Name: mechanostimulation of multicellular organisms through a high-throughput microfluidic compression system
Uploaded: 2022-12-23T13:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mechanostimulation of Multicellular Organisms Through a High-Throughput Microfluidic Compression System at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pela National Science Foundation (CMMI-1946456), pelo Escritório de Pesquisa Científica da Força Aérea (FA9550-18-1-0262) e pelo Instituto Nacional de Saúde (R01AG06100501A1; R21AR08105201A1).

1. Preparação do molde de bolacha de silício
<ol><li>Limpe a bolacha de silício (ver Tabela de Materiais) primeiro com acetona e depois com álcool isopropílico (IPA).</li>
	<li>Colocar a bolacha de silício sobre uma placa quente de 250 °C durante 30 minutos para desidratação (figura 3A).</li>
	<li>Revestir a bolacha de silício com hexametildisilazano (HDMS) num forno de vapor prime (ver Tabela de Materiais) (temperatura do proce...

<ol>
	<li>Wang, J. H. -. C., Thampatty, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introductory+review+of+cell+mechanobiology.">An introductory review of cell mechanobiology.</a> Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 5 (1), 1-16 (2006).</li><li>Ingber, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanobiology+and+diseases+of+mechanotransduction.">Mechanobiology and diseases of mechanotransduction.</a> Annals of Medicine. 35 (8), 564-577 (2003).</li><li>Nims, R. J., Pferdehirt, L., Guilak, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanogenetics:+Harnessing+mechanobiology+for+cellular+engineering.">Mechanogenetics: Harnessing mechanobiology for cellular engineering.</a> Current Opinion in Biotechnology. 73, 374-379 (2022).</li><li>Bellin, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+Role+of+Syndecan-4+in+Mechanotransduction+using+Surface-Modification+Approaches.">Defining the Role of Syndecan-4 in Mechanotransduction using Surface-Modification Approaches.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 22102-22107 (2009).</li><li>Simpson, L. J., Reader, J. S., Tzima, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+regulation+of+protein+translation+in+the+cardiovascular+system.">Mechanical regulation of protein translation in the cardiovascular system.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 34 (2020).</li><li>Humphrey, J. D., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+mechanobiology:+Homeostasis,+adaptation,+and+disease.">Vascular mechanobiology: Homeostasis, adaptation, and disease.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 23, 1-27 (2021).</li><li>Maurer, M., Lammerding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+driving+force:+Nuclear+mechanotransduction+in+cellular+function,+fate,+and+disease.">The driving force: Nuclear mechanotransduction in cellular function, fate, and disease.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 21, 443-468 (2019).</li><li>Jennings, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila-A+versatile+model+in+biology+&amp;+medicine.">Drosophila-A versatile model in biology &amp; medicine.</a> Materials Today. 14 (5), 190-195 (2011).</li><li>Konno, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State-of-the-art+technology+of+model+organisms+for+current+human+medicine.">State-of-the-art technology of model organisms for current human medicine.</a> Diagnostics. 10 (6), 392 (2020).</li><li>Morgan, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+limited+inheritance+in+Drosophila.">Sex limited inheritance in Drosophila.</a> Science. 32 (812), 120-122 (1910).</li><li>Wu, Q., Kumar, N., Velagala, V., Zartman, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+to+reverse-engineer+multicellular+systems:+Case+studies+using+the+fruit+fly.">Tools to reverse-engineer multicellular systems: Case studies using the fruit fly.</a> Journal of Biological Engineering. 13 (1), 1-16 (2019).</li><li>Jayamohan, H., et al., Patrinos, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+11+-+Advances+in+Microfluidics+and+Lab-on-a-Chip+Technologies.">Chapter 11 - Advances in Microfluidics and Lab-on-a-Chip Technologies.</a> Molecular Diagnostics. , 197-217 (2017).</li><li>Scheler, O., Postek, W., Garstecki, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+developments+of+microfluidics+as+a+tool+for+biotechnology+and+microbiology.">Recent developments of microfluidics as a tool for biotechnology and microbiology.</a> Current Opinion in Biotechnology. 55, 60-67 (2019).</li><li>Mohammed, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innovative+tools+for+mechanobiology:+Unraveling+outside-in+and+inside-out+mechanotransduction.">Innovative tools for mechanobiology: Unraveling outside-in and inside-out mechanotransduction.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 162 (2019).</li><li>Shorr, A. Z., S&#246;nmez, U. M., Minden, J. S., LeDuc, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+mechanotransduction+in+Drosophila+embryos+with+mesofluidics.">High-throughput mechanotransduction in Drosophila embryos with mesofluidics.</a> Lab on a Chip. 19 (7), 1141-1152 (2019).</li><li>Kim, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanochemical+Actuators+of+Embryonic+Epithelial+Contractility.">Mechanochemical Actuators of Embryonic Epithelial Contractility.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 40, 14366-14371 (2014).</li><li>Ashburner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila. A Laboratory Handbook. , (1989).</li><li>Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+lithography+for+micro-and+nanoscale+patterning.">Soft lithography for micro-and nanoscale patterning.</a> Nature Protocols. 5 (3), 491 (2010).</li><li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+fabrication+process+for+uniform+SU-8+thick+photoresist+structures+by+simultaneously+removing+edge+bead+and+air+bubbles.">A new fabrication process for uniform SU-8 thick photoresist structures by simultaneously removing edge bead and air bubbles.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 21 (12), 125006 (2011).</li><li>Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+lithography.">Soft lithography.</a> Annual Review of Materials Science. 28 (1), 153-184 (1998).</li><li>Sonmez, U. M., Coyle, S., Taylor, R. E., LeDuc, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycarbonate+heat+molding+for+soft+lithography.">Polycarbonate heat molding for soft lithography.</a> Small. 16 (16), 2000241 (2020).</li><li>Levario, T. J., Zhan, M., Lim, B., Shvartsman, S. Y., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+trap+array+for+massively+parallel+imaging+of+Drosophila+embryos.">Microfluidic trap array for massively parallel imaging of Drosophila embryos.</a> Nature Protocols. 8 (4), 721-736 (2013).</li></ol>

O artigo descreve o desenvolvimento de um dispositivo microfluídico para alinhar, imobilizar e aplicar com precisão estimulação mecânica a centenas de embriões inteiros de Drosophila . A integração do sistema microfluídico com uma fina tampa de vidro permitiu a imagem de embriões com microscopia confocal de alta resolução durante a estimulação. O dispositivo microfluídico também permitiu a coleta dos embriões logo após a estimulação para ensaios biológicos a jusante. As considerações de de...

Os sistemas vivos experimentam e respondem constantemente a várias entradas mecânicas ao longo de suas vidas1. A mecanotransdução tem sido associada a muitas doenças, incluindo distúrbios do desenvolvimento, perda muscular e óssea e neuropatologias através de vias de sinalização direta ou indiretamente afetadas pelo ambiente mecânico2. No entanto, os genes e proteínas regulados pela estimulação mecânica3 nas vias de sinalização mecanossensíveis4 permanecem em grande parte desconhecidos5, impedindo a elucidação dos mecanismos de regulação mecânica e a identificação de alvos moleculares para doenças associadas à mecanotransdução patológica 6,7 . Um fator limitante na projeção de estudos de mecanobiologia nos processos fisiológicos relacionados é o uso de células individuais com placas de cultura convencionais em vez de organismos multicelulares intactos. Organismos modelo, como a Drosophila melanogaster (mosca da fruta), têm contribuído sobremaneira para a compreensão dos genes, vias de sinalização e proteínas envolvidas no desenvolvimento animal 8,9,10. No entanto, o uso de Drosophila e outros organismos modelo multicelulares na pesquisa em mecanobiologia tem sido dificultado por desafios com ferramentas experimentais. Técnicas convencionais para preparar, classificar, fazer imagens ou aplicar vários estímulos requerem principalmente manipulação manual; essas abordagens são demoradas, exigem experiência, introduzem variabilidade e limitam o desenho experimental e o tamanho da amostra11. Os recentes avanços microtecnológicos são um grande recurso para permitir novos ensaios biológicos com rendimento muito alto e parâmetros experimentais altamente controlados12,13,14.
Este artigo descreve o desenvolvimento de um dispositivo microfluídico aprimorado para alinhar, imobilizar e aplicar com precisão estimulação mecânica na forma de compressão uniaxial a centenas de embriões inteiros de Drosophila 15 (Figura 1). A integração do sistema microfluídico com uma tampa de vidro permitiu imagens confocais de alta resolução das amostras durante a estimulação. O dispositivo microfluídico também possibilitou a coleta rápida dos embriões após a estimulação para ensaios de corrida -ômica (Figura 2). Explicações sobre as considerações de projeto deste dispositivo, bem como a fabricação usando litografia suave e caracterização experimental, são descritas aqui. Uma vez que a fabricação de um molde de wafer de silício de tal dispositivo requer um revestimento uniforme de fotorresistência espessa (espessura >200 μm) em grandes áreas com trincheiras de alta proporção (AR) (AR >5), esse método modificou consideravelmente o protocolo tradicional de fabricação de moldes fotolitográficos. Desta forma, este método facilitou o manuseio, adesão, revestimento, padronização e desenvolvimento do fotorresistente. Além disso, possíveis armadilhas e suas soluções são discutidas. Por fim, a versatilidade dessa estratégia de projeto e fabricação foi demonstrada por meio de outros sistemas multicelulares, como câmaras de ovos de Drosophila e organoides cerebrais16.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mL tri-cornered perforated plastic beakers with 60 mm Petri dishes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-955-111B</td>
			<td>Perferate with air holes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm P B &#60;100&#62; 0-100 500um SSP Test Grade Si Wafer</td>
			<td>University Wafer</td>
			<td>452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punches</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>15110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Not brand specific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt needle set</td>
			<td>CML Supply</td>
			<td>901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Contact Mask Aligner</td>
			<td>Quintel</td>
			<td>Q4000 MA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cutting mat</td>
			<td>Dahle</td>
			<td>Vantage 10670</td>
			<td>size: 24&#34; x 36&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Developer</td>
			<td>Kayaku Advance Materials</td>
			<td>SU-8 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct Write Lithographer</td>
			<td>Heidelberg</td>
			<td>MLA100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any commericailly availble dissecting microscope with transmitted light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass petri dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0710&#160; (CS-24/60)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HMDS Vapor Prime Oven</td>
			<td>Yes Engineering</td>
			<td>YES-3TA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Not brand specific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>I5110A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paintbrush</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Not brand specific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>SU-8 2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable pressure source</td>
			<td>hygger Quietest</td>
			<td>HGD946</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure gauge</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-68950-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin Coater</td>
			<td>Laurell</td>
			<td>WS-650-8B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane (PFOCTS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>448931-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X 100</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA16046AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing</td>
			<td>Saint-Gobain</td>
			<td>02-587-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UX-08895-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Pump</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-07164-87</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mechanostimulation of multicellular organisms through a high-throughput microfluidic compression system

Durante a embriogênese, o movimento celular coordenado gera forças mecânicas que regulam a expressão e a atividade gênica. Para estudar esse processo, ferramentas como aspiração ou compressão de deslizamento de cobertura têm sido usadas para estimular mecanicamente embriões inteiros. Essas abordagens limitam o projeto experimental, pois são imprecisas, exigem manuseio manual e podem processar apenas alguns embriões simultaneamente. Os sistemas microfluídicos têm um grande potencial para automatizar essas tarefas experimentais e, ao mesmo tempo, aumentar a produtividade e a precisão. Este artigo descreve um sistema microfluídico desenvolvido para comprimir com precisão embriões inteiros de Drosophila melanogaster (mosca da fruta). Este sistema possui microcanais com paredes laterais deformáveis acionadas pneumaticamente e permite o alinhamento embrionário, imobilização, compressão e coleta pós-estimulação. Ao paralelizar esses microcanais em sete faixas, padrões de compressão constantes ou dinâmicos podem ser aplicados a centenas de embriões de Drosophila simultaneamente. A fabricação deste sistema em uma tampa de vidro facilita a estimulação mecânica simultânea e a imagem de amostras com microscópios de alta resolução. Além disso, a utilização de materiais biocompatíveis, como o PDMS, e a capacidade de fluir fluido através do sistema tornam este dispositivo capaz de experimentos de longo prazo com amostras dependentes de mídia. Essa abordagem também elimina a necessidade de montagem manual que tensiona mecanicamente as amostras. Além disso, a capacidade de coletar rapidamente amostras dos microcanais permite análises pós-estimulação, incluindo ensaios -ômicos que exigem um grande número de amostras inatingíveis usando abordagens tradicionais de estimulação mecânica. A geometria deste sistema é facilmente escalável para diferentes sistemas biológicos, permitindo que vários campos se beneficiem das características funcionais aqui descritas, incluindo alto rendimento da amostra, estimulação mecânica ou imobilização e alinhamento automatizado.

O sistema microfluídico é dividido em dois subcompartimentos separados por paredes laterais PDMS deformáveis. O primeiro compartimento é o sistema líquido onde os embriões de Drosophila são introduzidos, automaticamente alinhados, alinhados e comprimidos. O segundo compartimento é um sistema de gás onde a pressão do gás em ambos os lados dos canais de compressão é controlada através de microcanais sem saída para controlar com precisão a largura efetiva dos canais de compressão. O dispos...

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Mechanostimulation of Multicellular Organisms Through a High-Throughput Microfluidic Compression System

O presente protocolo descreve o projeto, fabricação e caracterização de um sistema microfluídico capaz de alinhar, imobilizar e comprimir com precisão centenas de embriões de Drosophila melanogaster com intervenção mínima do usuário. Este sistema permite imagens de alta resolução e recuperação de amostras para análise pós-estimulação e pode ser dimensionado para acomodar outros sistemas biológicos multicelulares.

Mecanoestimulação de organismos multicelulares através de um sistema de compressão microfluídica de alto rendimento

During embryogenesis, coordinated cell movement generates mechanical forces that regulate gene expression and activity. To study this process, tools such ...

Este protocolo explica como fabricar e usar tecnologias de microfluídica para aproveitar os benefícios experimentais na taxa de transferência de amostras, manuseio automatizado e a capacidade de aplicar com precisão o estresse mecânico e, ao mesmo tempo, visualizar amostras. Essa técnica minimiza o manuseio manual de organismos biológicos multicelulares, como embriões e organoides, para sua imobilização, alinhamento e imagens vivas. Também permite a aplicação de compressão mecânica a eles para estudos de mecanobiologia.A fabricação de moldes com características de alta proporção para este chip microfluídico pode ser um desafio com técnicas convencionais de microfabricação. As dicas explicadas neste artigo em vídeo podem superar esses desafios. Para começar, limpe a bolacha de silício primeiro com acetona e, em seguida, com álcool isopropílico.Coloque a bolacha de silício em uma placa quente de 250 graus Celsius por 30 minutos. para desidratação assar. Revestir a bolacha de silício com hexametildisiloxano em um forno de vapor prime.Coloque uma garrafa de SU-8 2100 Photoresist em um forno de 60 graus Celsius por 15 minutos para reduzir sua viscosidade. Despeje um mililitro do Photoresist aquecido para cada polegada da bolacha de silício colocada na placa quente até que o Photoresist cubra a maior parte da superfície. Aplique o pré-spin primeiro a 250 rotações por minuto durante 30 segundos e, em seguida, a 350 rotações por minuto durante mais 30 segundos, ambos com aceleração de 100 RPM por segundo.Em seguida, aplique um giro primeiro a 500 rotações por minuto por 15 segundos com aceleração de 100 RPM por segundo e, em seguida, a 1.450 rotações por minuto por 30 segundos com aceleração de 300 RPM por segundo. Remova o talão de borda com um cotonete limpo e pulverize acetona na bolacha para remover imperfeições e promover o revestimento uniforme. Exponha a bolacha de silicone a 350 milijoule por centímetro de luz UV quadrada através da máscara fotográfica.Usando o alinhador de máscara de contato, aplique o cozimento pós-exposição na bolacha de silício e deixe-a esfriar até a temperatura ambiente. Coloque o copo dentro de outro copo maior e encha o copo maior com uma nova solução de revelador. Coloque uma malha de metal no béquer.Coloque a bolacha de silício na malha de metal de cabeça para baixo. Deixe a bolacha de silício submersa na incorporadora por 30 minutos com o agitador ligado. Transfira a bolacha de silício para um sonicator de banho ultrassônico cheio do revelador fresco por uma hora a 40 kilohertz.Em seguida, retire a bolacha do copo e lave-a com uma nova solução de revelador. Prepare a solução PDMS pré-curada misturando a base PDMS com o agente de cura na proporção de 10 para um. Desgaseifique a mistura colocando-a numa centrífuga durante 500 g durante cinco minutos à temperatura ambiente.Despeje o PDMS pré-curado em uma bolacha de silício e desgaseifique-o novamente. Finalmente, coloque o PDMS não curado em forno de 60 graus Celsius para cura. Use um bisturi para cortar as bordas da região PDMS curada correspondente à geometria do chip microfluídico.Soque os orifícios de entrada e saída no PDMS usando um soco de biópsia ou uma agulha com uma ponta contundente. Coloque o PDMS na lâmina de vidro com sua superfície padronizada voltada para a lâmina de vidro após o tratamento a plasma para selar os microcanais através de ligação covalente. Permita que as moscas adultas do Oregon-R coloquem ovos em placas de ágar suco de maçã e colete as placas no momento de desenvolvimento desejado após a postura dos ovos para o experimento dado.Inunde o ágar com lavagem de ovos embrionários e agite suavemente os embriões com um pincel para desalojá-los do ágar. Transfira os embriões para uma solução de alvejante a 50% durante 90 segundos, mexendo de vez em quando. Coe os embriões através de uma peneira de tecido e lave bem a solução de água sanitária com água.Transfira os embriões para uma placa de Petri de vidro de 90 milímetros com lavagem de ovos embrionários suficiente para cobrir totalmente os embriões. Examine os embriões com transiluminação em um microscópio de dissecação e selecione embriões do estágio de desenvolvimento desejado para carregamento no dispositivo microfluídico. Prepare todos os sete microcanais embrionários preenchendo-os com 0,4 micrômetros de IPA filtrada através da porta de entrada principal do embrião.Substitua o IPA por 0,4 micrômetros de água desionizada filtrada. Em seguida, substitua a água DI por uma solução de lavagem de ovos embrionários. Colete aproximadamente 100 embriões pré-selecionados da placa de Petri de vidro usando uma pipeta de vidro.Em seguida, pipete os embriões para a porta de entrada do embrião e aplique aproximadamente três pressões negativas PSI na entrada de gás usando uma bomba de vácuo portátil para abrir os microcanais embrionários. Em seguida, incline o chip microfluídico para baixo para que os embriões se alinhem automaticamente e se instalem nos microcanais embrionários. Se as entradas do microcanal do embrião ficarem entupidas por vários embriões que entram simultaneamente, incline o chip microfluídico para cima e depois para baixo novamente para limpar o entupimento.Com base no rendimento necessário, introduza até 300 embriões nos microcanais embrionários. Uma vez que o carregamento do embrião esteja concluído, remova o vácuo para imobilizar os embriões. Em seguida, incline o chip microfluídico de volta à posição horizontal.Conecte uma fonte de pressão positiva portátil com um manômetro à entrada de gás para aplicar três compressões PSI. Se experimentos de imagem ao vivo forem conduzidos nos embriões estimulados mecanicamente, coloque o chip microfluídico em um suporte de lâmina de vidro de estágio de microscópio padrão com a entrada de gás conectada à fonte de pressão. Examine os embriões sob um microscópio fluorescente dentro dos canais microfluídicos.Uma vez que o experimento de compressão é concluído, os embriões podem ser coletados para análise a jusante. Para fazer isso, primeiro, aplique o vácuo na entrada de gás para liberar os embriões. Em seguida, incline o chip microfluídico para cima para que os embriões se movam para baixo em direção à porta de introdução do embrião.Recolha os embriões do chip microfluídico utilizando uma pipeta de vidro. A funcionalidade do dispositivo microfluídico foi determinada experimentalmente carregando embriões de Drosophila nos canais de compressão e aplicando pressão positiva nos canais de gás. Os embriões não experimentam compressão significativa sob vácuo ou em estados de pressão neutra.Eles são comprimidos quando a pressão positiva é aplicada. Medições da largura decrescente dos embriões sob um microscópio demonstram como a pressão do gás pode ser usada para obter um nível de compressão alvo. Dispositivos microfluídicos feitos desta forma permitem a estimulação química de amostras imobilizadas.A estimulação permite imagens espaço-temporais elevadas. Uma questão fundamental na biologia do desenvolvimento é como as forças mecânicas regulam a expressão de proteínas e genes durante o desenvolvimento? Essa tecnologia nos permite aplicar estimulação mecânica a um grande número de embriões de uma só vez, para que possamos isolar quantidades suficientes de proteína e RNA para realizar experimentos comparativos de proteômica ou transcriptômica.Isso permitirá que os pesquisadores aprendam mais sobre as proteínas e genes que são sensíveis às forças mecânicas.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

Microarrays de polímeros para Discovery High Throughput de Biomateriais

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Bioengenharia

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Alto rendimento Gerador Protein Expression Usando uma plataforma microfluídica

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

High Throughput Microfluidic Rapid and Low Cost Prototyping Packaging Methods

In this work, 3 different packaging and assembly techniques are presented. They can be classified into two categories: one-time use and reusable packaging ...

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

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Análise sistemática de<em&gt; In Vitro</em&gt; Célula de rolamento usando um sistema microfluídicos Multi-bem placa

A major challenge for cell-based therapy is the inability to systemically target a large quantity of viable cells with high efficiency to tissues of ...

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

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A utilização de uma alta taxa de transferência<em&gt; In Vitro</em&gt; Microfluidic Sistema de Desenvolvimento Oral Biofilms Multi-espécies

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Usando Tomoauto: Um Protocolo de métodos de alta capacidade automatizada Cryo-Electron Tomografia

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Uma plataforma microfluídica para a isolação de alta taxa de transferência de célula única e Cultura

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

High-throughput Identification of Bacteria Repellent Polymers for Medical Devices

High-throughput identificação de bactérias Polymers Repelente para dispositivos médicos

Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as ...

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Uso do elevado-Throughput Microbioreactor sistema automatizado para produção de IgG1 modelo em células CHO

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

A Microfluidic Platform for Stimulating Chondrocytes with Dynamic Compression

Uma plataforma Microfluídico para estimular condrócitos com compressão dinâmica

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth ...