Name: mechanostimulation of multicellular organisms through a high-throughput microfluidic compression system
Uploaded: 2022-12-23T13:15:00
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이 연구는 국립 과학 재단 (CMMI-1946456), 공군 과학 연구실 (FA9550-18-1-0262) 및 국립 보건원 (R01AG06100501A1; R21AR08105201A1).

1. 실리콘 웨이퍼 몰드의 제조
<ol><li>실리콘 웨이퍼( 재료 표 참조)를 먼저 아세톤으로 청소한 다음 이소프로필 알코올(IPA)로 청소합니다.</li>
	<li>탈수 베이크를 위해 실리콘 웨이퍼를 250°C 핫 플레이트에 30분 동안 놓습니다(그림 3A).</li>
	<li>증기 프라임 오븐에서 실리콘 웨이퍼를 헥사메틸디실라잔(HDMS)으로 코팅합니다(재료 표 참조)(?...

<ol>
	<li>Wang, J. H. -. C., Thampatty, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introductory+review+of+cell+mechanobiology.">An introductory review of cell mechanobiology.</a> Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 5 (1), 1-16 (2006).</li><li>Ingber, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanobiology+and+diseases+of+mechanotransduction.">Mechanobiology and diseases of mechanotransduction.</a> Annals of Medicine. 35 (8), 564-577 (2003).</li><li>Nims, R. J., Pferdehirt, L., Guilak, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanogenetics:+Harnessing+mechanobiology+for+cellular+engineering.">Mechanogenetics: Harnessing mechanobiology for cellular engineering.</a> Current Opinion in Biotechnology. 73, 374-379 (2022).</li><li>Bellin, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+Role+of+Syndecan-4+in+Mechanotransduction+using+Surface-Modification+Approaches.">Defining the Role of Syndecan-4 in Mechanotransduction using Surface-Modification Approaches.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 22102-22107 (2009).</li><li>Simpson, L. J., Reader, J. 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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila-A+versatile+model+in+biology+&amp;+medicine.">Drosophila-A versatile model in biology &amp; medicine.</a> Materials Today. 14 (5), 190-195 (2011).</li><li>Konno, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State-of-the-art+technology+of+model+organisms+for+current+human+medicine.">State-of-the-art technology of model organisms for current human medicine.</a> Diagnostics. 10 (6), 392 (2020).</li><li>Morgan, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+limited+inheritance+in+Drosophila.">Sex limited inheritance in Drosophila.</a> Science. 32 (812), 120-122 (1910).</li><li>Wu, Q., Kumar, N., Velagala, V., Zartman, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+to+reverse-engineer+multicellular+systems:+Case+studies+using+the+fruit+fly.">Tools to reverse-engineer multicellular systems: Case studies using the fruit fly.</a> Journal of Biological Engineering. 13 (1), 1-16 (2019).</li><li>Jayamohan, H., et al., Patrinos, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+11+-+Advances+in+Microfluidics+and+Lab-on-a-Chip+Technologies.">Chapter 11 - Advances in Microfluidics and Lab-on-a-Chip Technologies.</a> Molecular Diagnostics. , 197-217 (2017).</li><li>Scheler, O., Postek, W., Garstecki, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+developments+of+microfluidics+as+a+tool+for+biotechnology+and+microbiology.">Recent developments of microfluidics as a tool for biotechnology and microbiology.</a> Current Opinion in Biotechnology. 55, 60-67 (2019).</li><li>Mohammed, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innovative+tools+for+mechanobiology:+Unraveling+outside-in+and+inside-out+mechanotransduction.">Innovative tools for mechanobiology: Unraveling outside-in and inside-out mechanotransduction.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 162 (2019).</li><li>Shorr, A. Z., S&#246;nmez, U. M., Minden, J. S., LeDuc, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+mechanotransduction+in+Drosophila+embryos+with+mesofluidics.">High-throughput mechanotransduction in Drosophila embryos with mesofluidics.</a> Lab on a Chip. 19 (7), 1141-1152 (2019).</li><li>Kim, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanochemical+Actuators+of+Embryonic+Epithelial+Contractility.">Mechanochemical Actuators of Embryonic Epithelial Contractility.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 40, 14366-14371 (2014).</li><li>Ashburner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila. A Laboratory Handbook. , (1989).</li><li>Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+lithography+for+micro-and+nanoscale+patterning.">Soft lithography for micro-and nanoscale patterning.</a> Nature Protocols. 5 (3), 491 (2010).</li><li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+fabrication+process+for+uniform+SU-8+thick+photoresist+structures+by+simultaneously+removing+edge+bead+and+air+bubbles.">A new fabrication process for uniform SU-8 thick photoresist structures by simultaneously removing edge bead and air bubbles.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 21 (12), 125006 (2011).</li><li>Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+lithography.">Soft lithography.</a> Annual Review of Materials Science. 28 (1), 153-184 (1998).</li><li>Sonmez, U. M., Coyle, S., Taylor, R. E., LeDuc, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycarbonate+heat+molding+for+soft+lithography.">Polycarbonate heat molding for soft lithography.</a> Small. 16 (16), 2000241 (2020).</li><li>Levario, T. J., Zhan, M., Lim, B., Shvartsman, S. Y., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+trap+array+for+massively+parallel+imaging+of+Drosophila+embryos.">Microfluidic trap array for massively parallel imaging of Drosophila embryos.</a> Nature Protocols. 8 (4), 721-736 (2013).</li></ol>

이 기사는 수백 개의 전체 초파리 배아에 기계적 자극을 자동으로 정렬, 고정 및 정확하게 적용하는 미세 유체 장치의 개발에 대해 설명합니다. 미세 유체 시스템과 얇은 유리 커버 슬립의 통합은 자극 중에 고해상도 컨포칼 현미경으로 배아의 이미징을 가능하게했습니다. 미세유체 장치는 또한 다운스트림 생물학적 분석을 실행하기 위한 자극 직후 배아의 수집을 가능하게 했습니다. 이 ?...

살아있는 시스템은 일생 동안 다양한 기계적 입력을 지속적으로 경험하고 반응합니다1. 기계 변환은 발달 장애, 근육 및 뼈 손실,기계적 환경에 의해 직간접적으로 영향을 받는 신호 경로를 통한 신경병리를 포함한 많은 질병과 관련이 있습니다2. 그러나 기계감응성 신호전달 경로4에서 기계적 자극3에 의해 조절되는 유전자와 단백질은크게 알려지지 않은 상태로 남아 있으며5, 기계적 조절 메커니즘의 해명 및 병리학적 기계변환과 관련된 질병에 대한 분자 표적의 식별을 방해합니다.6,7 . 기계 생물학 연구를 관련 생리적 과정에 투영하는 데있어 한 가지 제한 요소는 손상되지 않은 다세포 유기체 대신 기존 배양 접시가있는 개별 세포를 사용하는 것입니다. 초파리 멜라노가스터(초파리)와 같은 모델 유기체는 동물 발달에 관여하는 유전자, 신호 경로 및 단백질을 이해하는 데 크게 기여했습니다 8,9,10. 그럼에도 불구하고 기계 생물학 연구에서 초파리 및 기타 다세포 모델 유기체를 사용하는 것은 실험 도구의 문제로 인해 방해를 받았습니다. 다양한 자극을 준비, 분류, 이미징 또는 적용하기위한 기존의 기술은 대부분 수동 조작이 필요합니다. 이러한 접근 방식은 시간이 많이 걸리고 전문 지식이 필요하며 변동성을 도입하고 실험 설계 및 표본 크기를 제한합니다11. 최근의 마이크로 기술 발전은 매우 높은 처리량과 고도로 제어 된 실험 매개 변수12,13,14로 새로운 생물학적 분석을 가능하게하는 훌륭한 리소스입니다.
이 기사는 수백 개의 전체 초파리 배아에 단축 압축 형태로 기계적 자극을 정렬, 고정 및 정확하게 적용하기 위한 향상된 미세유체 장치의 개발에 대해 설명합니다15(그림 1). 미세 유체 시스템과 유리 커버 슬립의 통합은 자극 동안 샘플의 고해상도 컨포칼 이미징을 가능하게했습니다. 미세유체 장치는 또한 -omics 분석을 실행하기 위한 자극 후 배아의 빠른 수집을 가능하게 했습니다(그림 2). 이 장치의 설계 고려 사항에 대한 설명과 소프트 리소그래피 및 실험 특성화를 사용한 제조가 여기에 설명되어 있습니다. 이러한 장치의 실리콘 웨이퍼 몰드를 만들려면 높은 종횡비 (AR) 트렌치 (AR >5)가있는 넓은 영역에 두꺼운 포토 레지스트 (두께 >200μm)를 균일하게 코팅해야하기 때문에이 방법은 기존의 포토 리소그래피 금형 제작 프로토콜을 상당히 수정했습니다. 이러한 방식으로, 이 방법은 포토레지스트의 취급, 접착, 코팅, 패터닝 및 개발을 용이하게 하였다. 또한 잠재적 인 함정과 그 해결책에 대해 논의합니다. 마지막으로, 이 설계 및 제조 전략의 다양성은 초파리 난실 및 뇌 오가노이드16과 같은 다른 다세포 시스템을 사용하여 입증되었습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mL tri-cornered perforated plastic beakers with 60 mm Petri dishes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-955-111B</td>
			<td>Perferate with air holes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm P B &#60;100&#62; 0-100 500um SSP Test Grade Si Wafer</td>
			<td>University Wafer</td>
			<td>452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punches</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>15110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Not brand specific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt needle set</td>
			<td>CML Supply</td>
			<td>901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Contact Mask Aligner</td>
			<td>Quintel</td>
			<td>Q4000 MA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cutting mat</td>
			<td>Dahle</td>
			<td>Vantage 10670</td>
			<td>size: 24&#34; x 36&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Developer</td>
			<td>Kayaku Advance Materials</td>
			<td>SU-8 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct Write Lithographer</td>
			<td>Heidelberg</td>
			<td>MLA100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any commericailly availble dissecting microscope with transmitted light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass petri dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0710&#160; (CS-24/60)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HMDS Vapor Prime Oven</td>
			<td>Yes Engineering</td>
			<td>YES-3TA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Not brand specific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>I5110A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paintbrush</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Not brand specific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>SU-8 2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable pressure source</td>
			<td>hygger Quietest</td>
			<td>HGD946</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure gauge</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-68950-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin Coater</td>
			<td>Laurell</td>
			<td>WS-650-8B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane (PFOCTS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>448931-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X 100</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA16046AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing</td>
			<td>Saint-Gobain</td>
			<td>02-587-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UX-08895-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Pump</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-07164-87</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mechanostimulation of multicellular organisms through a high-throughput microfluidic compression system

배아 발생 동안 조정 된 세포 이동은 유전자 발현과 활성을 조절하는 기계적 힘을 생성합니다. 이 과정을 연구하기 위해 흡인 또는 커버 슬립 압축과 같은 도구를 사용하여 전체 배아를 기계적으로 자극했습니다. 이러한 접근 방식은 부정확하고 수동 처리가 필요하며 동시에 몇 개의 배아만 처리할 수 있으므로 실험 설계를 제한합니다. 미세 유체 시스템은 처리량과 정밀도를 높이면서 이러한 실험 작업을 자동화할 수 있는 큰 잠재력을 가지고 있습니다. 이 기사에서는 전체 초 파리 멜라노가스터(초 파리) 배아를 정밀하게 압축하기 위해 개발된 미세 유체 시스템에 대해 설명합니다. 이 시스템은 공압으로 작동되는 변형 가능한 측벽이 있는 마이크로채널을 특징으로 하며 배아 정렬, 고정화, 압축 및 자극 후 수집을 가능하게 합니다. 이러한 마이크로 채널을 7 개의 레인으로 병렬화함으로써 꾸준하거나 역동적 인 압축 패턴을 수백 개의 초파리 배아에 동시에 적용 할 수 있습니다. 유리 커버슬립에 이 시스템을 제작하면 고해상도 현미경으로 샘플을 동시에 기계적 자극과 이미징할 수 있습니다. 또한 PDMS와 같은 생체 적합성 재료를 활용하고 시스템을 통해 유체를 흐르게 하는 기능으로 인해 이 장치는 매체 의존형 샘플로 장기간 실험할 수 있습니다. 이 접근 방식은 또한 기계적으로 시료에 스트레스를 주는 수동 장착의 필요성을 제거합니다. 또한 마이크로채널에서 샘플을 신속하게 수집할 수 있는 기능은 기존의 기계적 자극 접근 방식으로는 얻을 수 없는 많은 샘플 수를 필요로 하는 -omics 분석을 포함하여 자극 후 분석을 가능하게 합니다. 이 시스템의 기하학적 구조는 다양한 생물학적 시스템으로 쉽게 확장 가능하여, 많은 분야가 높은 샘플 처리량, 기계적 자극 또는 고정화, 및 자동 정렬을 포함하여 여기에 설명된 기능적 특징으로부터 이익을 얻을 수 있도록 합니다.

마이크로유체 시스템은 변형가능한 PDMS 측벽에 의해 분리된 2개의 서브-구획으로 분할된다. 첫 번째 구획은 초파리 배아가 도입되고 자동으로 정렬되고 정렬되고 압축되는 액체 시스템입니다. 두 번째 구획은 압축 채널의 유효 폭을 정밀하게 제어하기 위해 막 다른 마이크로 채널을 통해 압축 채널 양쪽의 가스 압력이 제어되는 가스 시스템입니다. 미세유체 장치는 바닥에 유리 슬라...

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Mechanostimulation of Multicellular Organisms Through a High-Throughput Microfluidic Compression System

본 프로토콜은 최소한의 사용자 개입으로 수백 개의 초파리 멜라노가스터 배아를 정렬, 고정 및 정밀하게 압축할 수 있는 미세유체 시스템의 설계, 제조 및 특성화를 설명합니다. 이 시스템은 자극 후 분석을 위한 샘플의 고해상도 이미징 및 회수를 가능하게 하며 다른 다세포 생물학적 시스템을 수용하도록 확장할 수 있습니다.

고처리량 미세유체 압축 시스템을 통한 다세포 유기체의 기계자극

During embryogenesis, coordinated cell movement generates mechanical forces that regulate gene expression and activity. To study this process, tools such ...

이 프로토콜은 미세 유체 기술을 제작하고 사용하여 시료 처리량, 자동 처리 및 시료를 시각화하는 동시에 기계적 응력을 정확하게 적용하는 능력의 실험적 이점을 활용하는 방법을 설명합니다. 이 기술은 고정화, 정렬 및 라이브 이미징을 위해 배아 및 오가노이드와 같은 다세포 생물학적 유기체의 수동 취급을 최소화합니다. 또한 기계 생물학 연구를 위해 기계적 압축을 적용 할 수 있습니다.이 미세 유체 칩에 대해 높은 종횡비 기능을 가진 금형을 제작하는 것은 기존의 미세 가공 기술로는 어려울 수 있습니다. 이 비디오 기사에서 설명하는 팁은 이러한 문제를 극복 할 수 있습니다. 시작하려면 실리콘 웨이퍼를 먼저 아세톤으로 청소 한 다음 이소 프로필 알코올로 청소하십시오.실리콘 웨이퍼를 섭씨 250도 핫 플레이트에 30 분 동안 놓습니다. 탈수 베이크용. 실리콘 웨이퍼를 증기 프라임 오븐에서 헥사메틸디실록산으로 코팅합니다.SU-8 2100 포토레지스트 한 병을 섭씨 60도 오븐에 15분 동안 넣어 점도를 낮춥니다. 포토레지스트가 표면의 대부분을 덮을 때까지 핫 플레이트에 놓인 실리콘 웨이퍼의 각 인치에 대해 가열된 포토레지스트 1밀리리터를 붓습니다. 먼저 분당 250 회전으로 30 초 동안 프리 스핀을 적용한 다음 초당 350 회전으로 30 초 동안 100 회전으로 초당 100RPM의 가속을 적용합니다.다음으로, 초당 100RPM 가속으로 15 초 동안 분당 500 회전으로 스핀을 먼저 적용한 다음 초당 300RPM 가속으로 30 초 동안 분당 1, 450 회전으로 스핀을 적용하십시오. 클린룸 면봉으로 가장자리 비드를 제거하고 웨이퍼에 아세톤을 뿌려 결함을 제거하고 균일한 코팅을 촉진합니다. 실리콘 웨이퍼를 포토 마스크를 통해 센티미터당 350밀리줄의 정사각형 UV 광에 노출시킵니다.접촉식 마스크 얼라이너를 사용하여 노출 후 베이크를 실리콘 웨이퍼에 적용하고 실온으로 식힙니다. 비커를 다른 큰 비커 안에 넣고 더 큰 비커에 새로운 현상액 용액을 채웁니다. 비커에 금속 메쉬를 놓습니다.실리콘 웨이퍼를 금속 메쉬에 거꾸로 놓습니다. 교반기를 켠 상태에서 실리콘 웨이퍼를 현상액에 30분 동안 담가 두십시오. 실리콘 웨이퍼를 40 킬로 헤르츠에서 1 시간 동안 신선한 현상액으로 채워진 초음파 욕조 초음파 처리기로 옮깁니다.그런 다음 비커에서 웨이퍼를 꺼내 새로운 현상액으로 씻으십시오. PDMS 베이스와 경화제를 10:1 비율로 혼합하여 사전 경화된 PDMS 용액을 준비합니다. 혼합물을 실온에서 5분 동안 500 g의 원심분리기에 넣어 탈기시킨다.사전 경화된 PDMS를 실리콘 웨이퍼에 붓고 다시 가스를 제거합니다. 마지막으로 경화되지 않은 PDMS를 섭씨 60도 오븐에 넣어 경화시킵니다. 메스를 사용하여 미세유체 칩 기하구조에 상응하는 경화된 PDMS 영역의 경계를 절단한다.생검 펀치 또는 끝이 뭉툭한 바늘을 사용하여 PDMS의 입구 및 출구 구멍을 펀칭합니다. PDMS를 플라즈마 처리 후 패턴 표면이 유리 슬라이드를 향하도록 유리 슬라이드에 놓고 공유 결합을 통해 마이크로채널을 밀봉합니다. Oregon-R 성인 파리가 사과 주스 한천 접시에 알을 낳고 주어진 실험을 위해 알을 낳은 후 원하는 발달 시간에 접시를 수집하도록합니다.한천에 배아 난자를 씻고 붓으로 배아를 부드럽게 저어 한천에서 제거합니다. 배아를 50 % 표백제 용액에 90 초 동안 옮기고 가끔 저어줍니다. 조직 체를 통해 배아를 변형시키고 표백제를 물로 완전히 씻어냅니다.배아를 완전히 덮을 수 있을 만큼 충분한 배아 난자 세척이 있는 90mm 유리 페트리 접시에 배아를 옮깁니다. 해부 현미경으로 형질 조사하여 배아를 검사하고 미세 유체 장치에 로딩하기 위해 원하는 발달 단계의 배아를 선택하십시오. 주 배아 입구 포트를 통해 0.4 마이크로미터의 여과된 IPA로 채워 7개의 배아 마이크로채널 모두를 프라이밍합니다.IPA를 0.4마이크로미터의 여과된 탈이온수로 교체합니다. 그런 다음 DI 물을 배아 난자 세척 용액으로 교체하십시오. 유리 피펫을 사용하여 유리 페트리 접시에서 약 100 개의 미리 선택된 배아를 수집합니다.다음으로, 배아를 배아 입구 포트 내로 피펫팅하고, 휴대용 진공 펌프를 사용하여 가스 유입구에 대략 3 PSI 음압을 가하여 배아 마이크로채널을 개방한다. 그런 다음 배아가 자동으로 정렬되고 배아 미세 채널에 정착하도록 미세 유체 칩을 아래쪽으로 기울입니다. 배아 마이크로 채널 입구가 동시에 들어가는 여러 배아에 의해 막히면 미세 유체 칩을 위쪽으로 기울인 다음 다시 아래로 기울여 막힘을 제거합니다.필요한 처리량에 따라 최대 300개의 배아를 배아 마이크로채널에 도입합니다. 배아 로딩이 완료되면 진공을 제거하여 배아를 고정시킵니다. 그런 다음 마이크로 유체 칩을 다시 수평 위치로 기울입니다.압력 게이지가 있는 휴대용 양압원을 가스 유입구에 연결하여 3개의 PSI 압축을 적용합니다. 기계적으로 자극된 배아에 대해 라이브 이미징 실험을 수행할 경우 가스 주입구가 압력 소스에 연결된 표준 현미경 스테이지 유리 슬라이드 홀더에 미세유체 칩을 놓습니다. 미세유체 채널 내부의 형광 현미경으로 배아를 검사합니다.압축 실험이 완료되면 다운스트림 분석을 위해 배아를 수집할 수 있습니다. 이렇게하려면 먼저 가스 입구에 진공을 적용하여 배아를 자유롭게하십시오. 그런 다음 배아가 배아 도입 포트를 향해 아래쪽으로 이동하도록 미세 유체 칩을 위쪽으로 기울입니다.유리 피펫을 사용하여 미세유체 칩으로부터 배아를 수집한다. 미세 유체 장치의 기능은 Drosophila 배아를 압축 채널에 넣고 가스 채널에 양압을 가함으로써 실험적으로 결정되었습니다. 배아는 진공 상태에서 또는 중성 압력 상태에서 상당한 압박을 경험하지 않습니다.양압이 가해지면 압축됩니다. 현미경으로 배아의 감소하는 폭을 측정하면 가스 압력을 사용하여 목표 압축 수준을 얻는 방법을 알 수 있습니다. 이러한 방식으로 만들어진 미세 유체 장치는 고정 된 샘플의 화학적 자극을 허용합니다.자극은 높은 시공간 이미징을 허용합니다. 발달 생물학의 근본적인 질문은 기계적 힘이 발달 중에 단백질과 유전자 발현을 어떻게 조절하는가입니다. 이 기술을 사용하면 한 번에 많은 수의 배아에 기계적 자극을 가할 수 있으므로 비교 단백질체학 또는 전사체학 실험을 수행하기에 충분한 양의 단백질과 RNA를 분리할 수 있습니다.이를 통해 연구자들은 기계적 힘에 민감한 단백질과 유전자에 대해 더 많이 배울 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

Biomaterials 높은 처리량 발견을위한 폴리머 Microarrays

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

연구

생체공학

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

마이크로 유체 플랫폼을 사용하여 높은 처리량 단백질 표현 생성기

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

High Throughput Microfluidic Rapid and Low Cost Prototyping Packaging Methods

높은 처리량 마이크로 유체 신속하고 저렴한 비용으로 프로토 타입 포장 방법

In this work, 3 different packaging and assembly techniques are presented. They can be classified into two categories: one-time use and reusable packaging ...

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

의 체계적인 분석<em&gt; 체외</em멀티 웰 플레이트 미세 유체 시스템을 사용하여&gt; 셀 롤링

A major challenge for cell-based therapy is the inability to systemically target a large quantity of viable cells with high efficiency to tissues of ...

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

높은 처리량의 사용<em&gt; 체외</em&gt; 미세 유체 시스템 구강 다중 종의 바이오 필름을 개발하는

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Tomoauto 사용 : 프로토콜 높은 처리량 자동화 된 곳을 알아내는 - 전자 단층 촬영을 위해

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

높은 처리량 단일 세포의 분리 및 문화를위한 미세 유체 플랫폼

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

High-throughput Identification of Bacteria Repellent Polymers for Medical Devices

의료 기기에 대한 박테리아의 높은 처리량 식별 구충제 폴리머

Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

높은 처리량의 사용 모델 IgG1 조 세포에서의 생산을 위한 Microbioreactor 시스템 자동화

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

A Microfluidic Platform for Stimulating Chondrocytes with Dynamic Compression

동적 압축으로 연골 세포 자극을 위한 미세 유체 플랫폼

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth ...