Consequentemente, o modelo de decidualização artificial em camundongos pode simular a decidualização da gravidez para explorar a patogênese desconhecida e o novo tratamento de doenças reprodutivas humanas.
NPD, AD e decidualização in vitro (IVD) são três métodos para alcançar a decidualização em camundongos. O modelo da DNP depende da gestação natural e está mais próximo do estado fisiológico materno, incluindo os efeitos dos embriões. Comparar as diferenças entre os sítios de implantação e não-implantação é uma abordagem mais fisiológica e conveniente para estudar a decidualização. O modelo AD foi desenvolvido usando uma injeção intrauterina de óleo de gergelim como estimulante para induzir a decidualização em uma rata pseudogestante acasaladas com machos vasectomizados para evitar o impacto dos embriões. Ambos os modelos de DNP e DA desempenham papéis essenciais em diferentes propósitos de pesquisa, mas não podem evitar a falha no acasalamento e as diferenças intragrupo causadas pelas diferentes atividades do metabolismo hormonal materno. IVD é um método que depende do tratamento de estrogênio e progesterona combinados em nível celular, que requer condições experimentais mais rigorosas e capacidade operacional. No entanto, o modelo in vitro não consegue simular completamente a resposta decidual em condições fisiológicas15. Portanto, propomos um método de indução simples e aprimorado modificado da DA tradicional para reduzir o efeito dos hormônios endógenos na decidualização. Baseado em garantir o sucesso da indução da decidualização, ele está mais próximo do estado fisiológico e mais adequado para experimentos que precisam excluir fatores embrionários.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Estrogen</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >E2758</td>
			<td >Hormone supplement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Progesterone</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P0130</td>
			<td>Hormone supplement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sesame oil&#160;</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>S3547</td>
			<td>Hormone supplement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium pentobarbital&#160;</td>
			<td >Dainippon Sumitomo Pharma Co.,Ltd.</td>
			<td ></td>
			<td>Anaesthesia</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Meloxicam injection</td>
			<td >Qilu Animal Health Products Co., Ltd</td>
			<td ></td>
			<td>Analgesia</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alkaline phophatase stain kit(kaplow&#39;s/azo coupling method)</td>
			<td >Solarbio</td>
			<td>G1480</td>
			<td>Alkaline phophatase stain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Eosin</td>
			<td >Servicebio</td>
			<td>G1005-2</td>
			<td>HE stain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hematoxylin</td>
			<td >Servicebio</td>
			<td >G1005-1</td>
			<td>HE stain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix</td>
			<td >Vazyme</td>
			<td>Q711-02</td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >70% ethanol</td>
			<td >Lircon</td>
			<td>ZH1120090</td>
			<td>Disinfect</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Iodophor</td>
			<td >Runzekang</td>
			<td >RZK-DF</td>
			<td>Disinfect</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Erythromycin Eye Ointment</td>
			<td >Guangzhou Baiyunshan</td>
			<td ></td>
			<td>Mice eyeball protect</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >4-0 suture</td>
			<td >Ethicon</td>
			<td >W329</td>
			<td>Incision suture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10% formalin</td>
			<td >Yulu</td>
			<td >L25010118</td>
			<td>Tissue fix</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Optimal cutting temperature compound</td>
			<td >Sakura</td>
			<td >4583</td>
			<td>Ssection</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trizol reagent</td>
			<td >Ambion</td>
			<td >15596018</td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of a mouse artificial decidualization model with ovariectomy for endometrial decidualization research

A decidualização endometrial é um processo único de diferenciação do endométrio, intimamente relacionado à menstruação e à gravidez. O comprometimento da decidualização leva a vários distúrbios endometriais, como infertilidade, aborto espontâneo recorrente e parto prematuro. O desenvolvimento e o uso do modelo de decidualização endometrial em estudos reprodutivos têm sido um destaque para os pesquisadores reprodutivos há muito tempo. O camundongo tem sido amplamente utilizado no estudo da reprodução e decidualização. Existem três modelos bem estabelecidos em camundongos em relação à decidualização: decidualização natural da gravidez (NPD), decidualização artificial (AD) e decidualização in vitro (IVD). Dentre eles, o AD é considerado um modelo confiável para decidualização de camundongos, de fácil implementação e próximo ao NPD. Este trabalho enfoca um método modificado do processo de geração e aplicação do modelo de decidualização artificial de camundongos com ooforectomia para evitar efeitos ovarianos, que podem obter resultados altamente reprodutíveis com pequenas variâncias dentro do grupo. Este método fornece um bom e confiável modelo animal para o estudo da decidualização endometrial.

Os índices do modelo de decidualização em camundongos incluem a morfologia geral do útero, a razão de massa do útero decidualizado e não decidualizado, a morfologia histológica do endométrio e o nível de expressão de moléculas marcadoras de decidualização. A morfologia geral do útero artificial decidualizado de camundongos induzido por óleo é mais próxima à do útero na gestação. O corpo uterino torna-se espesso, e a cavidade uterina torna-se menor do que o lado não induzido. O volume e o peso do co...

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Generation of a Mouse Artificial Decidualization Model with Ovariectomy for Endometrial Decidualization Research

Aqui, descrevemos o método de geração de um modelo de decidualização artificial usando a rata ovariectomizada, um experimento clássico de decidualização endometrial no campo de pesquisa da decidualização endometrial.

Geração de um Modelo de Decidualização Artificial em Camundongos com Ovariectomia para Pesquisa em Decidualização Endometrial

Endometrial decidualization is a unique differentiation process of the endometrium, closely related to menstruation and pregnancy. Impairment of ...

O comprometimento da descentralização leva ao vírus de distúrbios endometriais, como na fatalidade, um aborto espontâneo recorrente. Este método fornece um modelo animal bom e confiável para o estudo da descentralização endometrial. Este modelo de descentralização artificial com Ovariectomia pode evitar a influência da angelina sobre os hormônios, que muitas vezes podem ser altamente reprodutíveis com pequenas diferenças dentro dos grupos.Iniciar a esterilização dos instrumentos cirúrgicos com um esterilizador de alta temperatura e alta pressão um dia antes da operação. Aplique a pomada protetora dos olhos nos globos oculares para evitar o ressecamento durante a anestesia. Inicie a operação quando os ratos estiverem completamente anestesiados.Coloque os ratos na posição prona na superfície de operação e raspe os cabelos nas costas depois de molhá-los com água e sabão. Desinfetar a pele com etanol 70%. Encontrar o local da incisão da operação a 0,5 centímetros na borda superior da raiz da coxa de ambos os membros posteriores paralelos à coluna vertebral.Tome o local da incisão como centro e desinfete a área da incisão com iodóforo, três vezes. Faça uma incisão longitudinal de cerca de 0,5 a um centímetro usando tesoura. Corte a fáscia e separe passivamente os músculos com uma pinça.Encontre um pedaço do coxim de gordura branca no campo de incisão perto do polo inferior do rim através da fina camada muscular. Aperte a massa gorda com clipes hemostáticos e puxe o ovário envolvido pelo coxim gorduroso para fora da incisão. Aperte a junção do ovário e das trompas de Falópio com uma pinça curva e remova o ovário ao longo do pedículo ovariano com uma tesoura.Pare de sangrar usando uma caneta de eletrocoagulação ou uma agulha de uma seringa de um mililitro aquecida na lâmpada de álcool. Enxaguar a incisão cirúrgica com soro fisiológico para evitar a adesão tecidual. Use uma sutura 4-0 para semear o músculo e a pele, respectivamente, e desinfete a incisão cirúrgica com iodóforo novamente.Coloque os ratos na posição prona na gaiola e ressuscite-os em uma incubadora de 25 graus Celsius. Equipado com fonte de luz e sistema de ventilação por cerca de duas horas. Preste atenção aos ratos após a operação.Coloque-os de volta no local de alimentação original sozinhos até que se recuperem completamente e dê-lhes água e comida suficientes. Injetar por via subcutânea 100 nanogramas de estrogênio em 50 microlitros de óleo de gergelim em cada camundongo por três dias seguidos de dois dias de descanso. Injete um miligrama de progesterona e 10 nanogramas de estrogênio em 50 microlitros de óleo de gergelim em cada camundongo por mais três dias.Operar os camundongos para induzir o modelo de residualização artificial seis horas após a terceira injeção combinada de estrogênio progesterona. Encontre o chifre do útero na extremidade inferior das trompas de Falópio e injete 20 microlitros de óleo de gergelim lentamente ao longo do corno uterino. Empurre o tecido para trás, suture a incisão e deixe o rato recuperar.Fixar de três a cinco mililitros do tecido uterino com formalina a 10% embebida em parafina e seccioná-los. Corar os cortes com hematoxilina e eosina para observar as alterações morfológicas. Incorpore mais três a cinco milímetros do tecido do útero em temperatura de corte ideal, congele o composto em nitrogênio líquido e armazene em um freezer de 80 graus Celsius negativos.Corte congelado do tecido em 10 micrômetros e detecção da atividade da fosfatase alcalina no tecido uterino pelo método de acoplamento Azo. A morfologia geral do útero artificial descentralizado de camundongos induzido por óleo é mais próxima da do útero na gravidez. O corpo uterino torna-se espesso e a cavidade uterina torna-se menor do que o lado não induzido.O volume e o peso do corno uterino induzido são significativamente maiores do que o do lado não induzido. A coloração de hematoxilina e eosina do tecido uterino mostrou que as glândulas desaparecem e as células do estroma endometrial final do rasgo induzido se diferenciam em grandes células deciduais redondas citoplasmáticas e decíduas multinucleadas com limites celulares pouco claros. Os cortes laterais não induzidos mostram a morfologia do tecido endometrial em estado fisiológico normal.O resultado do método de acoplamento Azo mostrou que o teor de fosfatase alcalina do lado induzido por óleo foi significativamente maior do que o do lado não induzido. Os resultados da QPCR mostraram que a expressão de RNAm de PRL-8-A-2, ALPL e IGFBP-1 no corno induzido foi significativamente maior do que no corno não induzido, sugerindo que o óleo pode induzir descentralização artificial em camundongos. A suplementação de homo é um processo demorado que requer atenção especial a contaminação entre homos, que é a chave para o sucesso.Com base neste modelo pode ser realizada a injeção de adenovírus no corno uterino que pode estudar o mecanismo relevante de moléculas específicas reguladoras da residualização.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Frozen Buffy Coats using Non-integrating Episomal Plasmids

Geração de pluripotentes induzidas a partir de células-tronco Congelado Buffy Coats usando não-integração epissomais Plasmids

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, ...

Biologia do Desenvolvimento

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Isolamento de rato Endometrial epiteliais e estromais para células<em&gt; In Vitro</em&gt; decidualization

Decidualization is a progesterone-dependent differentiation process of endometrial stromal cells and is a prerequisite for successful embryo implantation. ...

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

Geração de iPSC-derivado do cérebro Organóides Humanos para modelar alterações precoces do desenvolvimento neurológico

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks

Renderização tridimensional e análise de Immunolabeled, esclareceu humana da placenta vilosa redes vasculares

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Geração de insulina tridimensional, livre de andaime expressando Pancreatoids do Mouse progenitoras pancreáticas em Vitro

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Isolamento de células do estroma Endometrial humanas para In Vitro Decidualization

The differentiation of human endometrial stromal cells (HESC) from fibroblast-like appearance into secretory decidua is a transformation required for ...

A Mouse Distraction Osteogenesis Model

Um modelo de osteogênese de distração do rato

Distraction osteogenesis (DO) is a surgical procedure that involves skeletal tissue regeneration without cell transplantation. A DO model consists of the ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Na geração de Vitro do Somite derivados de humanos induzida por células tronco pluripotentes

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts

Geração de Organoids de vias biliares extra-hepáticas Mouse

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have ...

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

Geração de organóides endometriais primários humanos multicelulares

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...