Name: mechanostimulation of multicellular organisms through a high-throughput microfluidic compression system
Uploaded: 2022-12-23T13:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mechanostimulation of Multicellular Organisms Through a High-Throughput Microfluidic Compression System at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias (CMMI-1946456), la Oficina de Investigación Científica de la Fuerza Aérea (FA9550-18-1-0262) y el Instituto Nacional de Salud (R01AG06100501A1; R21AR08105201A1).

1. Preparación del molde de oblea de silicio
<ol><li>Limpie la oblea de silicio (consulte la Tabla de materiales) primero con acetona y luego con alcohol isopropílico (IPA).</li>
	<li>Coloque la oblea de silicio en una placa caliente a 250 °C durante 30 minutos para la deshidratación (Figura 3A).</li>
	<li>Cubra la oblea de silicio con hexametildisilazano (HDMS) en un horno de vapor principal (consulte la Tabla de materiales) (temperat...

<ol>
	<li>Wang, J. H. -. C., Thampatty, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introductory+review+of+cell+mechanobiology.">An introductory review of cell mechanobiology.</a> Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 5 (1), 1-16 (2006).</li><li>Ingber, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanobiology+and+diseases+of+mechanotransduction.">Mechanobiology and diseases of mechanotransduction.</a> Annals of Medicine. 35 (8), 564-577 (2003).</li><li>Nims, R. 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Z., S&#246;nmez, U. M., Minden, J. S., LeDuc, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+mechanotransduction+in+Drosophila+embryos+with+mesofluidics.">High-throughput mechanotransduction in Drosophila embryos with mesofluidics.</a> Lab on a Chip. 19 (7), 1141-1152 (2019).</li><li>Kim, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanochemical+Actuators+of+Embryonic+Epithelial+Contractility.">Mechanochemical Actuators of Embryonic Epithelial Contractility.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 40, 14366-14371 (2014).</li><li>Ashburner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+lithography.">Soft lithography.</a> Annual Review of Materials Science. 28 (1), 153-184 (1998).</li><li>Sonmez, U. M., Coyle, S., Taylor, R. E., LeDuc, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycarbonate+heat+molding+for+soft+lithography.">Polycarbonate heat molding for soft lithography.</a> Small. 16 (16), 2000241 (2020).</li><li>Levario, T. J., Zhan, M., Lim, B., Shvartsman, S. Y., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+trap+array+for+massively+parallel+imaging+of+Drosophila+embryos.">Microfluidic trap array for massively parallel imaging of Drosophila embryos.</a> Nature Protocols. 8 (4), 721-736 (2013).</li></ol>

El artículo describe el desarrollo de un dispositivo microfluídico para alinear, inmovilizar y aplicar con precisión estimulación mecánica automáticamente a cientos de embriones completos de Drosophila . La integración del sistema microfluídico con un delgado cubreobjetos de vidrio permitió obtener imágenes de embriones con microscopía confocal de alta resolución durante la estimulación. El dispositivo microfluídico también permitió la recolección de los embriones justo después de la estimulaci...

Los sistemas vivos experimentan y responden constantemente a diversas entradas mecánicas a lo largo de su vida útil1. La mecanotransducción se ha relacionado con muchas enfermedades, incluyendo trastornos del desarrollo, pérdida muscular y ósea, y neuropatologías a través de vías de señalización directa o indirectamente afectadas por el ambiente mecánico2. Sin embargo, los genes y proteínas que están regulados por la estimulación mecánica3 en las vías de señalización mecanosensibles4 permanecen en gran parte desconocidos5, impidiendo la elucidación de los mecanismos de regulación mecánica y la identificación de dianas moleculares para enfermedades asociadas a la mecanotransducción patológica 6,7 . Un factor limitante en la proyección de estudios mecanobiológicos sobre los procesos fisiológicos relacionados es el uso de células individuales con placas de cultivo convencionales en lugar de organismos multicelulares intactos. Organismos modelo, como Drosophila melanogaster (mosca de la fruta), han contribuido en gran medida a la comprensión de los genes, las vías de señalización y las proteínas involucradas en el desarrollo animal 8,9,10. Sin embargo, el uso de Drosophila y otros organismos modelo multicelulares en la investigación mecanobiológica se ha visto obstaculizado por desafíos con herramientas experimentales. Las técnicas convencionales para preparar, clasificar, obtener imágenes o aplicar diversos estímulos requieren principalmente manipulación manual; Estos enfoques consumen mucho tiempo, requieren experiencia, introducen variabilidad y limitan el diseño experimental y el tamaño de la muestra11. Los recientes avances microtecnológicos son un gran recurso para permitir nuevos ensayos biológicos con un rendimiento muy alto y parámetros experimentales altamente controlados12,13,14.
Este artículo describe el desarrollo de un dispositivo microfluídico mejorado para alinear, inmovilizar y aplicar con precisión estimulación mecánica en forma de compresión uniaxial a cientos de embriones enteros de Drosophila 15 (Figura 1). La integración del sistema microfluídico con un cubreobjetos de vidrio permitió obtener imágenes confocales de alta resolución de las muestras durante la estimulación. El dispositivo microfluídico también permitió la recolección rápida de los embriones después de la estimulación para ejecutar ensayos -ómicos (Figura 2). Las explicaciones de las consideraciones de diseño de este dispositivo, así como la fabricación utilizando litografía blanda y caracterización experimental, se describen aquí. Dado que la fabricación de un molde de oblea de silicio de un dispositivo de este tipo requiere un recubrimiento uniforme de fotorresistencia gruesa (espesor >200 μm) en grandes áreas con zanjas de alta relación de aspecto (AR) (AR >5), este método modificó considerablemente el protocolo tradicional de fabricación de moldes fotolitográficos. De esta manera, este método facilitó el manejo, adhesión, recubrimiento, modelado y desarrollo de la fotorresistencia. Además, se discuten los peligros potenciales y sus soluciones. Por último, la versatilidad de esta estrategia de diseño y fabricación se demostró utilizando otros sistemas multicelulares como las cámaras de huevos de Drosophila y los organoides cerebrales16.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mL tri-cornered perforated plastic beakers with 60 mm Petri dishes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-955-111B</td>
			<td>Perferate with air holes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm P B &#60;100&#62; 0-100 500um SSP Test Grade Si Wafer</td>
			<td>University Wafer</td>
			<td>452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punches</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>15110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Not brand specific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt needle set</td>
			<td>CML Supply</td>
			<td>901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Contact Mask Aligner</td>
			<td>Quintel</td>
			<td>Q4000 MA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cutting mat</td>
			<td>Dahle</td>
			<td>Vantage 10670</td>
			<td>size: 24&#34; x 36&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Developer</td>
			<td>Kayaku Advance Materials</td>
			<td>SU-8 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct Write Lithographer</td>
			<td>Heidelberg</td>
			<td>MLA100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any commericailly availble dissecting microscope with transmitted light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass petri dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0710&#160; (CS-24/60)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HMDS Vapor Prime Oven</td>
			<td>Yes Engineering</td>
			<td>YES-3TA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Not brand specific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>I5110A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paintbrush</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Not brand specific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>SU-8 2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable pressure source</td>
			<td>hygger Quietest</td>
			<td>HGD946</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure gauge</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-68950-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin Coater</td>
			<td>Laurell</td>
			<td>WS-650-8B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane (PFOCTS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>448931-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X 100</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA16046AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing</td>
			<td>Saint-Gobain</td>
			<td>02-587-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UX-08895-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Pump</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-07164-87</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mechanostimulation of multicellular organisms through a high-throughput microfluidic compression system

Durante la embriogénesis, el movimiento celular coordinado genera fuerzas mecánicas que regulan la expresión y la actividad génica. Para estudiar este proceso, se han utilizado herramientas como la aspiración o la compresión de cubreobjetos para estimular mecánicamente embriones enteros. Estos enfoques limitan el diseño experimental, ya que son imprecisos, requieren manipulación manual y pueden procesar solo un par de embriones simultáneamente. Los sistemas microfluídicos tienen un gran potencial para automatizar tales tareas experimentales al tiempo que aumentan el rendimiento y la precisión. Este artículo describe un sistema microfluídico desarrollado para comprimir con precisión embriones enteros de Drosophila melanogaster (mosca de la fruta). Este sistema cuenta con microcanales con paredes laterales deformables accionadas neumáticamente y permite la alineación del embrión, la inmovilización, la compresión y la recolección posterior a la estimulación. Al paralelizar estos microcanales en siete carriles, se pueden aplicar patrones de compresión constantes o dinámicos a cientos de embriones de Drosophila simultáneamente. La fabricación de este sistema en un cubreobjetos de vidrio facilita la estimulación mecánica simultánea y la obtención de imágenes de muestras con microscopios de alta resolución. Además, la utilización de materiales biocompatibles, como PDMS, y la capacidad de fluir fluido a través del sistema hacen que este dispositivo sea capaz de experimentos a largo plazo con muestras dependientes de medios. Este enfoque también elimina el requisito de montaje manual que estresa mecánicamente las muestras. Además, la capacidad de recoger rápidamente muestras de los microcanales permite análisis posteriores a la estimulación, incluidos los ensayos -ómicos que requieren grandes números de muestra inalcanzables utilizando los enfoques tradicionales de estimulación mecánica. La geometría de este sistema es fácilmente escalable a diferentes sistemas biológicos, lo que permite que numerosos campos se beneficien de las características funcionales descritas en este documento, incluido el alto rendimiento de la muestra, la estimulación mecánica o la inmovilización y la alineación automatizada.

El sistema microfluídico se divide en dos subcompartimentos separados por paredes laterales PDMS deformables. El primer compartimento es el sistema líquido donde se introducen los embriones de Drosophila , se alinean, alinean y comprimen automáticamente. El segundo compartimento es un sistema de gas donde la presión del gas a ambos lados de los canales de compresión se controla a través de microcanales sin salida para controlar con precisión el ancho efectivo de los canales de compresión. El dis...

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Mechanostimulation of Multicellular Organisms Through a High-Throughput Microfluidic Compression System

El presente protocolo describe el diseño, fabricación y caracterización de un sistema microfluídico capaz de alinear, inmovilizar y comprimir con precisión cientos de embriones de Drosophila melanogaster con una intervención mínima del usuario. Este sistema permite obtener imágenes de alta resolución y recuperar muestras para el análisis posterior a la estimulación y se puede escalar para adaptarse a otros sistemas biológicos multicelulares.

Mecanoestimulación de organismos multicelulares mediante un sistema de compresión microfluídica de alto rendimiento

During embryogenesis, coordinated cell movement generates mechanical forces that regulate gene expression and activity. To study this process, tools such ...

Este protocolo explica cómo fabricar y utilizar tecnologías de microfluídica para aprovechar los beneficios experimentales en el rendimiento de muestras, el manejo automatizado y la capacidad de aplicar con precisión la tensión mecánica mientras se visualizan simultáneamente las muestras. Esta técnica minimiza el manejo manual de organismos biológicos multicelulares, como embriones y organoides, para su inmovilización, alineación e imágenes en vivo. También permite la aplicación de compresión mecánica a ellos para estudios de mecanobiología.La fabricación de moldes con características de alta relación de aspecto para este chip microfluídico puede ser un desafío con las técnicas de microfabricación convencionales. Los consejos explicados en este artículo de video pueden superar estos desafíos. Para comenzar, limpie la oblea de silicio primero con acetona y luego con alcohol isopropílico.Coloque la oblea de silicio en una placa caliente de 250 grados centígrados durante 30 minutos. para hornear la deshidratación. Cubra la oblea de silicio con hexametildisiloxano en un horno de vapor principal.Coloque una botella de SU-8 2100 Photoresist en un horno de 60 grados centígrados durante 15 minutos para reducir su viscosidad. Vierta un mililitro de la fotorresistencia calentada por cada pulgada de la oblea de silicio colocada en la placa caliente hasta que la fotorresistencia cubra la mayor parte de la superficie. Aplique primero el pre-giro a 250 rotaciones por minuto durante 30 segundos, y luego a 350 rotaciones por minuto durante otros 30 segundos, ambos con una aceleración de 100 RPM por segundo.A continuación, aplique un giro primero a 500 rotaciones por minuto durante 15 segundos con una aceleración de 100 RPM por segundo, y luego a 1, 450 rotaciones por minuto durante 30 segundos con una aceleración de 300 RPM por segundo. Retire el cordón del borde con un hisopo de sala limpia y rocíe acetona en la oblea para eliminar las imperfecciones y promover un recubrimiento uniforme. Exponga la oblea de silicona a una luz UV de 350 milijulios por centímetro cuadrado a través de la máscara fotográfica.Usando el alineador de la máscara de contacto, aplique el horno posterior a la exposición a la oblea de silicio y deje que se enfríe a temperatura ambiente. Coloque el vaso de precipitados dentro de otro vaso de precipitados más grande y llene el vaso de precipitados más grande con una nueva solución de desarrollador. Coloque una malla metálica en el vaso de precipitados.Coloque la oblea de silicio en la malla metálica boca abajo. Deje la oblea de silicio sumergida en el revelador durante 30 minutos con el agitador encendido. Transfiera la oblea de silicio a un sonicador de baño ultrasónico lleno con el revelador fresco durante una hora a 40 kilohercios.Luego saque la oblea del vaso de precipitados y lávela con una nueva solución de desarrollador. Prepare la solución PDMS precurada mezclando la base de PDMS con el agente de curado en una proporción de 10 a uno. Desgasifique la mezcla colocándola en una centrífuga durante 500 g durante cinco minutos a temperatura ambiente.Vierta el PDMS precurado en una oblea de silicio y desgasifique nuevamente. Finalmente, coloque el PDMS sin curar en un horno de 60 grados centígrados para curar. Utilice un bisturí para cortar los bordes de la región PDMS curada correspondiente a la geometría del chip microfluídico.Perfore los orificios de entrada y salida en PDMS usando un punzón de biopsia o una aguja con una punta roma. Coloque el PDMS en el portaobjetos de vidrio con su superficie estampada mirando hacia el portaobjetos de vidrio después del tratamiento con plasma para sellar los microcanales a través de la unión covalente. Permita que las moscas adultas de Oregon-R pongan huevos en platos de agar jugo de manzana y recoja los platos en el momento de desarrollo deseado después de la puesta de huevos para el experimento dado.Inunde el agar con el lavado de huevos de embrión y agite suavemente los embriones con un pincel para desalojarlos del agar. Transfiera los embriones a una solución blanqueadora al 50% durante 90 segundos, revolviendo ocasionalmente. Cuele los embriones a través de un tamiz de tejido y lave bien la solución de lejía con agua.Transfiera los embriones a una placa de Petri de vidrio de 90 milímetros con suficiente lavado de huevos de embriones para cubrir completamente los embriones. Examine los embriones con transiluminación en un microscopio de disección y seleccione embriones de la etapa de desarrollo deseada para cargarlos en el dispositivo microfluídico. Prepare los siete microcanales embrionarios llenándolos con 0,4 micrómetros de IPA filtrado a través del puerto de entrada principal del embrión.Reemplace el IPA con 0.4 micrómetros de agua desionizada filtrada. Luego reemplace el agua DI con una solución de lavado de huevos de embrión. Recolectar aproximadamente 100 embriones preseleccionados de la placa de Petri de vidrio usando una pipeta de vidrio.A continuación, pipetear los embriones en el puerto de entrada del embrión y aplicar aproximadamente tres PSI de presión negativa a la entrada de gas utilizando una bomba de vacío portátil para abrir los microcanales del embrión. Luego incline el chip microfluídico hacia abajo para que los embriones se alineen automáticamente y se asienten en los microcanales embrionarios. Si las entradas del microcanal del embrión se obstruyen por múltiples embriones que entran simultáneamente, incline el chip microfluídico hacia arriba y luego hacia abajo nuevamente para despejar la obstrucción.Según el rendimiento requerido, introduzca hasta 300 embriones en los microcanales embrionarios. Una vez completada la carga embrionaria, retire el vacío para inmovilizar los embriones. Luego incline el chip microfluídico de nuevo a la posición horizontal.Conecte una fuente de presión positiva portátil con un manómetro a la entrada de gas para aplicar tres PSI de compresión. Si se van a realizar experimentos de imágenes en vivo en los embriones estimulados mecánicamente, coloque el chip microfluídico en un portaobjetos de vidrio de etapa de microscopio estándar con la entrada de gas conectada a la fuente de presión. Examinar los embriones bajo un microscopio fluorescente dentro de los canales microfluídicos.Una vez que se completa el experimento de compresión, los embriones se pueden recolectar para el análisis posterior. Para ello, primero, aplica el vacío a la entrada de gas para liberar los embriones. Luego incline el chip microfluídico hacia arriba para que los embriones se muevan hacia abajo hacia el puerto de introducción de embriones.Recoger los embriones del chip microfluídico utilizando una pipeta de vidrio. La funcionalidad del dispositivo microfluídico se determinó experimentalmente cargando embriones de Drosophila en los canales de compresión y aplicando presión positiva a los canales de gas. Los embriones no experimentan una compresión significativa al vacío, o en estados de presión neutra.Se comprimen cuando se aplica presión positiva. Las mediciones del ancho decreciente de los embriones bajo un microscopio demuestran cómo se puede utilizar la presión del gas para obtener un nivel de compresión objetivo. Los dispositivos microfluídicos fabricados de esta manera permiten la estimulación química de muestras inmovilizadas.La estimulación permite imágenes espaciotemporales altas. Una pregunta fundamental en biología del desarrollo es ¿cómo regulan las fuerzas mecánicas la expresión de proteínas y genes durante el desarrollo? Esta tecnología nos permite aplicar estimulación mecánica a un gran número de embriones a la vez, de modo que podamos aislar cantidades suficientes de proteínas y ARN para realizar experimentos comparativos de proteómica o transcriptómica.Esto permitirá a los investigadores aprender más sobre las proteínas y los genes que son sensibles a las fuerzas mecánicas.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

Microarrays de polímeros de alto rendimiento para el descubrimiento de Biomateriales

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Investigación

Bioingeniería

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Proteínas de alto rendimiento del generador de expresiones utilizando una plataforma de microfluidos

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

High Throughput Microfluidic Rapid and Low Cost Prototyping Packaging Methods

In this work, 3 different packaging and assembly techniques are presented. They can be classified into two categories: one-time use and reusable packaging ...

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

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A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Una plataforma microfluídica para el aislamiento de gran procesamiento de celda única y Cultura

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

High-throughput Identification of Bacteria Repellent Polymers for Medical Devices

De alto rendimiento de identificación de bacterias polímeros repelentes para dispositivos médicos

Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Microbioreactor uso de alto rendimiento automático para la producción de IgG1 modelo en células CHO

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

A Microfluidic Platform for Stimulating Chondrocytes with Dynamic Compression

Una plataforma microfluídica para estimular los condrocitos con compresión dinámica

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth ...