Name: mechanostimulation of multicellular organisms through a high-throughput microfluidic compression system
Uploaded: 2022-12-23T13:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mechanostimulation of Multicellular Organisms Through a High-Throughput Microfluidic Compression System at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato dalla National Science Foundation (CMMI-1946456), dall'Air Force Office of Scientific Research (FA9550-18-1-0262) e dal National Institute of Health (R01AG06100501A1; R21AR08105201A1).

1. Preparazione dello stampo per wafer di silicio
<ol><li>Pulire il wafer di silicio (vedi tabella dei materiali) prima con acetone e poi con alcool isopropilico (IPA).</li>
	<li>Posizionare il wafer di silicio su una piastra calda a 250 °C per 30 minuti per la disidratazione (Figura 3A).</li>
	<li>Rivestire il wafer di silicio con esametildisilazano (HDMS) in un forno a vapore (vedere la tabella dei materiali) (temperatura di processo: 1...

<ol>
	<li>Wang, J. H. -. C., Thampatty, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introductory+review+of+cell+mechanobiology.">An introductory review of cell mechanobiology.</a> Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 5 (1), 1-16 (2006).</li><li>Ingber, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanobiology+and+diseases+of+mechanotransduction.">Mechanobiology and diseases of mechanotransduction.</a> Annals of Medicine. 35 (8), 564-577 (2003).</li><li>Nims, R. J., Pferdehirt, L., Guilak, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanogenetics:+Harnessing+mechanobiology+for+cellular+engineering.">Mechanogenetics: Harnessing mechanobiology for cellular engineering.</a> Current Opinion in Biotechnology. 73, 374-379 (2022).</li><li>Bellin, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+Role+of+Syndecan-4+in+Mechanotransduction+using+Surface-Modification+Approaches.">Defining the Role of Syndecan-4 in Mechanotransduction using Surface-Modification Approaches.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 22102-22107 (2009).</li><li>Simpson, L. J., Reader, J. S., Tzima, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+regulation+of+protein+translation+in+the+cardiovascular+system.">Mechanical regulation of protein translation in the cardiovascular system.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 34 (2020).</li><li>Humphrey, J. D., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+mechanobiology:+Homeostasis,+adaptation,+and+disease.">Vascular mechanobiology: Homeostasis, adaptation, and disease.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 23, 1-27 (2021).</li><li>Maurer, M., Lammerding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+driving+force:+Nuclear+mechanotransduction+in+cellular+function,+fate,+and+disease.">The driving force: Nuclear mechanotransduction in cellular function, fate, and disease.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 21, 443-468 (2019).</li><li>Jennings, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila-A+versatile+model+in+biology+&amp;+medicine.">Drosophila-A versatile model in biology &amp; medicine.</a> Materials Today. 14 (5), 190-195 (2011).</li><li>Konno, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State-of-the-art+technology+of+model+organisms+for+current+human+medicine.">State-of-the-art technology of model organisms for current human medicine.</a> Diagnostics. 10 (6), 392 (2020).</li><li>Morgan, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+limited+inheritance+in+Drosophila.">Sex limited inheritance in Drosophila.</a> Science. 32 (812), 120-122 (1910).</li><li>Wu, Q., Kumar, N., Velagala, V., Zartman, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+to+reverse-engineer+multicellular+systems:+Case+studies+using+the+fruit+fly.">Tools to reverse-engineer multicellular systems: Case studies using the fruit fly.</a> Journal of Biological Engineering. 13 (1), 1-16 (2019).</li><li>Jayamohan, H., et al., Patrinos, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+11+-+Advances+in+Microfluidics+and+Lab-on-a-Chip+Technologies.">Chapter 11 - Advances in Microfluidics and Lab-on-a-Chip Technologies.</a> Molecular Diagnostics. , 197-217 (2017).</li><li>Scheler, O., Postek, W., Garstecki, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+developments+of+microfluidics+as+a+tool+for+biotechnology+and+microbiology.">Recent developments of microfluidics as a tool for biotechnology and microbiology.</a> Current Opinion in Biotechnology. 55, 60-67 (2019).</li><li>Mohammed, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innovative+tools+for+mechanobiology:+Unraveling+outside-in+and+inside-out+mechanotransduction.">Innovative tools for mechanobiology: Unraveling outside-in and inside-out mechanotransduction.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 162 (2019).</li><li>Shorr, A. Z., S&#246;nmez, U. M., Minden, J. S., LeDuc, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+mechanotransduction+in+Drosophila+embryos+with+mesofluidics.">High-throughput mechanotransduction in Drosophila embryos with mesofluidics.</a> Lab on a Chip. 19 (7), 1141-1152 (2019).</li><li>Kim, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanochemical+Actuators+of+Embryonic+Epithelial+Contractility.">Mechanochemical Actuators of Embryonic Epithelial Contractility.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 40, 14366-14371 (2014).</li><li>Ashburner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila. A Laboratory Handbook. , (1989).</li><li>Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+lithography+for+micro-and+nanoscale+patterning.">Soft lithography for micro-and nanoscale patterning.</a> Nature Protocols. 5 (3), 491 (2010).</li><li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+fabrication+process+for+uniform+SU-8+thick+photoresist+structures+by+simultaneously+removing+edge+bead+and+air+bubbles.">A new fabrication process for uniform SU-8 thick photoresist structures by simultaneously removing edge bead and air bubbles.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 21 (12), 125006 (2011).</li><li>Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+lithography.">Soft lithography.</a> Annual Review of Materials Science. 28 (1), 153-184 (1998).</li><li>Sonmez, U. M., Coyle, S., Taylor, R. E., LeDuc, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycarbonate+heat+molding+for+soft+lithography.">Polycarbonate heat molding for soft lithography.</a> Small. 16 (16), 2000241 (2020).</li><li>Levario, T. J., Zhan, M., Lim, B., Shvartsman, S. Y., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+trap+array+for+massively+parallel+imaging+of+Drosophila+embryos.">Microfluidic trap array for massively parallel imaging of Drosophila embryos.</a> Nature Protocols. 8 (4), 721-736 (2013).</li></ol>

L'articolo descrive lo sviluppo di un dispositivo microfluidico per allineare automaticamente, immobilizzare e applicare con precisione la stimolazione meccanica a centinaia di embrioni interi di Drosophila . L'integrazione del sistema microfluidico con un sottile vetrino di copertura ha permesso l'imaging degli embrioni con microscopia confocale ad alta risoluzione durante la stimolazione. Il dispositivo microfluidico ha anche permesso la raccolta degli embrioni subito dopo la stimolazione per l'esecuzione di s...

I sistemi viventi sperimentano e rispondono costantemente a vari input meccanici per tutta la loro vita1. La meccanotrasduzione è stata collegata a molte malattie, tra cui disturbi dello sviluppo, perdita muscolare e ossea e neuropatologie attraverso vie di segnalazione direttamente o indirettamente influenzate dall'ambiente meccanico2. Tuttavia, i geni e le proteine che sono regolati dalla stimolazione meccanica3 nelle vie di segnalazione meccanosensibili4 rimangono in gran parte sconosciuti5, impedendo la delucidazione dei meccanismi di regolazione meccanica e l'identificazione di bersagli molecolari per le malattie associate alla meccanotrasduzione patologica 6,7 . Un fattore limitante nel proiettare gli studi di meccanobiologia sui processi fisiologici correlati è l'utilizzo di singole cellule con piatti di coltura convenzionali invece di organismi multicellulari intatti. Organismi modello, come Drosophila melanogaster (moscerino della frutta), hanno contribuito notevolmente alla comprensione dei geni, delle vie di segnalazione e delle proteine coinvolte nello sviluppo animale 8,9,10. Tuttavia, l'uso di Drosophila e di altri organismi modello multicellulari nella ricerca meccanobiologica è stato ostacolato da sfide con strumenti sperimentali. Le tecniche convenzionali per la preparazione, l'ordinamento, l'imaging o l'applicazione di vari stimoli richiedono principalmente una manipolazione manuale; Questi approcci richiedono tempo, richiedono esperienza, introducono variabilità e limitano il disegno sperimentale e la dimensione del campione11. I recenti progressi microtecnologici sono una grande risorsa per consentire nuovi saggi biologici con un rendimento molto elevato e parametri sperimentali altamente controllati12,13,14.
Questo articolo descrive lo sviluppo di un dispositivo microfluidico potenziato per allineare, immobilizzare e applicare con precisione la stimolazione meccanica sotto forma di compressione uniassiale a centinaia di embrioni interi di Drosophila 15 (Figura 1). L'integrazione del sistema microfluidico con un vetrino di vetro ha permesso l'imaging confocale ad alta risoluzione dei campioni durante la stimolazione. Il dispositivo microfluidico ha anche permesso una rapida raccolta degli embrioni dopo la stimolazione per l'esecuzione di saggi -omici (Figura 2). Le spiegazioni delle considerazioni di progettazione di questo dispositivo, nonché la fabbricazione mediante litografia morbida e caratterizzazione sperimentale, sono descritte nel presente documento. Poiché la realizzazione di uno stampo per wafer di silicio di tale dispositivo richiede un rivestimento uniforme di fotoresist spesso (spessore >200 μm) su ampie aree con trincee ad alto rapporto di aspetto (AR) (AR >5), questo metodo ha modificato considerevolmente il tradizionale protocollo di fabbricazione di stampi fotolitografici. In questo modo, questo metodo ha facilitato la manipolazione, l'adesione, il rivestimento, il pattern e lo sviluppo del fotoresist. Inoltre, vengono discusse le potenziali insidie e le loro soluzioni. Infine, la versatilità di questa strategia di progettazione e fabbricazione è stata dimostrata utilizzando altri sistemi multicellulari come camere d'uovo di Drosophila e organoidi cerebrali16.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mL tri-cornered perforated plastic beakers with 60 mm Petri dishes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-955-111B</td>
			<td>Perferate with air holes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm P B &#60;100&#62; 0-100 500um SSP Test Grade Si Wafer</td>
			<td>University Wafer</td>
			<td>452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punches</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>15110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Not brand specific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt needle set</td>
			<td>CML Supply</td>
			<td>901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Contact Mask Aligner</td>
			<td>Quintel</td>
			<td>Q4000 MA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cutting mat</td>
			<td>Dahle</td>
			<td>Vantage 10670</td>
			<td>size: 24&#34; x 36&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Developer</td>
			<td>Kayaku Advance Materials</td>
			<td>SU-8 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct Write Lithographer</td>
			<td>Heidelberg</td>
			<td>MLA100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any commericailly availble dissecting microscope with transmitted light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass petri dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0710&#160; (CS-24/60)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HMDS Vapor Prime Oven</td>
			<td>Yes Engineering</td>
			<td>YES-3TA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Not brand specific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>I5110A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paintbrush</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Not brand specific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>SU-8 2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable pressure source</td>
			<td>hygger Quietest</td>
			<td>HGD946</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure gauge</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-68950-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin Coater</td>
			<td>Laurell</td>
			<td>WS-650-8B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane (PFOCTS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>448931-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X 100</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA16046AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing</td>
			<td>Saint-Gobain</td>
			<td>02-587-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UX-08895-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Pump</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-07164-87</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mechanostimulation of multicellular organisms through a high-throughput microfluidic compression system

Durante l'embriogenesi, il movimento cellulare coordinato genera forze meccaniche che regolano l'espressione e l'attività genica. Per studiare questo processo, sono stati utilizzati strumenti come l'aspirazione o la compressione del coverslip per stimolare meccanicamente embrioni interi. Questi approcci limitano la progettazione sperimentale in quanto sono imprecisi, richiedono una manipolazione manuale e possono elaborare solo un paio di embrioni contemporaneamente. I sistemi microfluidici hanno un grande potenziale per automatizzare tali attività sperimentali, aumentando al contempo la produttività e la precisione. Questo articolo descrive un sistema microfluidico sviluppato per comprimere con precisione interi embrioni di Drosophila melanogaster (moscerino della frutta). Questo sistema è dotato di microcanali con pareti laterali deformabili azionate pneumaticamente e consente l'allineamento dell'embrione, l'immobilizzazione, la compressione e la raccolta post-stimolazione. Parallelizzando questi microcanali in sette corsie, i modelli di compressione stazionari o dinamici possono essere applicati a centinaia di embrioni di Drosophila contemporaneamente. La fabbricazione di questo sistema su un vetrino facilita la stimolazione meccanica simultanea e l'imaging di campioni con microscopi ad alta risoluzione. Inoltre, l'utilizzo di materiali biocompatibili, come il PDMS, e la capacità di far fluire il fluido attraverso il sistema rendono questo dispositivo capace di esperimenti a lungo termine con campioni dipendenti dai media. Questo approccio elimina anche la necessità di un montaggio manuale che sollecita meccanicamente i campioni. Inoltre, la capacità di raccogliere rapidamente campioni dai microcanali consente analisi post-stimolazione, compresi i saggi -omici che richiedono grandi numeri di campioni irraggiungibili utilizzando i tradizionali approcci di stimolazione meccanica. La geometria di questo sistema è facilmente scalabile a diversi sistemi biologici, consentendo a numerosi campi di beneficiare delle caratteristiche funzionali qui descritte, tra cui l'elevata produttività del campione, la stimolazione meccanica o l'immobilizzazione e l'allineamento automatico.

Il sistema microfluidico è diviso in due sottocompartimenti separati da pareti laterali PDMS deformabili. Il primo compartimento è il sistema liquido in cui vengono introdotti gli embrioni di Drosophila , automaticamente allineati, allineati e compressi. Il secondo compartimento è un sistema a gas in cui la pressione del gas su entrambi i lati dei canali di compressione è controllata tramite microcanali senza uscita per controllare con precisione la larghezza effettiva dei canali di compressione. Il...

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Mechanostimulation of Multicellular Organisms Through a High-Throughput Microfluidic Compression System

Il presente protocollo descrive la progettazione, la fabbricazione e la caratterizzazione di un sistema microfluidico in grado di allineare, immobilizzare e comprimere con precisione centinaia di embrioni di Drosophila melanogaster con un intervento minimo da parte dell'utente. Questo sistema consente l'imaging ad alta risoluzione e il recupero di campioni per l'analisi post-stimolazione e può essere scalato per adattarsi ad altri sistemi biologici multicellulari.

Meccanostimolazione di organismi pluricellulari attraverso un sistema di compressione microfluidica ad alta produttività

During embryogenesis, coordinated cell movement generates mechanical forces that regulate gene expression and activity. To study this process, tools such ...

Questo protocollo spiega come fabbricare e utilizzare le tecnologie microfluidiche per sfruttare i vantaggi sperimentali in termini di produttività dei campioni, gestione automatizzata e capacità di applicare con precisione lo stress meccanico visualizzando contemporaneamente i campioni. Questa tecnica riduce al minimo la manipolazione manuale di organismi biologici multicellulari, come embrioni e organoidi, per la loro immobilizzazione, allineamento e imaging dal vivo. Consente inoltre l'applicazione della compressione meccanica a loro per studi di meccanobiologia.La fabbricazione di stampi con caratteristiche di proporzioni elevate per questo chip microfluidico può essere difficile con le tecniche di microfabbricazione convenzionali. I suggerimenti spiegati in questo articolo video possono superare queste sfide. Per iniziare, pulire il wafer di silicio prima con acetone e poi con alcool isopropilico.Posizionare il wafer di silicio su una piastra calda a 250 gradi Celsius per 30 minuti. Per la disidratazione cuocere. Rivestire il wafer di silicio con esametildisiloxano in un forno a vapore prime.Mettere una bottiglia di SU-8 2100 Photoresist in un forno a 60 gradi Celsius per 15 minuti per ridurne la viscosità. Versare un millilitro di Photoresist riscaldato per ogni pollice del wafer di silicio posto sulla piastra riscaldante fino a quando il Photoresist copre la maggior parte della superficie. Applicare il pre-spin prima a 250 rotazioni al minuto per 30 secondi, quindi a 350 rotazioni al minuto per altri 30 secondi, entrambi con un'accelerazione di 100 RPM al secondo.Quindi, applicare prima una rotazione a 500 rotazioni al minuto per 15 secondi con accelerazione di 100 RPM al secondo, quindi a 1.450 rotazioni al minuto per 30 secondi con accelerazione di 300 RPM al secondo. Rimuovere il bordo con un tampone per camera bianca e spruzzare acetone sul wafer per rimuovere le imperfezioni e promuovere un rivestimento uniforme. Esporre il wafer di silicone a 350 millijoule per centimetro quadrato di luce UV attraverso la maschera fotografica.Utilizzando l'allineatore della maschera di contatto, applicare il forno post-esposizione sul wafer di silicio e lasciarlo raffreddare a temperatura ambiente. Posiziona il becher all'interno di un altro becher più grande e riempi il becher più grande con una nuova soluzione per sviluppatori. Posizionare una rete metallica sul becher.Posizionare il wafer di silicio sulla rete metallica capovolta. Lasciare il wafer di silicio immerso nello sviluppatore per 30 minuti con l'agitatore acceso. Trasferire il wafer di silicio in un sonicatore a bagno ad ultrasuoni riempito con lo sviluppatore fresco per un'ora a 40 kilohertz.Quindi estrarre il wafer dal becher e lavarlo con una nuova soluzione di sviluppo. Preparare la soluzione PDMS pre-polimerizzata mescolando la base PDMS con l'agente di polimerizzazione con un rapporto di 10 a uno. Degasare la miscela mettendola in centrifuga per 500 g per cinque minuti a temperatura ambiente.Versare il PDMS prestampato su un wafer di silicio e degasarlo nuovamente. Infine, posizionare il PDMS non polimerizzato in forno a 60 gradi Celsius per la polimerizzazione. Utilizzare un bisturi per tagliare i bordi della regione PDMS polimerizzata corrispondente alla geometria del chip microfluidico.Perforare i fori di ingresso e uscita sul PDMS usando un punzone per biopsia o un ago con una punta smussata. Posizionare il PDMS sul vetrino con la superficie modellata rivolta verso il vetrino dopo il trattamento al plasma per sigillare i microcanali tramite legame covalente. Consentire alle mosche adulte Oregon-R di deporre le uova su piastre di agar di succo di mela e raccogliere le piastre al momento di sviluppo desiderato dopo la deposizione delle uova per l'esperimento dato.Inondare l'agar con il lavaggio dell'uovo dell'embrione e agitare delicatamente gli embrioni con un pennello per rimuoverli dall'agar. Trasferire gli embrioni in una soluzione di candeggina al 50% per 90 secondi, mescolando di tanto in tanto. Filtrare gli embrioni attraverso un setaccio di tessuto e lavare accuratamente la soluzione di candeggina con acqua.Trasferire gli embrioni in una capsula di Petri di vetro da 90 millimetri con un lavaggio sufficiente dell'ovulo embrionale per coprire completamente gli embrioni. Esaminare gli embrioni con transilluminazione su un microscopio da dissezione e selezionare gli embrioni dello stadio di sviluppo desiderato per il caricamento nel dispositivo microfluidico. Innesca tutti e sette i microcanali embrionali riempiendoli con 0,4 micrometri di IPA filtrato attraverso la porta principale di ingresso dell'embrione.Sostituire l'alcool isopropilico con 0,4 micrometri di acqua deionizzata filtrata. Quindi sostituire l'acqua DI con la soluzione di lavaggio dell'uovo dell'embrione. Raccogliere circa 100 embrioni preselezionati dalla capsula di Petri di vetro utilizzando una pipetta di vetro.Quindi, pipettare gli embrioni nella porta di ingresso dell'embrione e applicare circa tre pressioni negative PSI all'ingresso del gas utilizzando una pompa per vuoto portatile per aprire i microcanali dell'embrione. Quindi inclinare il chip microfluidico verso il basso in modo che gli embrioni si allineino automaticamente e si stabiliscano nei microcanali dell'embrione. Se gli ingressi dei microcanali dell'embrione vengono ostruiti da più embrioni che entrano contemporaneamente, inclinare il chip microfluidico verso l'alto e poi di nuovo verso il basso per eliminare l'intasamento.In base alla produttività richiesta, introdurre fino a 300 embrioni nei microcanali embrionali. Una volta completato il carico dell'embrione, rimuovere il vuoto per immobilizzare gli embrioni. Quindi inclinare il chip microfluidico in posizione orizzontale.Collegare una sorgente di pressione positiva portatile con un manometro all'ingresso del gas per applicare tre compressione PSI. Se verranno condotti esperimenti di imaging dal vivo sugli embrioni stimolati meccanicamente, posizionare il chip microfluidico su un supporto per vetrino da palcoscenico standard per microscopio con l'ingresso del gas collegato alla sorgente di pressione. Esaminare gli embrioni al microscopio fluorescente all'interno dei canali microfluidici.Una volta completato l'esperimento di compressione, gli embrioni possono essere raccolti per l'analisi a valle. Per fare questo, in primo luogo, applicare il vuoto all'ingresso del gas per liberare gli embrioni. Quindi inclinare il chip microfluidico verso l'alto affinché gli embrioni si spostino verso il basso verso la porta di introduzione dell'embrione.Raccogliere gli embrioni dal chip microfluidico usando una pipetta di vetro. La funzionalità del dispositivo microfluidico è stata determinata sperimentalmente caricando embrioni di Drosophila nei canali di compressione e applicando una pressione positiva ai canali del gas. Gli embrioni non subiscono una compressione significativa sotto vuoto o in stati di pressione neutra.Vengono compressi quando viene applicata una pressione positiva. Le misurazioni della larghezza decrescente degli embrioni al microscopio dimostrano come la pressione del gas può essere utilizzata per ottenere un livello di compressione target. I dispositivi microfluidici così realizzati consentono la stimolazione chimica dei campioni immobilizzati.La stimolazione consente un'elevata imaging spaziotemporale. Una domanda fondamentale nella biologia dello sviluppo è come le forze meccaniche regolano l'espressione di proteine e geni durante lo sviluppo? Questa tecnologia ci consente di applicare la stimolazione meccanica a un gran numero di embrioni contemporaneamente, in modo da poter isolare quantità sufficienti di proteine e RNA per eseguire esperimenti comparativi di proteomica o trascrittomica.Ciò consentirà ai ricercatori di saperne di più sulle proteine e sui geni sensibili alle forze meccaniche.

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Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

Analisi sistematica delle<em&gt; In Vitro</em&gt; Cella rotolamento Utilizzando un piatto multi-ben Sistema Microfluidic

A major challenge for cell-based therapy is the inability to systemically target a large quantity of viable cells with high efficiency to tissues of ...

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

L&#39;uso di un high-throughput<em&gt; In Vitro</em&gt; Microfluidic sistema per sviluppare orale biofilm Multi-specie

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Usando Tomoauto: un protocollo per High-throughput automatizzato Cryo-elettrone Tomografia

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Una piattaforma Microfluidic per l&#39;isolamento Single-cell high-throughput e cultura

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

High-throughput Identification of Bacteria Repellent Polymers for Medical Devices

High-throughput identificazione di batteri Polimeri repellente per dispositivi medici

Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Uso di High-Throughput Microbioreactor sistema automatizzato per la produzione del modello IgG1 in cellule CHO

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

A Microfluidic Platform for Stimulating Chondrocytes with Dynamic Compression

Una piattaforma microfluidica per stimolare i condrociti con la compressione dinamica

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth ...