Name: mechanostimulation of multicellular organisms through a high-throughput microfluidic compression system
Uploaded: 2022-12-23T13:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mechanostimulation of Multicellular Organisms Through a High-Throughput Microfluidic Compression System at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע (CMMI-1946456), משרד חיל האוויר למחקר מדעי (FA9550-18-1-0262), והמכון הלאומי לבריאות (R01AG06100501A1; R21AR08105201A1).

1. הכנת תבנית פרוסות הסיליקון
<ol><li>נקו את פרוסת הסיליקון (ראו טבלת חומרים) תחילה עם אצטון ולאחר מכן עם אלכוהול איזופרופיל (IPA).</li>
	<li>מניחים את פרוסת הסיליקון על פלטה חמה בטמפרטורה של 250 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לאפייה להתייבשות (איור 3A).</li>
	<li>מצפים את פרוסת ?...

<ol>
	<li>Wang, J. H. -. C., Thampatty, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introductory+review+of+cell+mechanobiology.">An introductory review of cell mechanobiology.</a> Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 5 (1), 1-16 (2006).</li><li>Ingber, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanobiology+and+diseases+of+mechanotransduction.">Mechanobiology and diseases of mechanotransduction.</a> Annals of Medicine. 35 (8), 564-577 (2003).</li><li>Nims, R. J., Pferdehirt, L., Guilak, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanogenetics:+Harnessing+mechanobiology+for+cellular+engineering.">Mechanogenetics: Harnessing mechanobiology for cellular engineering.</a> Current Opinion in Biotechnology. 73, 374-379 (2022).</li><li>Bellin, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+Role+of+Syndecan-4+in+Mechanotransduction+using+Surface-Modification+Approaches.">Defining the Role of Syndecan-4 in Mechanotransduction using Surface-Modification Approaches.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 22102-22107 (2009).</li><li>Simpson, L. J., Reader, J. S., Tzima, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+regulation+of+protein+translation+in+the+cardiovascular+system.">Mechanical regulation of protein translation in the cardiovascular system.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 34 (2020).</li><li>Humphrey, J. D., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+mechanobiology:+Homeostasis,+adaptation,+and+disease.">Vascular mechanobiology: Homeostasis, adaptation, and disease.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 23, 1-27 (2021).</li><li>Maurer, M., Lammerding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+driving+force:+Nuclear+mechanotransduction+in+cellular+function,+fate,+and+disease.">The driving force: Nuclear mechanotransduction in cellular function, fate, and disease.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 21, 443-468 (2019).</li><li>Jennings, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila-A+versatile+model+in+biology+&amp;+medicine.">Drosophila-A versatile model in biology &amp; medicine.</a> Materials Today. 14 (5), 190-195 (2011).</li><li>Konno, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State-of-the-art+technology+of+model+organisms+for+current+human+medicine.">State-of-the-art technology of model organisms for current human medicine.</a> Diagnostics. 10 (6), 392 (2020).</li><li>Morgan, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+limited+inheritance+in+Drosophila.">Sex limited inheritance in Drosophila.</a> Science. 32 (812), 120-122 (1910).</li><li>Wu, Q., Kumar, N., Velagala, V., Zartman, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+to+reverse-engineer+multicellular+systems:+Case+studies+using+the+fruit+fly.">Tools to reverse-engineer multicellular systems: Case studies using the fruit fly.</a> Journal of Biological Engineering. 13 (1), 1-16 (2019).</li><li>Jayamohan, H., et al., Patrinos, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+11+-+Advances+in+Microfluidics+and+Lab-on-a-Chip+Technologies.">Chapter 11 - Advances in Microfluidics and Lab-on-a-Chip Technologies.</a> Molecular Diagnostics. , 197-217 (2017).</li><li>Scheler, O., Postek, W., Garstecki, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+developments+of+microfluidics+as+a+tool+for+biotechnology+and+microbiology.">Recent developments of microfluidics as a tool for biotechnology and microbiology.</a> Current Opinion in Biotechnology. 55, 60-67 (2019).</li><li>Mohammed, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innovative+tools+for+mechanobiology:+Unraveling+outside-in+and+inside-out+mechanotransduction.">Innovative tools for mechanobiology: Unraveling outside-in and inside-out mechanotransduction.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 162 (2019).</li><li>Shorr, A. Z., S&#246;nmez, U. M., Minden, J. S., LeDuc, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+mechanotransduction+in+Drosophila+embryos+with+mesofluidics.">High-throughput mechanotransduction in Drosophila embryos with mesofluidics.</a> Lab on a Chip. 19 (7), 1141-1152 (2019).</li><li>Kim, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanochemical+Actuators+of+Embryonic+Epithelial+Contractility.">Mechanochemical Actuators of Embryonic Epithelial Contractility.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 40, 14366-14371 (2014).</li><li>Ashburner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila. A Laboratory Handbook. , (1989).</li><li>Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+lithography+for+micro-and+nanoscale+patterning.">Soft lithography for micro-and nanoscale patterning.</a> Nature Protocols. 5 (3), 491 (2010).</li><li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+fabrication+process+for+uniform+SU-8+thick+photoresist+structures+by+simultaneously+removing+edge+bead+and+air+bubbles.">A new fabrication process for uniform SU-8 thick photoresist structures by simultaneously removing edge bead and air bubbles.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 21 (12), 125006 (2011).</li><li>Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+lithography.">Soft lithography.</a> Annual Review of Materials Science. 28 (1), 153-184 (1998).</li><li>Sonmez, U. M., Coyle, S., Taylor, R. E., LeDuc, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycarbonate+heat+molding+for+soft+lithography.">Polycarbonate heat molding for soft lithography.</a> Small. 16 (16), 2000241 (2020).</li><li>Levario, T. J., Zhan, M., Lim, B., Shvartsman, S. Y., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+trap+array+for+massively+parallel+imaging+of+Drosophila+embryos.">Microfluidic trap array for massively parallel imaging of Drosophila embryos.</a> Nature Protocols. 8 (4), 721-736 (2013).</li></ol>

המאמר מתאר את התפתחותו של מכשיר מיקרופלואידי ליישור, שיתוק והפעלה מדויקת של גירוי מכני על מאות עוברי דרוזופילה שלמים. השילוב של המערכת המיקרופלואידית עם כיסוי זכוכית דק איפשר הדמיה של עוברים עם מיקרוסקופיה קונפוקלית ברזולוציה גבוהה במהלך הגירוי. המכשיר המיקרופלואידי איפשר גם את אי?...

מערכות חיות חוות ומגיבות ללא הרף לתשומות מכניות שונות במהלך חייהן1. Mechanotransduction נקשר למחלות רבות, כולל הפרעות התפתחותיות, אובדן שרירים ועצמות, ונוירופתולוגיות באמצעות מסלולי איתות המושפעים ישירות או בעקיפין מהסביבה המכנית2. עם זאת, הגנים והחלבונים המווסתים על ידי גירוי מכני3 במסלולי האיתות המכנו-סנסיטיביים4 נותרים ברובם לא ידועים5, ומונעים את הבהרת מנגנוני הוויסות המכני וזיהוי מטרות מולקולריות למחלות הקשורות למכניוטרנסדוקציה פתולוגית 6,7 . אחד הגורמים המגבילים בהקרנת מחקרים מכניוביולוגיים על התהליכים הפיזיולוגיים הקשורים לכך הוא שימוש בתאים בודדים עם כלי תרבית קונבנציונליים במקום באורגניזמים רב-תאיים שלמים. אורגניזמים לדוגמה, כגון Drosophila melanogaster (זבוב הפירות), תרמו רבות להבנת הגנים, מסלולי האיתות והחלבונים המעורבים בהתפתחות בעלי חיים 8,9,10. אף על פי כן, השימוש בדרוזופילה ובאורגניזמי מודל רב-תאיים אחרים במחקר המכנוביולוגי הופרע על ידי אתגרים בכלים ניסיוניים. טכניקות קונבנציונליות להכנה, מיון, הדמיה או יישום גירויים שונים דורשות בעיקר מניפולציה ידנית; גישות אלה גוזלות זמן רב, דורשות מומחיות, מציגות שונות ומגבילות את תכנון הניסוי ואת גודל המדגם11. ההתקדמות המיקרוטכנולוגית האחרונה היא משאב נהדר המאפשר בדיקות ביולוגיות חדשניות עם תפוקה גבוהה מאוד ופרמטרים ניסיוניים מבוקרים מאוד12,13,14.
מאמר זה מתאר את הפיתוח של מכשיר מיקרופלואידי משופר ליישור, שיתוק ויישום מדויק של גירוי מכני בצורה של דחיסה חד-אקסיאלית למאות עוברי דרוזופילה שלמים 15 (איור 1). אינטגרציה של המערכת המיקרופלואידית עם כיסוי זכוכית אפשרה הדמיה קונפוקלית ברזולוציה גבוהה של הדגימות במהלך הגירוי. המכשיר המיקרופלואידי גם איפשר איסוף מהיר של העוברים לאחר הגירוי לבדיקות ריצה -omics (איור 2). הסברים על שיקולי העיצוב של מכשיר זה, כמו גם הייצור באמצעות ליתוגרפיה רכה ואפיון ניסיוני, מתוארים כאן. מכיוון שיצירת תבנית פרוסות סיליקון של מכשיר כזה דורשת ציפוי אחיד של פוטורססיסט עבה (עובי >200 מיקרומטר) על פני שטחים גדולים עם תעלות יחס גובה-רוחב גבוה (AR >5), שיטה זו שינתה במידה ניכרת את פרוטוקול ייצור התבנית הפוטוליתוגרפית המסורתי. בדרך זו, שיטה זו הקלה על הטיפול, ההדבקה, הציפוי, הדפוס והפיתוח של הפוטורסיסט. בנוסף, נדונים מלכודות פוטנציאליות ופתרונותיהן. לבסוף, הרבגוניות של אסטרטגיית תכנון וייצור זו הודגמה באמצעות מערכות רב-תאיות אחרות כגון תאי ביצים דרוזופילה ואורגנואידים מוחיים16.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mL tri-cornered perforated plastic beakers with 60 mm Petri dishes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-955-111B</td>
			<td>Perferate with air holes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm P B &#60;100&#62; 0-100 500um SSP Test Grade Si Wafer</td>
			<td>University Wafer</td>
			<td>452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punches</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>15110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Not brand specific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt needle set</td>
			<td>CML Supply</td>
			<td>901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Contact Mask Aligner</td>
			<td>Quintel</td>
			<td>Q4000 MA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cutting mat</td>
			<td>Dahle</td>
			<td>Vantage 10670</td>
			<td>size: 24&#34; x 36&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Developer</td>
			<td>Kayaku Advance Materials</td>
			<td>SU-8 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct Write Lithographer</td>
			<td>Heidelberg</td>
			<td>MLA100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any commericailly availble dissecting microscope with transmitted light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass petri dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0710&#160; (CS-24/60)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HMDS Vapor Prime Oven</td>
			<td>Yes Engineering</td>
			<td>YES-3TA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Not brand specific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>I5110A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paintbrush</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Not brand specific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>SU-8 2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable pressure source</td>
			<td>hygger Quietest</td>
			<td>HGD946</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure gauge</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-68950-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin Coater</td>
			<td>Laurell</td>
			<td>WS-650-8B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane (PFOCTS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>448931-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X 100</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA16046AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing</td>
			<td>Saint-Gobain</td>
			<td>02-587-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UX-08895-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Pump</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-07164-87</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mechanostimulation of multicellular organisms through a high-throughput microfluidic compression system

במהלך העובר, תנועת תאים מתואמת יוצרת כוחות מכניים המווסתים את ביטוי הגנים ופעילותם. כדי ללמוד את התהליך הזה, כלים כגון שאיפה או דחיסת כיסוי שימשו כדי לעורר באופן מכני עוברים שלמים. גישות אלה מגבילות את התכנון הניסויי מכיוון שהן אינן מדויקות, דורשות טיפול ידני ויכולות לעבד רק כמה עוברים בו זמנית. למערכות מיקרופלואידיות יש פוטנציאל גדול לאוטומציה של משימות ניסיוניות כאלה תוך הגדלת התפוקה והדיוק. מאמר זה מתאר מערכת מיקרופלואידית שפותחה כדי לדחוס במדויק עוברים שלמים של Drosophila melanogaster (זבוב הפירות). מערכת זו כוללת מיקרו-ערוצים עם דפנות מעוותות המופעלות באופן פניאומטי ומאפשרת יישור עוברים, אימוביליזציה, דחיסה ואיסוף לאחר גירוי. על ידי הקבלה של מיקרו-ערוצים אלה לשבעה נתיבים, ניתן ליישם דפוסי דחיסה יציבים או דינמיים על מאות עוברי דרוזופילה בו זמנית. ייצור מערכת זו על מכסה זכוכית מאפשר גירוי מכני בו זמנית והדמיה של דגימות עם מיקרוסקופים ברזולוציה גבוהה. יתר על כן, השימוש בחומרים תואמים ביולוגית, כמו PDMS, והיכולת להזרים נוזל דרך המערכת הופכים את המכשיר הזה לבעל יכולת ניסויים ארוכי טווח עם דגימות תלויות מדיה. גישה זו גם מבטלת את הדרישה להרכבה ידנית אשר מדגישה באופן מכני דגימות. יתר על כן, היכולת לאסוף במהירות דגימות מהמיקרו-ערוצים מאפשרת ניתוחים לאחר גירוי, כולל מבחני -omics הדורשים מספרי דגימות גדולים שאינם ניתנים להשגה באמצעות גישות גירוי מכניות מסורתיות. הגיאומטריה של מערכת זו ניתנת להרחבה בקלות למערכות ביולוגיות שונות, ומאפשרת לשדות רבים ליהנות מהתכונות הפונקציונליות המתוארות כאן, כולל תפוקת דגימה גבוהה, גירוי מכני או אימוביליזציה, ויישור אוטומטי.

המערכת המיקרופלואידית מחולקת לשני תתי-תאים המופרדים על ידי דפנות PDMS מעוותות. התא הראשון הוא המערכת הנוזלית שבה עוברי דרוזופילה מוצגים, מיושרים אוטומטית, מסודרים ודחוסים. התא השני הוא מערכת גז שבה לחץ הגז משני צדי תעלות הדחיסה נשלט באמצעות מיקרו-ערוצים ללא מוצא כדי לשלוט במדויק ב...

Watch this Scientific Journal Video about Mechanostimulation of Multicellular Organisms Through a High-Throughput Microfluidic Compression System at JoVE.com

Mechanostimulation of Multicellular Organisms Through a High-Throughput Microfluidic Compression System

הפרוטוקול הנוכחי מתאר תכנון, ייצור ואפיון של מערכת מיקרופלואידית המסוגלת ליישר, לשתק ולדחוס במדויק מאות עוברי Drosophila melanogaster עם התערבות מינימלית של המשתמש. מערכת זו מאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה ושחזור של דגימות לניתוח לאחר גירוי וניתן לשנות את קנה המידה שלה כך שיתאים למערכות ביולוגיות רב-תאיות אחרות.

מכניסטימולציה של אורגניזמים רב-תאיים באמצעות מערכת דחיסה מיקרופלואידית בעלת תפוקה גבוהה

During embryogenesis, coordinated cell movement generates mechanical forces that regulate gene expression and activity. To study this process, tools such ...

פרוטוקול זה מסביר כיצד לייצר ולהשתמש בטכנולוגיות מיקרופלואידיקה כדי למנף את היתרונות הניסיוניים בתפוקת הדגימות, בטיפול אוטומטי וביכולת להפעיל לחץ מכני באופן מדויק תוך הדמיה בו-זמנית של דגימות. טכניקה זו ממזערת את הטיפול הידני באורגניזמים ביולוגיים רב-תאיים, כגון עוברים ואורגנואידים, לצורך אימוביליזציה, יישור והדמיה חיה. היא גם מאפשרת ליישם להם דחיסה מכנית לצורך לימודי מכנוביולוגיה.ייצור תבניות עם תכונות יחס גובה-רוחב גבוה עבור שבב מיקרופלואידי זה יכול להיות מאתגר עם טכניקות מיקרו-פבריקציה קונבנציונליות. הטיפים המוסברים במאמר וידאו זה יכולים להתגבר על אתגרים אלה. כדי להתחיל, לנקות את רקיק הסיליקון הראשון עם אצטון, ולאחר מכן עם אלכוהול איזופרופיל.מניחים את פרוסת הסיליקון על פלטה חמה של 250 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. להתייבשות לאפות. מצפים את פרוסת הסיליקון בהקסמתיל-דיסילוקסן בתנור אדים ראשוני.הניחו בקבוק של SU-8 2100 Photoresist בתנור של 60 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות כדי להפחית את צמיגותו. יוצקים מיליליטר אחד של הפוטורסיסט המחומם עבור כל סנטימטר של פרוסת הסיליקון המונחת על הפלטה החמה עד שה- Photoresist מכסה את רוב פני השטח. החל תחילה סיבוב מקדים ב-250 סיבובים לדקה למשך 30 שניות, ולאחר מכן ב-350 סיבובים לדקה למשך 30 שניות נוספות, שניהם עם האצה של 100 סל"ד לשנייה.לאחר מכן, החל תחילה סיבוב במהירות של 500 סיבובים לדקה למשך 15 שניות עם האצה של 100 סל"ד לשנייה, ולאחר מכן ב-1, 450 סיבובים לדקה למשך 30 שניות עם האצה של 300 סל"ד לשנייה. הסירו את חרוז הקצה עם ספוגית נקייה לחדר, והתיזו אצטון על הוופל כדי להסיר פגמים ולקדם ציפוי אחיד. חשוף את פרוסת הסיליקון לאור UV מרובע של 350 מילי-ג'ול לסנטימטר דרך מסכת הצילום.בעזרת מיישרת המגע, יש למרוח את האפייה לאחר החשיפה על פרוסת הסיליקון ולהניח לה להתקרר לטמפרטורת החדר. הניחו את הכוס בתוך גדולה יותר, ומלאו את הכוס הגדולה יותר בפתרון מפתח חדש. מניחים רשת מתכת על הכוס.מניחים את פרוסת הסיליקון על רשת המתכת במהופך. השאירו את פרוסת הסיליקון שקועה במפתח במשך 30 דקות עם מערבל מופעל. מעבירים את פרוסת הסיליקון לתוך סוניק אמבטיה קולי מלא מפתח טרי במשך שעה אחת ב 40 קילוהרץ.לאחר מכן הוציאו את הוופל מהכוס, ושטפו אותו בתמיסת מפתח חדשה. הכן את פתרון ה-PDMS שנרפא מראש על-ידי ערבוב בסיס ה-PDMS עם חומר הריפוי ביחס של 10 ל-1. דגה את התערובת על ידי הכנסתה לצנטריפוגה למשך 500 גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.שפכו את ה-PDMS שנרפא מראש על פרוסת סיליקון, והוציאו אותה שוב. לבסוף, הכניסו את ה-PDMS הלא מעובד לתנור של 60 מעלות צלזיוס לריפוי. השתמש באזמל כדי לחתוך את גבולות אזור PDMS שנרפא המתאים לגיאומטריה של השבב המיקרופלואידי.נקב את חורי הכניסה והיציאה ב- PDMS באמצעות ניקוב ביופסיה, או מחט עם קצה קהה. הניחו את ה-PDMS על מגלשת הזכוכית כאשר המשטח המעוצב שלה פונה לכיוון מגלשת הזכוכית לאחר טיפול בפלזמה כדי לאטום את המיקרו-ערוצים באמצעות הדבקה קוולנטית. לאפשר לזבובים בוגרים של Oregon-R להטיל ביצים על צלחות אגר מיץ תפוחים, ולאסוף את הצלחות בזמן ההתפתחותי הרצוי לאחר הטלת הביצים לניסוי הנתון.הציפו את האגר בשטיפת ביצי עוברים, והתסיסו בעדינות את העוברים במכחול כדי לנתק אותם מהאגר. מעבירים את העוברים לתמיסת אקונומיקה של 50% למשך 90 שניות, תוך ערבוב מדי פעם. מסננים את העוברים דרך מסננת רקמה, ושוטפים היטב את תמיסת האקונומיקה במים.העבירו את העוברים לצלחת פטרי מזכוכית 90 מילימטר עם מספיק שטיפת ביצי עוברים כדי לכסות את העוברים במלואם. לבחון את העוברים עם טרנסילומינציה במיקרוסקופ מנתח, ולבחור עוברים בשלב ההתפתחותי הרצוי להעמסה לתוך המכשיר המיקרופלואידי. הגדירו את כל שבעת המיקרו-ערוצים של העוברים על ידי מילוים ב-0.4 מיקרומטר של IPA מסונן דרך פתח הכניסה הראשי של העובר.החלף את ה- IPA ב- 0.4 מיקרומטר של מים מסוננים שעברו דה-יוניזציה. לאחר מכן החלף את מי ה- DI בתמיסת שטיפת ביצים לעובר. אספו כ-100 עוברים שנבחרו מראש מצלחת פטרי הזכוכית באמצעות פיפטה מזכוכית.לאחר מכן, הכניסו את העוברים ליציאת כניסת העובר, והפעילו כשלושה לחצים שליליים של PSI על כניסת הגז באמצעות משאבת ואקום ניידת כדי לפתוח את המיקרו-ערוצים של העובר. לאחר מכן הטה את השבב המיקרופלואידי כלפי מטה כדי שהעוברים יתיישרו באופן אוטומטי ויתמקמו במיקרו-ערוצים של העוברים. אם כניסות המיקרו-ערוצים של העובר נסתמות על-ידי מספר עוברים הנכנסים בו-זמנית, הטה את השבב המיקרופלואידי כלפי מעלה, ולאחר מכן שוב כלפי מטה כדי לנקות את הסתימה.בהתבסס על התפוקה הנדרשת, הכניסו עד 300 עוברים למיקרו-ערוצים של העוברים. לאחר השלמת טעינת העובר, הסר את הוואקום כדי לשתק את העוברים. לאחר מכן הטה את השבב המיקרו-נוזלי בחזרה למצב האופקי.חבר מקור לחץ חיובי נייד עם מד לחץ לכניסת הגז כדי להפעיל שלוש דחיסת PSI. אם ייערכו ניסויי הדמיה חיים על העוברים המגורה מכנית, הניחו את השבב המיקרופלואידי על מחזיק שקופית זכוכית סטנדרטי בשלב מיקרוסקופ כאשר כניסת הגז מחוברת למקור הלחץ. בחנו את העוברים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי בתוך התעלות המיקרופלואידיות.לאחר השלמת ניסוי הדחיסה, ניתן לאסוף את העוברים לניתוח במורד הזרם. כדי לעשות זאת, ראשית, להחיל את הוואקום על כניסת הגז כדי לשחרר את העוברים. לאחר מכן הטה את השבב המיקרופלואידי כלפי מעלה כדי שהעוברים ינועו כלפי מטה לכיוון יציאת ההחדרה של העובר.לאסוף את העוברים מן השבב microfluidic באמצעות פיפטה זכוכית. הפונקציונליות של המכשיר המיקרופלואידי נקבעה באופן ניסיוני על ידי טעינת עוברי דרוזופילה לתעלות הדחיסה והפעלת לחץ חיובי על תעלות הגז. העוברים אינם חווים דחיסה משמעותית תחת ואקום, או במצבי לחץ ניטרליים.הם דחוסים כאשר מופעל לחץ חיובי. מדידות של רוחב העובר הפוחת תחת מיקרוסקופ מדגימות כיצד ניתן להשתמש בלחץ הגז כדי להשיג רמת דחיסת מטרה. התקנים מיקרופלואידיים המיוצרים בדרך זו מאפשרים גירוי כימי של דגימות משותקות.הגירוי מאפשר הדמיה מרחבית גבוהה. שאלה בסיסית בביולוגיה התפתחותית היא כיצד כוחות מכניים מווסתים ביטוי חלבונים וגנים במהלך ההתפתחות? טכנולוגיה זו מאפשרת לנו ליישם גירוי מכני על מספר רב של עוברים בבת אחת, כך שנוכל לבודד כמויות מספיקות של חלבון ורנ"א כדי לבצע פרוטאומיקה השוואתית, או ניסויי תעתיק.זה יאפשר לחוקרים ללמוד יותר על החלבונים והגנים הרגישים לכוחות מכניים.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

Microarrays פולימר לגילוי תפוקה גבוהה של Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

גנרטור ביטוי חלבון תפוקה גבוהה באמצעות פלטפורמת Microfluidic

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

High Throughput Microfluidic Rapid and Low Cost Prototyping Packaging Methods

In this work, 3 different packaging and assembly techniques are presented. They can be classified into two categories: one-time use and reusable packaging ...

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

ניתוח שיטתי של<em&gt; במבחנה</em&gt; תא רולינג באמצעות מערכת microfluidic צלחת רב גם

A major challenge for cell-based therapy is the inability to systemically target a large quantity of viable cells with high efficiency to tissues of ...

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

שימוש בתפוקה גבוהה<em&gt; במבחנה</em&gt; מערכת Microfluidic לפתח Biofilms Multi-מינים שבעל פה

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

באמצעות Tomoauto: פרוטוקול לתפוקה גבוהה אוטומטית קריו אלקטרון טומוגרפיה

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

פלטפורמת Microfluidic עבור בידוד תפוקה גבוהה מתא בודד ותרבות

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

High-throughput Identification of Bacteria Repellent Polymers for Medical Devices

זיהוי תפוקה גבוהה של חיידקים פולימרים דוחה עבור אביזרים ומכשור רפואי

Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

השימוש תפוקה גבוהה אוטומטית Microbioreactor מערכת לייצור של מודל IgG1 בתאים צ'ו

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

A Microfluidic Platform for Stimulating Chondrocytes with Dynamic Compression

פלטפורמת מיקרופלואידיג לעירור כונדרוציטים עם דחיסה דינמית

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth ...