Name: mechanostimulation of multicellular organisms through a high-throughput microfluidic compression system
Uploaded: 2022-12-23T13:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mechanostimulation of Multicellular Organisms Through a High-Throughput Microfluidic Compression System at JoVE.com

Эта работа была поддержана Национальным научным фондом (CMMI-1946456), Управлением научных исследований ВВС (FA9550-18-1-0262) и Национальным институтом здравоохранения (R01AG06100501A1; Р21АР08105201А1).

1. Подготовка силиконовой пластинчатой формы
<ol><li>Очистите кремниевую пластину (см. Таблицу материалов) сначала ацетоном, а затем изопропиловым спиртом (IPA).</li>
	<li>Поместите кремниевую пластину на конфорку при температуре 250 °C в течение 30 минут для обезвоживания (<strong cl...

<ol>
	<li>Wang, J. H. -. C., Thampatty, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introductory+review+of+cell+mechanobiology.">An introductory review of cell mechanobiology.</a> Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 5 (1), 1-16 (2006).</li><li>Ingber, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanobiology+and+diseases+of+mechanotransduction.">Mechanobiology and diseases of mechanotransduction.</a> Annals of Medicine. 35 (8), 564-577 (2003).</li><li>Nims, R. J., Pferdehirt, L., Guilak, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanogenetics:+Harnessing+mechanobiology+for+cellular+engineering.">Mechanogenetics: Harnessing mechanobiology for cellular engineering.</a> Current Opinion in Biotechnology. 73, 374-379 (2022).</li><li>Bellin, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+Role+of+Syndecan-4+in+Mechanotransduction+using+Surface-Modification+Approaches.">Defining the Role of Syndecan-4 in Mechanotransduction using Surface-Modification Approaches.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 22102-22107 (2009).</li><li>Simpson, L. J., Reader, J. S., Tzima, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+regulation+of+protein+translation+in+the+cardiovascular+system.">Mechanical regulation of protein translation in the cardiovascular system.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 34 (2020).</li><li>Humphrey, J. D., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+mechanobiology:+Homeostasis,+adaptation,+and+disease.">Vascular mechanobiology: Homeostasis, adaptation, and disease.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 23, 1-27 (2021).</li><li>Maurer, M., Lammerding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+driving+force:+Nuclear+mechanotransduction+in+cellular+function,+fate,+and+disease.">The driving force: Nuclear mechanotransduction in cellular function, fate, and disease.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 21, 443-468 (2019).</li><li>Jennings, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila-A+versatile+model+in+biology+&amp;+medicine.">Drosophila-A versatile model in biology &amp; medicine.</a> Materials Today. 14 (5), 190-195 (2011).</li><li>Konno, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State-of-the-art+technology+of+model+organisms+for+current+human+medicine.">State-of-the-art technology of model organisms for current human medicine.</a> Diagnostics. 10 (6), 392 (2020).</li><li>Morgan, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+limited+inheritance+in+Drosophila.">Sex limited inheritance in Drosophila.</a> Science. 32 (812), 120-122 (1910).</li><li>Wu, Q., Kumar, N., Velagala, V., Zartman, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+to+reverse-engineer+multicellular+systems:+Case+studies+using+the+fruit+fly.">Tools to reverse-engineer multicellular systems: Case studies using the fruit fly.</a> Journal of Biological Engineering. 13 (1), 1-16 (2019).</li><li>Jayamohan, H., et al., Patrinos, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+11+-+Advances+in+Microfluidics+and+Lab-on-a-Chip+Technologies.">Chapter 11 - Advances in Microfluidics and Lab-on-a-Chip Technologies.</a> Molecular Diagnostics. , 197-217 (2017).</li><li>Scheler, O., Postek, W., Garstecki, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+developments+of+microfluidics+as+a+tool+for+biotechnology+and+microbiology.">Recent developments of microfluidics as a tool for biotechnology and microbiology.</a> Current Opinion in Biotechnology. 55, 60-67 (2019).</li><li>Mohammed, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innovative+tools+for+mechanobiology:+Unraveling+outside-in+and+inside-out+mechanotransduction.">Innovative tools for mechanobiology: Unraveling outside-in and inside-out mechanotransduction.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 162 (2019).</li><li>Shorr, A. Z., S&#246;nmez, U. M., Minden, J. S., LeDuc, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+mechanotransduction+in+Drosophila+embryos+with+mesofluidics.">High-throughput mechanotransduction in Drosophila embryos with mesofluidics.</a> Lab on a Chip. 19 (7), 1141-1152 (2019).</li><li>Kim, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanochemical+Actuators+of+Embryonic+Epithelial+Contractility.">Mechanochemical Actuators of Embryonic Epithelial Contractility.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 40, 14366-14371 (2014).</li><li>Ashburner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila. A Laboratory Handbook. , (1989).</li><li>Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+lithography+for+micro-and+nanoscale+patterning.">Soft lithography for micro-and nanoscale patterning.</a> Nature Protocols. 5 (3), 491 (2010).</li><li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+fabrication+process+for+uniform+SU-8+thick+photoresist+structures+by+simultaneously+removing+edge+bead+and+air+bubbles.">A new fabrication process for uniform SU-8 thick photoresist structures by simultaneously removing edge bead and air bubbles.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 21 (12), 125006 (2011).</li><li>Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+lithography.">Soft lithography.</a> Annual Review of Materials Science. 28 (1), 153-184 (1998).</li><li>Sonmez, U. M., Coyle, S., Taylor, R. E., LeDuc, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycarbonate+heat+molding+for+soft+lithography.">Polycarbonate heat molding for soft lithography.</a> Small. 16 (16), 2000241 (2020).</li><li>Levario, T. J., Zhan, M., Lim, B., Shvartsman, S. Y., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+trap+array+for+massively+parallel+imaging+of+Drosophila+embryos.">Microfluidic trap array for massively parallel imaging of Drosophila embryos.</a> Nature Protocols. 8 (4), 721-736 (2013).</li></ol>

В статье описывается разработка микрофлюидного устройства для автоматического выравнивания, обездвиживания и точного применения механической стимуляции к сотням целых эмбрионов дрозофилы . Интеграция микрофлюидной системы с тонким стеклянным покровом позволила во время стиму...

Живые системы постоянно испытывают и реагируют на различные механические входы на протяжении всей своей жизни1. Механотрансдукция была связана со многими заболеваниями, включая нарушения развития, потерю мышечной и костной массы, а также невропатологии через сигнальные пути, прямо или косвенно затронутые механической средой2. Однако гены и белки, которые регулируются механической стимуляцией3 в механочувствительных сигнальных путях4, остаются в значительной степени неизвестными5, препятствуя выяснению механизмов механической регуляции и идентификации молекулярных мишеней для заболеваний, связанных с патологической механотрансдукцией 6,7 . Одним из ограничивающих факторов в проецировании механобиологических исследований на связанные физиологические процессы является использование отдельных клеток с обычными культуральными блюдами вместо интактных многоклеточных организмов. Модельные организмы, такие как Drosophila melanogaster (плодовая муха), внесли большой вклад в понимание генов, сигнальных путей и белков, участвующих в развитии животных 8,9,10. Тем не менее, использование дрозофилы и других многоклеточных модельных организмов в механобиологических исследованиях было затруднено проблемами с экспериментальными инструментами. Традиционные методы подготовки, сортировки, визуализации или применения различных стимулов требуют в основном ручных манипуляций; эти подходы отнимают много времени, требуют специальных знаний, вносят вариативность и ограничивают экспериментальный дизайн и размер выборки11. Последние достижения в области микротехнологий являются отличным ресурсом для создания новых биологических анализов с очень высокой пропускной способностью и строго контролируемыми экспериментальными параметрами 12,13,14.
В этой статье описывается разработка усовершенствованного микрофлюидного устройства для выравнивания, иммобилизации и точного применения механической стимуляции в виде одноосного сжатия к сотням целых эмбрионов дрозофилы 15 (рисунок 1). Интеграция микрофлюидной системы со стеклянным чехлом позволила получить конфокальную визуализацию образцов с высоким разрешением во время стимуляции. Микрофлюидное устройство также позволило быстро собирать эмбрионы после стимуляции для проведения анализов -омики (рисунок 2). Объяснения конструктивных соображений этого устройства, а также изготовления с использованием мягкой литографии и экспериментальной характеристики описаны в настоящем документе. Поскольку изготовление силиконовой пластинчатой формы такого устройства требует равномерного покрытия толстого фоторезиста (толщина >200 мкм) на больших площадях с высоким соотношением сторон (AR) траншей (AR >5), этот метод значительно изменил традиционный протокол изготовления фотолитографической формы. Таким образом, этот метод облегчил обработку, адгезию, покрытие, рисунок и развитие фоторезиста. Кроме того, обсуждаются потенциальные подводные камни и их решения. Наконец, универсальность этой стратегии проектирования и изготовления была продемонстрирована с использованием других многоклеточных систем, таких как камеры яйцеклеток дрозофилы и органоиды мозга16.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mL tri-cornered perforated plastic beakers with 60 mm Petri dishes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-955-111B</td>
			<td>Perferate with air holes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm P B &#60;100&#62; 0-100 500um SSP Test Grade Si Wafer</td>
			<td>University Wafer</td>
			<td>452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punches</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>15110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Not brand specific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt needle set</td>
			<td>CML Supply</td>
			<td>901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Contact Mask Aligner</td>
			<td>Quintel</td>
			<td>Q4000 MA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cutting mat</td>
			<td>Dahle</td>
			<td>Vantage 10670</td>
			<td>size: 24&#34; x 36&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Developer</td>
			<td>Kayaku Advance Materials</td>
			<td>SU-8 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct Write Lithographer</td>
			<td>Heidelberg</td>
			<td>MLA100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any commericailly availble dissecting microscope with transmitted light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass petri dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0710&#160; (CS-24/60)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HMDS Vapor Prime Oven</td>
			<td>Yes Engineering</td>
			<td>YES-3TA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Not brand specific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>I5110A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paintbrush</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Not brand specific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>SU-8 2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable pressure source</td>
			<td>hygger Quietest</td>
			<td>HGD946</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure gauge</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-68950-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin Coater</td>
			<td>Laurell</td>
			<td>WS-650-8B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane (PFOCTS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>448931-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X 100</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA16046AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing</td>
			<td>Saint-Gobain</td>
			<td>02-587-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UX-08895-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Pump</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-07164-87</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mechanostimulation of multicellular organisms through a high-throughput microfluidic compression system

Во время эмбриогенеза скоординированное движение клеток генерирует механические силы, которые регулируют экспрессию и активность генов. Для изучения этого процесса были использованы такие инструменты, как аспирация или компрессия чехла, для механической стимуляции целых эмбрионов. Эти подходы ограничивают экспериментальное проектирование, поскольку они неточны, требуют ручного обращения и могут обрабатывать только пару эмбрионов одновременно. Микрофлюидные системы имеют большой потенциал для автоматизации таких экспериментальных задач при одновременном повышении пропускной способности и точности. В этой статье описывается микрофлюидная система, разработанная для точного сжатия целых эмбрионов Drosophila melanogaster (плодовой мухи). Эта система оснащена микроканалами с пневматически приводимыми деформируемыми боковыми стенками и обеспечивает выравнивание эмбриона, иммобилизацию, компрессию и сбор постстимуляции. Распараллеливая эти микроканалы в семь полос, устойчивые или динамические схемы сжатия могут быть применены к сотням эмбрионов дрозофилы одновременно. Изготовление этой системы на стеклянном крышке облегчает одновременную механическую стимуляцию и визуализацию образцов с помощью микроскопов высокого разрешения. Более того, использование биосовместимых материалов, таких как PDMS, и способность пропускать жидкость через систему делают это устройство способным к долгосрочным экспериментам с образцами, зависящими от среды. Такой подход также устраняет необходимость ручного монтажа, который механически напрягает образцы. Кроме того, возможность быстрого сбора образцов с микроканалов позволяет проводить постстимуляционный анализ, включая омические анализы, которые требуют больших количеств образцов, недостижимых с использованием традиционных подходов механической стимуляции. Геометрия этой системы легко масштабируется для различных биологических систем, что позволяет многочисленным полям извлекать выгоду из функциональных особенностей, описанных в настоящем описании, включая высокую пропускную способность образца, механическую стимуляцию или иммобилизацию и автоматическое выравнивание.

Микрофлюидная система разделена на два подотсека, разделенных деформируемыми боковыми стенками PDMS. Первый отсек представляет собой жидкую систему, в которую вводятся эмбрионы дрозофилы , автоматически выравниваются, выстраиваются и сжимаются. Второй отсек представляет собой га?...

Watch this Scientific Journal Video about Mechanostimulation of Multicellular Organisms Through a High-Throughput Microfluidic Compression System at JoVE.com

Mechanostimulation of Multicellular Organisms Through a High-Throughput Microfluidic Compression System

Настоящий протокол описывает проектирование, изготовление и характеристику микрофлюидной системы, способной выравнивать, обездвиживать и точно сжимать сотни эмбрионов Drosophila melanogaster с минимальным вмешательством пользователя. Эта система позволяет получать изображения с высоким разрешением и восстанавливать образцы для постстимуляционного анализа и может быть масштабирована для размещения других многоклеточных биологических систем.

Механостимуляция многоклеточных организмов с помощью высокопроизводительной микрофлюидной компрессионной системы

During embryogenesis, coordinated cell movement generates mechanical forces that regulate gene expression and activity. To study this process, tools such ...

Этот протокол объясняет, как изготавливать и использовать технологии микрофлюидики для использования экспериментальных преимуществ в пропускной способности образцов, автоматизированной обработке и способности точно применять механическое напряжение при одновременной визуализации образцов. Этот метод сводит к минимуму ручное обращение с многоклеточными биологическими организмами, такими как эмбрионы и органоиды, для их иммобилизации, выравнивания и живой визуализации. Это также позволяет применять механическую компрессию к ним для механобиологических исследований.Изготовление пресс-форм с высоким соотношением сторон для этого микрофлюидного чипа может быть сложной задачей с обычными методами микропроизводства. Советы, описанные в этой видео-статье, могут преодолеть эти проблемы. Для начала очистите кремниевую пластину сначала ацетоном, а затем изопропиловым спиртом.Поместите кремниевую пластину на конфорку с температурой 250 градусов Цельсия на 30 минут. для обезвоживания выпекать. Покрыть кремниевую пластину гексаметилдисилоксаном в паровой печи.Поместите бутылку SU-8 2100 Photoresist в духовку с температурой 60 градусов Цельсия на 15 минут, чтобы уменьшить ее вязкость. Налейте один миллилитр нагретого фоторезиста на каждый дюйм кремниевой пластины, помещенной на конфорку, пока фоторезист не покроет большую часть поверхности. Применяйте предварительное вращение сначала со скоростью 250 оборотов в минуту в течение 30 секунд, а затем со скоростью 350 оборотов в минуту в течение еще 30 секунд, оба с ускорением 100 об/мин в секунду.Затем примените вращение сначала при 500 оборотах в минуту в течение 15 секунд с ускорением 100 об/мин в секунду, а затем при 1 450 оборотах в минуту в течение 30 секунд с ускорением 300 об/мин в секунду. Удалите краевой шарик с помощью чистого комнатного тампона и распылите ацетон на пластину, чтобы удалить недостатки и способствовать равномерному покрытию. Подвергайте силиконовую пластину воздействию 350 миллиджоулей на сантиметр квадратного ультрафиолетового света через фотомаску.С помощью выравнивателя контактной маски нанесите на кремниевую пластину после воздействия выпечку и дайте ей остыть до комнатной температуры. Поместите стакан внутрь другого более крупного стакана и наполните его новым решением для разработчиков. Поместите металлическую сетку на стакан.Поместите кремниевую пластину на металлическую сетку вверх ногами. Оставьте кремниевую пластину погруженной в разработчика на 30 минут с включенной мешалкой. Переложите кремниевую пластину в ультразвуковой индикатор ванны, наполненный свежим разработчиком, в течение одного часа при 40 килогерцах.Затем выньте пластину из стакана и вымойте ее свежим раствором разработчика. Приготовьте предварительно отвержденный раствор PDMS путем смешивания основания PDMS с отверждающим агентом в соотношении 10 к одному. Дегазировать смесь, поместив ее в центрифугу на 500 г в течение пяти минут при комнатной температуре.Вылейте предварительно отвержденную PDMS на кремниевую пластину и снова дегазируйте ее. Наконец, поместите неотвержденный PDMS в печь с температурой 60 градусов Цельсия для отверждения. Используйте скальпель, чтобы вырезать границы отвержденной области PDMS, соответствующие микрофлюидной геометрии чипа.Пробите входное и выходное отверстия на PDMS с помощью биопсийного перфоратора или иглы с тупым наконечником. Поместите PDMS на стеклянный слайд с его узорчатой поверхностью, обращенной к стеклянному слайду после плазменной обработки, чтобы запечатать микроканалы с помощью ковалентного склеивания. Позвольте взрослым мухам Oregon-R отложить яйца на тарелках с агаром из яблочного сока и собрать пластины в желаемое время развития после откладки яиц для данного эксперимента.Насыпьте агар яйцом эмбриона и аккуратно перемешайте эмбрионы кистью, чтобы выбить их из агара. Перенесите эмбрионы в 50%-ный отбеливающий раствор на 90 секунд, периодически помешивая. Процедите эмбрионы через тканевое сито и тщательно смойте раствор отбеливателя водой.Перенесите эмбрионы в 90-миллиметровую стеклянную чашку Петри с достаточным количеством эмбрионов, чтобы полностью покрыть эмбрионы. Исследуем эмбрионы с трансиллюминацией на рассекающем микроскопе, и отбираем эмбрионы нужной стадии развития для загрузки в микрофлюидное устройство. Праймируйте все семь микроканалов эмбрионов, заполнив их 0,4 микрометрами фильтрованного IPA через главный входной порт эмбриона.Замените IPA на 0,4 микрометра отфильтрованной деионизированной воды. Затем замените воду DI раствором для мытья яиц эмбриона. Соберите около 100 предварительно отобранных эмбрионов из стеклянной чашки Петри с помощью стеклянной пипетки.Затем пипетка эмбрионов во входной порт эмбриона и применяет примерно три отрицательных давления PSI к входу газа с помощью портативного вакуумного насоса, чтобы открыть микроканалы эмбриона. Затем наклоните микрофлюидный чип вниз, чтобы эмбрионы автоматически выровнялись и осели в микроканалах эмбриона. Если микроканальные входы эмбриона забиваются несколькими эмбрионами, входящими одновременно, наклоните микрофлюидный чип вверх, а затем снова вниз, чтобы очистить засорение.Исходя из требуемой пропускной способности, введите до 300 эмбрионов в микроканалы эмбрионов. Как только загрузка эмбриона будет завершена, удалите вакуум, чтобы обездвижить эмбрионы. Затем наклоните микрожидкий чип обратно в горизонтальное положение.Подключите портативный источник положительного давления с манометром к входному отверстию газа, чтобы применить три сжатия PSI. Если эксперименты с визуализацией в реальном времени будут проводиться на механически стимулированных эмбрионах, поместите микрофлюидный чип на стандартный стеклянный слайд-держатель для микроскопа с газовым входом, соединенным с источником давления. Исследуйте эмбрионы под флуоресцентным микроскопом внутри микрофлюидных каналов.Как только эксперимент по сжатию завершен, эмбрионы могут быть собраны для последующего анализа. Для этого, во-первых, приложите вакуум к входному отверстию газа, чтобы освободить эмбрионы. Затем наклоните микрофлюидный чип вверх, чтобы эмбрионы двигались вниз к порту для введения эмбриона.Соберите эмбрионы из микрофлюидного чипа с помощью стеклянной пипетки. Функциональность микрофлюидного устройства экспериментально определяли путем загрузки эмбрионов дрозофилы в компрессионные каналы и приложения положительного давления к газовым каналам. Эмбрионы не испытывают значительного сжатия в вакууме или в состояниях нейтрального давления.Они сжимаются при положительном давлении. Измерения уменьшающейся ширины эмбрионов под микроскопом демонстрируют, как давление газа может быть использовано для получения целевого уровня сжатия. Микрофлюидные устройства, изготовленные таким образом, позволяют проводить химическую стимуляцию обездвиженных образцов.Стимуляция позволяет проводить высокую пространственно-временную визуализацию. Фундаментальный вопрос в биологии развития заключается в том, как механические силы регулируют экспрессию белка и генов во время развития? Эта технология позволяет применять механическую стимуляцию к большому количеству эмбрионов одновременно, чтобы мы могли выделить достаточное количество белка и РНК для выполнения сравнительной протеомики или экспериментов по транскриптомике.Это позволит исследователям узнать больше о белках и генах, которые чувствительны к механическим силам.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

Полимерные Microarrays высоких Discovery Пропускная биоматериалов

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Высокая пропускная способность экспрессии белков генератора с использованием платформы Микрофлюидных

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

High Throughput Microfluidic Rapid and Low Cost Prototyping Packaging Methods

Высокая пропускная Микрофлюидных Быстрое и низкая стоимость создания прототипов Упаковка Методы

In this work, 3 different packaging and assembly techniques are presented. They can be classified into two categories: one-time use and reusable packaging ...

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

Систематический анализ<em&gt; Экстракорпоральное</em&gt; Сотовый Роллинг Использование нескольких хорошо Plate микрофлюидных системы

A major challenge for cell-based therapy is the inability to systemically target a large quantity of viable cells with high efficiency to tissues of ...

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

Использование высокой пропускной<em&gt; In Vitro</em&gt; Микрожидкостных систему для разработки Устные биопленки Многовидовые

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Использование Tomoauto: протокол для высокой пропускной автоматизированной Cryo-электронной томографии

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Микрожидком Платформа с высокой пропускной способностью изоляции одноклеточные и культуры

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

High-throughput Identification of Bacteria Repellent Polymers for Medical Devices

Высокая пропускная способность идентификации бактерий репелленты Полимеры для медицинских приборов

Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Использование высокопроизводительного автоматизированная система Microbioreactor для производства модель IgG1 в клетках Чо

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

A Microfluidic Platform for Stimulating Chondrocytes with Dynamic Compression

Микрофлюидная платформа для стимулирования хондроцитов с динамическим сжатием

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth ...