Name: mechanostimulation of multicellular organisms through a high-throughput microfluidic compression system
Uploaded: 2022-12-23T13:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mechanostimulation of Multicellular Organisms Through a High-Throughput Microfluidic Compression System at JoVE.com

この研究は、国立科学財団(CMMI-1946456)、空軍科学研究局(FA9550-18-1-0262)、および国立衛生研究所(R01AG06100501A1;R21AR08105201A1)。

1. シリコンウェーハモールドの準備
<ol><li>シリコンウェーハ( 材料表を参照)を最初にアセトンで洗浄し、次にイソプロピルアルコール(IPA)で洗浄します。</li>
	<li>シリコンウェーハを250°Cのホットプレートに30分間置き、脱水ベークを行います(図3A)。</li>
	<li>シリコンウェーハをベーパープライムオーブン( 材料表を参照)でヘキサ?...

<ol>
	<li>Wang, J. H. -. C., Thampatty, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introductory+review+of+cell+mechanobiology.">An introductory review of cell mechanobiology.</a> Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 5 (1), 1-16 (2006).</li><li>Ingber, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanobiology+and+diseases+of+mechanotransduction.">Mechanobiology and diseases of mechanotransduction.</a> Annals of Medicine. 35 (8), 564-577 (2003).</li><li>Nims, R. J., Pferdehirt, L., Guilak, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanogenetics:+Harnessing+mechanobiology+for+cellular+engineering.">Mechanogenetics: Harnessing mechanobiology for cellular engineering.</a> Current Opinion in Biotechnology. 73, 374-379 (2022).</li><li>Bellin, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+Role+of+Syndecan-4+in+Mechanotransduction+using+Surface-Modification+Approaches.">Defining the Role of Syndecan-4 in Mechanotransduction using Surface-Modification Approaches.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 22102-22107 (2009).</li><li>Simpson, L. J., Reader, J. S., Tzima, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+regulation+of+protein+translation+in+the+cardiovascular+system.">Mechanical regulation of protein translation in the cardiovascular system.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 34 (2020).</li><li>Humphrey, J. D., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+mechanobiology:+Homeostasis,+adaptation,+and+disease.">Vascular mechanobiology: Homeostasis, adaptation, and disease.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 23, 1-27 (2021).</li><li>Maurer, M., Lammerding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+driving+force:+Nuclear+mechanotransduction+in+cellular+function,+fate,+and+disease.">The driving force: Nuclear mechanotransduction in cellular function, fate, and disease.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 21, 443-468 (2019).</li><li>Jennings, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila-A+versatile+model+in+biology+&amp;+medicine.">Drosophila-A versatile model in biology &amp; medicine.</a> Materials Today. 14 (5), 190-195 (2011).</li><li>Konno, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State-of-the-art+technology+of+model+organisms+for+current+human+medicine.">State-of-the-art technology of model organisms for current human medicine.</a> Diagnostics. 10 (6), 392 (2020).</li><li>Morgan, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+limited+inheritance+in+Drosophila.">Sex limited inheritance in Drosophila.</a> Science. 32 (812), 120-122 (1910).</li><li>Wu, Q., Kumar, N., Velagala, V., Zartman, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+to+reverse-engineer+multicellular+systems:+Case+studies+using+the+fruit+fly.">Tools to reverse-engineer multicellular systems: Case studies using the fruit fly.</a> Journal of Biological Engineering. 13 (1), 1-16 (2019).</li><li>Jayamohan, H., et al., Patrinos, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+11+-+Advances+in+Microfluidics+and+Lab-on-a-Chip+Technologies.">Chapter 11 - Advances in Microfluidics and Lab-on-a-Chip Technologies.</a> Molecular Diagnostics. , 197-217 (2017).</li><li>Scheler, O., Postek, W., Garstecki, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+developments+of+microfluidics+as+a+tool+for+biotechnology+and+microbiology.">Recent developments of microfluidics as a tool for biotechnology and microbiology.</a> Current Opinion in Biotechnology. 55, 60-67 (2019).</li><li>Mohammed, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innovative+tools+for+mechanobiology:+Unraveling+outside-in+and+inside-out+mechanotransduction.">Innovative tools for mechanobiology: Unraveling outside-in and inside-out mechanotransduction.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 162 (2019).</li><li>Shorr, A. Z., S&#246;nmez, U. M., Minden, J. S., LeDuc, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+mechanotransduction+in+Drosophila+embryos+with+mesofluidics.">High-throughput mechanotransduction in Drosophila embryos with mesofluidics.</a> Lab on a Chip. 19 (7), 1141-1152 (2019).</li><li>Kim, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanochemical+Actuators+of+Embryonic+Epithelial+Contractility.">Mechanochemical Actuators of Embryonic Epithelial Contractility.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 40, 14366-14371 (2014).</li><li>Ashburner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila. A Laboratory Handbook. , (1989).</li><li>Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+lithography+for+micro-and+nanoscale+patterning.">Soft lithography for micro-and nanoscale patterning.</a> Nature Protocols. 5 (3), 491 (2010).</li><li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+fabrication+process+for+uniform+SU-8+thick+photoresist+structures+by+simultaneously+removing+edge+bead+and+air+bubbles.">A new fabrication process for uniform SU-8 thick photoresist structures by simultaneously removing edge bead and air bubbles.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 21 (12), 125006 (2011).</li><li>Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+lithography.">Soft lithography.</a> Annual Review of Materials Science. 28 (1), 153-184 (1998).</li><li>Sonmez, U. M., Coyle, S., Taylor, R. E., LeDuc, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycarbonate+heat+molding+for+soft+lithography.">Polycarbonate heat molding for soft lithography.</a> Small. 16 (16), 2000241 (2020).</li><li>Levario, T. J., Zhan, M., Lim, B., Shvartsman, S. Y., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+trap+array+for+massively+parallel+imaging+of+Drosophila+embryos.">Microfluidic trap array for massively parallel imaging of Drosophila embryos.</a> Nature Protocols. 8 (4), 721-736 (2013).</li></ol>

この記事では、何百もの ショウジョウバエ 胚全体に機械的刺激を自動的に整列させ、固定し、正確に適用するマイクロ流体デバイスの開発について説明しています。マイクロ流体システムと薄いガラスカバーガラスの統合により、刺激中に高解像度の共焦点顕微鏡で胚をイメージングすることができました。マイクロ流体デバイスは、下流の生物学的アッセイを実行するための刺激?...

生命システムは、その生涯を通じて常にさまざまな機械的入力を経験し、応答します1。メカノトランスダクションは、発達障害、筋肉や骨の喪失、機械的環境によって直接的または間接的に影響を受けるシグナル伝達経路を介した神経病理学など、多くの疾患に関連しています2。しかし、機械受容性シグナル伝達経路4における機械的刺激3によって制御される遺伝子やタンパク質はほとんど分かっておらず5、機械的制御機構の解明や病的メカノトランスダクションに関連する疾患の分子標的の同定は進んでいません6,7。.メカノバイオロジー研究を関連する生理学的プロセスに投影する際の制限要因の1つは、無傷の多細胞生物の代わりに、従来の培養皿で個々の細胞を使用することです。ショウジョウバエ(ショウジョウバエ)などのモデル生物は、動物の発生に関与する遺伝子、シグナル伝達経路、およびタンパク質の理解に大きく貢献しています8,9,10。しかし、ショウジョウバエなどの多細胞モデル生物をメカノバイオロジー研究に利用することは、実験ツールの課題によって妨げられてきました。様々な刺激を準備、ソート、イメージング、または適用するための従来の技術は、ほとんどが手動操作を必要とする。これらのアプローチは時間がかかり、専門知識を必要とし、ばらつきをもたらし、実験計画とサンプルサイズを制限します11。最近のマイクロテクノロジーの進歩は、非常に高いスループットと高度に制御された実験パラメータを備えた新しい生物学的アッセイを可能にするための優れたリソースです12、13、14。
本稿では、ショ ウジョウバエ の数百個の胚全体に一軸圧縮の形で機械的刺激を整列させ、固定し、正確に適用するための強化されたマイクロ流体デバイスの開発について説明します15(図1)。マイクロ流体システムとガラスカバーガラスの統合により、刺激中のサンプルの高解像度共焦点イメージングが可能になりました。また、マイクロ流体デバイスは、オミクスアッセイを実行するための刺激後の胚の迅速な収集を可能にしました(図2)。このデバイスの設計上の考慮事項の説明、ならびにソフトリソグラフィおよび実験的特性評価を使用した製造を本明細書に記載する。このようなデバイスのシリコンウェーハモールドを製造するには、高アスペクト比(AR)トレンチ(AR >5)を備えた大面積にわたって厚いフォトレジスト(厚さ>200μm)を均一にコーティングする必要があるため、この方法は従来のフォトリソグラフィモールド製造プロトコルを大幅に変更しました。このようにして、この方法は、フォトレジストの取り扱い、接着、コーティング、パターニング、および現像を容易にした。さらに、潜在的な落とし穴とその解決策についても説明します。最後に、この設計および製造戦略の多様性は、 ショウジョウバエ 卵室や脳オルガノイドなどの他の多細胞システムを使用して実証されました16。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mL tri-cornered perforated plastic beakers with 60 mm Petri dishes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-955-111B</td>
			<td>Perferate with air holes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm P B &#60;100&#62; 0-100 500um SSP Test Grade Si Wafer</td>
			<td>University Wafer</td>
			<td>452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punches</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>15110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Not brand specific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt needle set</td>
			<td>CML Supply</td>
			<td>901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Contact Mask Aligner</td>
			<td>Quintel</td>
			<td>Q4000 MA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cutting mat</td>
			<td>Dahle</td>
			<td>Vantage 10670</td>
			<td>size: 24&#34; x 36&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Developer</td>
			<td>Kayaku Advance Materials</td>
			<td>SU-8 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct Write Lithographer</td>
			<td>Heidelberg</td>
			<td>MLA100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any commericailly availble dissecting microscope with transmitted light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass petri dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0710&#160; (CS-24/60)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HMDS Vapor Prime Oven</td>
			<td>Yes Engineering</td>
			<td>YES-3TA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Not brand specific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>I5110A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paintbrush</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Not brand specific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>SU-8 2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable pressure source</td>
			<td>hygger Quietest</td>
			<td>HGD946</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure gauge</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-68950-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin Coater</td>
			<td>Laurell</td>
			<td>WS-650-8B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane (PFOCTS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>448931-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X 100</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA16046AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing</td>
			<td>Saint-Gobain</td>
			<td>02-587-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UX-08895-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Pump</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-07164-87</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mechanostimulation of multicellular organisms through a high-throughput microfluidic compression system

胚形成中、協調的な細胞運動は、遺伝子発現および活性を調節する機械的な力を生成する。このプロセスを研究するために、吸引やカバーガラス圧縮などのツールを使用して、胚全体を機械的に刺激してきました。これらのアプローチは、不正確であり、手動処理を必要とし、同時に数個の胚しか処理できないため、実験計画を制限します。マイクロ流体システムは、スループットと精度を向上させながら、このような実験タスクを自動化する大きな可能性を秘めています。この記事では、ショウジョウバエ メラノガスター(ショウジョウバエ )胚全体を正確に圧縮するために開発されたマイクロ流体システムについて説明します。このシステムは、空気圧で作動する変形可能な側壁を備えたマイクロチャネルを備えており、胚の整列、固定化、圧縮、および刺激後の収集を可能にします。これらのマイクロチャネルを7つのレーンに並列化することにより、安定したまたは動的な圧縮パターンを数百の ショウジョウバエ 胚に同時に適用できます。このシステムをガラスカバーガラス上に製造することで、高解像度顕微鏡によるサンプルの機械的刺激とイメージングを同時に行うことができます。さらに、PDMSのような生体適合性材料の利用と、システム内を流体を流す能力により、このデバイスは媒体依存サンプルを用いた長期実験が可能です。このアプローチにより、サンプルに機械的にストレスを与える手動取り付けの必要性もなくなります。さらに、マイクロチャネルからサンプルを迅速に収集できるため、従来の機械的刺激アプローチでは達成できない大量のサンプルを必要とするオミクスアッセイを含む、刺激後の分析が可能になります。このシステムの形状は、異なる生物学的システムに対して容易に拡張可能であり、多数の分野が、高いサンプルスループット、機械的刺激または固定化、および自動アライメントを含む本明細書に記載される機能的特徴から利益を得ることを可能にする。

マイクロ流体システムは、変形可能なPDMS側壁によって分離された2つのサブコンパートメントに分割されています。最初のコンパートメントは、 ショウジョウバエ の胚が導入され、自動的に整列され、整列され、圧縮される液体システムです。2番目のコンパートメントは、圧縮チャネルの有効幅を正確に制御するために、圧縮チャネルの両側のガス圧力が行き止まりのマイクロチャ?...

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Mechanostimulation of Multicellular Organisms Through a High-Throughput Microfluidic Compression System

本プロトコルは、最小限のユーザー介入で数百の ショウジョウバエメラノガスター 胚を整列、固定化、および正確に圧縮することができるマイクロ流体システムの設計、製造、および特性評価について説明しています。このシステムは、刺激後分析のためのサンプルの高解像度イメージングと回収を可能にし、他の多細胞生物学的システムに対応するように拡張することができます。

ハイスループットマイクロ流体圧縮システムによる多細胞生物のメカノ刺激

During embryogenesis, coordinated cell movement generates mechanical forces that regulate gene expression and activity. To study this process, tools such ...

このプロトコルでは、マイクロフルイディクス技術を製造および使用して、サンプルスループット、自動処理、およびサンプルを視覚化しながら機械的ストレスを正確に適用する機能における実験上の利点を活用する方法について説明します。この技術は、胚やオルガノイドなどの多細胞生物の固定化、整列、およびライブイメージングのための手動処理を最小限に抑えます。また、メカノバイオロジー研究のために機械的圧縮を適用することもできます。このマイクロ流体チップの高アスペクト比機能を備えた金型の製造は、従来の微細加工技術では困難な場合があります。このビデオ記事で説明されているヒントは、これらの課題を克服できます。まず、シリコンウェーハを最初にアセトンで洗浄し、次にイソプロピルアルコールで洗浄します。シリコンウェーハを摂氏250度のホットプレートに30分間置きます。脱水焼くために。シリコンウェーハを蒸気プライムオーブンでヘキサメチルジシロキサンでコーティングします。SU-8 2100フォトレジストのボトルを摂氏60度のオーブンに15分間置き、粘度を下げます。ホットプレートに置かれたシリコンウェーハの1インチごとに、フォトレジストが表面の大部分を覆うまで、1ミリリットルの加熱されたフォトレジストを注ぎます。最初に毎分250回転で30秒間、次に毎分350回転でさらに30秒間、どちらも毎秒100RPMの加速でプリスピンを適用します。次に、最初に毎分500回転で毎秒100 RPMの加速度で15秒間スピンを適用し、次に毎秒1, 450回転で毎秒300 RPMの加速度で30秒間スピンを適用します。クリーンルームスワブでエッジビードを取り除き、ウェーハにアセトンをスプレーして欠陥を取り除き、均一なコーティングを促進します。シリコンウェーハをフォトマスクを通してセンチメートル四方の350ミリジュールのUV光にさらします。コンタクトマスクアライナーを使用して、シリコンウェーハに露光後ベークを適用し、室温まで冷却します。ビーカーを別の大きなビーカーの中に置き、大きなビーカーに新しい現像液を入れます。ビーカーに金属メッシュを置きます。シリコンウェーハを逆さまに金属メッシュの上に置きます。シリコンウェーハを現像液に沈め、スターラーをオンにした状態で30分間放置します。シリコンウェーハを、40キロヘルツで1時間新鮮な現像液で満たされた超音波浴超音波処理装置に移します。次に、ビーカーからウェーハを取り出し、新しい現像液で洗浄します。PDMSベースと硬化剤とを10対1の比率で混合することにより、プリキュアPDMS溶液を調製します。混合物を室温で5分間500gの遠心分離機に入れて脱気します。プリキュアPDMSをシリコンウェーハに注ぎ、再度脱気します。最後に、未硬化のPDMSを摂氏60度のオーブンに入れて硬化させます。メスを使用して、マイクロ流体チップの形状に対応する硬化PDMS領域の境界を切断します。生検パンチ、または先端が鈍い針を使用して、PDMSの入口と出口の穴を打ち抜きます。プラズマ処理後、PDMSをスライドガラス上にパターン面を向けてスライドガラス上に置き、共有結合によってマイクロチャネルを封止します。オレゴン-R成虫のハエがリンゴジュース寒天プレートに卵を産むのを許し、与えられた実験のために産卵後の望ましい発育時間にプレートを集める。寒天に胚卵洗浄液を浸し、絵筆で胚を静かに攪拌して寒天から取り除きます。胚を50%漂白剤溶液に90秒間移し、時々攪拌する。組織ふるいを通して胚をこすり、漂白剤溶液を水で徹底的に洗い流します。胚を完全に覆うのに十分な胚卵洗浄で90ミリメートルのガラスペトリ皿に胚を移します。解剖顕微鏡で透過照明で胚を調べ、マイクロ流体デバイスにロードするための所望の発生段階の胚を選択します。7つの胚マイクロチャネルすべてを、メインの胚導入ポートから0.4マイクロメートルのろ過IPAで充填することにより、プライミングします。IPAを0.4マイクロメートルのろ過された脱イオン水と交換します。次に、DI水を胚卵洗浄液に交換します。ガラスピペットを使用して、ガラスペトリ皿から約100個の事前に選択された胚を収集します。次に、胚を胚導入ポートにピペットで入れ、ポータブル真空ポンプを使用してガス入口に約3PSI陰圧を加え、胚マイクロチャネルを開きます。次に、マイクロ流体チップを下向きに傾けて、胚が自動的に整列して胚のマイクロチャネルに定着します。同時に入ってくる複数の胚によって胚のマイクロチャネル入口が詰まった場合は、マイクロ流体チップを上に傾けてから、再び下に傾けて詰まりを取り除きます。必要なスループットに基づいて、最大300個の胚を胚マイクロチャネルに導入します。胚の装填が完了したら、真空を取り除き、胚を固定します。次に、マイクロ流体チップを水平位置に戻します。圧力計付きのポータブル陽圧源をガス入口に接続して、3つのPSI圧縮を適用します。機械的に刺激された胚に対してライブイメージング実験を行う場合は、マイクロ流体チップを標準的な顕微鏡ステージのガラススライドホルダーに置き、ガス入口を圧力源に接続します。マイクロ流体チャネル内の蛍光顕微鏡下で胚を調べます。圧縮実験が完了したら、胚を収集して下流分析を行うことができます。これを行うには、まず、胚を解放するためにガス入口に真空を適用します。次に、マイクロ流体チップを上に傾けて、胚が胚導入ポートに向かって下方に移動します。ガラスピペットを使用してマイクロ流体チップから胚を採取します。マイクロ流体デバイスの機能性は、ショウジョウバエの胚を圧縮チャネルにロードし、ガスチャネルに陽圧を加えることによって実験的に決定されました。胚は、真空下または中性圧状態で有意な圧迫を受けません。陽圧が加えられると圧縮されます。顕微鏡下での胚の減少幅の測定は、ガス圧を使用して目標の圧縮レベルを取得する方法を示しています。このようにして作られたマイクロ流体デバイスは、固定化されたサンプルの化学的刺激を可能にする。この刺激により、高い時空間イメージングが可能になります。発生生物学における基本的な問題は、発生中のタンパク質と遺伝子発現を機械的な力がどのように制御するかということです。この技術により、一度に多数の胚に機械的刺激を加えることができるため、比較プロテオミクスまたはトランスクリプトミクス実験を行うのに十分な量のタンパク質とRNAを分離することができます。これにより、研究者は機械的な力に敏感なタンパク質や遺伝子についてさらに学ぶことができます。

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動的圧縮で軟性細胞を刺激するマイクロ流体プラットフォーム

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth ...