Name: mechanostimulation of multicellular organisms through a high-throughput microfluidic compression system
Uploaded: 2022-12-23T13:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mechanostimulation of Multicellular Organisms Through a High-Throughput Microfluidic Compression System at JoVE.com

Bu çalışma Ulusal Bilim Vakfı (CMMI-1946456), Hava Kuvvetleri Bilimsel Araştırma Ofisi (FA9550-18-1-0262) ve Ulusal Sağlık Enstitüsü (R01AG06100501A1; R21AR08105201A1).

1. Silikon gofret kalıbının hazırlanması
<ol><li>Silikon gofreti (bakınız Malzeme Tablosu) önce asetonla, sonra izopropil alkolle (IPA) temizleyin.</li>
	<li>Silikon gofreti, dehidrasyon fırını için 30 dakika boyunca 250 °C'lik bir sıcak plakaya yerleştirin (Şekil 3A).</li>
	<li>Silikon gofreti buhar asal fırında hekzametildiilazan (HDMS) ile kaplayın (bkz. Malzeme Tablosu) (proses sıcaklığı: 150 °C, proses basınc?...

<ol>
	<li>Wang, J. H. -. C., Thampatty, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introductory+review+of+cell+mechanobiology.">An introductory review of cell mechanobiology.</a> Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 5 (1), 1-16 (2006).</li><li>Ingber, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanobiology+and+diseases+of+mechanotransduction.">Mechanobiology and diseases of mechanotransduction.</a> Annals of Medicine. 35 (8), 564-577 (2003).</li><li>Nims, R. J., Pferdehirt, L., Guilak, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanogenetics:+Harnessing+mechanobiology+for+cellular+engineering.">Mechanogenetics: Harnessing mechanobiology for cellular engineering.</a> Current Opinion in Biotechnology. 73, 374-379 (2022).</li><li>Bellin, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+Role+of+Syndecan-4+in+Mechanotransduction+using+Surface-Modification+Approaches.">Defining the Role of Syndecan-4 in Mechanotransduction using Surface-Modification Approaches.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 22102-22107 (2009).</li><li>Simpson, L. J., Reader, J. S., Tzima, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+regulation+of+protein+translation+in+the+cardiovascular+system.">Mechanical regulation of protein translation in the cardiovascular system.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 34 (2020).</li><li>Humphrey, J. D., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+mechanobiology:+Homeostasis,+adaptation,+and+disease.">Vascular mechanobiology: Homeostasis, adaptation, and disease.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 23, 1-27 (2021).</li><li>Maurer, M., Lammerding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+driving+force:+Nuclear+mechanotransduction+in+cellular+function,+fate,+and+disease.">The driving force: Nuclear mechanotransduction in cellular function, fate, and disease.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 21, 443-468 (2019).</li><li>Jennings, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila-A+versatile+model+in+biology+&amp;+medicine.">Drosophila-A versatile model in biology &amp; medicine.</a> Materials Today. 14 (5), 190-195 (2011).</li><li>Konno, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State-of-the-art+technology+of+model+organisms+for+current+human+medicine.">State-of-the-art technology of model organisms for current human medicine.</a> Diagnostics. 10 (6), 392 (2020).</li><li>Morgan, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+limited+inheritance+in+Drosophila.">Sex limited inheritance in Drosophila.</a> Science. 32 (812), 120-122 (1910).</li><li>Wu, Q., Kumar, N., Velagala, V., Zartman, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+to+reverse-engineer+multicellular+systems:+Case+studies+using+the+fruit+fly.">Tools to reverse-engineer multicellular systems: Case studies using the fruit fly.</a> Journal of Biological Engineering. 13 (1), 1-16 (2019).</li><li>Jayamohan, H., et al., Patrinos, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+11+-+Advances+in+Microfluidics+and+Lab-on-a-Chip+Technologies.">Chapter 11 - Advances in Microfluidics and Lab-on-a-Chip Technologies.</a> Molecular Diagnostics. , 197-217 (2017).</li><li>Scheler, O., Postek, W., Garstecki, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+developments+of+microfluidics+as+a+tool+for+biotechnology+and+microbiology.">Recent developments of microfluidics as a tool for biotechnology and microbiology.</a> Current Opinion in Biotechnology. 55, 60-67 (2019).</li><li>Mohammed, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innovative+tools+for+mechanobiology:+Unraveling+outside-in+and+inside-out+mechanotransduction.">Innovative tools for mechanobiology: Unraveling outside-in and inside-out mechanotransduction.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 162 (2019).</li><li>Shorr, A. Z., S&#246;nmez, U. M., Minden, J. S., LeDuc, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+mechanotransduction+in+Drosophila+embryos+with+mesofluidics.">High-throughput mechanotransduction in Drosophila embryos with mesofluidics.</a> Lab on a Chip. 19 (7), 1141-1152 (2019).</li><li>Kim, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanochemical+Actuators+of+Embryonic+Epithelial+Contractility.">Mechanochemical Actuators of Embryonic Epithelial Contractility.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 40, 14366-14371 (2014).</li><li>Ashburner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila. A Laboratory Handbook. , (1989).</li><li>Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+lithography+for+micro-and+nanoscale+patterning.">Soft lithography for micro-and nanoscale patterning.</a> Nature Protocols. 5 (3), 491 (2010).</li><li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+fabrication+process+for+uniform+SU-8+thick+photoresist+structures+by+simultaneously+removing+edge+bead+and+air+bubbles.">A new fabrication process for uniform SU-8 thick photoresist structures by simultaneously removing edge bead and air bubbles.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 21 (12), 125006 (2011).</li><li>Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+lithography.">Soft lithography.</a> Annual Review of Materials Science. 28 (1), 153-184 (1998).</li><li>Sonmez, U. M., Coyle, S., Taylor, R. E., LeDuc, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycarbonate+heat+molding+for+soft+lithography.">Polycarbonate heat molding for soft lithography.</a> Small. 16 (16), 2000241 (2020).</li><li>Levario, T. J., Zhan, M., Lim, B., Shvartsman, S. Y., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+trap+array+for+massively+parallel+imaging+of+Drosophila+embryos.">Microfluidic trap array for massively parallel imaging of Drosophila embryos.</a> Nature Protocols. 8 (4), 721-736 (2013).</li></ol>

Makale, yüzlerce Drosophila embriyosuna mekanik stimülasyonu otomatik olarak hizalamak, hareketsiz hale getirmek ve hassas bir şekilde uygulamak için mikroakışkan bir cihazın geliştirilmesini açıklamaktadır. Mikroakışkan sistemin ince bir cam kapak kayması ile entegrasyonu, stimülasyon sırasında embriyoların yüksek çözünürlüklü konfokal mikroskopi ile görüntülenmesini sağlamıştır. Mikroakışkan cihaz ayrıca, aşağı akış biyolojik tahlillerinin çalıştırılması için stim...

Canlı sistemler, yaşamları boyunca çeşitli mekanik girdileri sürekli olarak deneyimlemekte ve bunlara yanıt vermektedir1. Mekanotransdüksiyon, gelişimsel bozukluklar, kas ve kemik kaybı ve mekanik ortamdan doğrudan veya dolaylı olarak etkilenen sinyal yolları yoluyla nöropatolojiler dahil olmak üzere birçok hastalıkla ilişkilendirilmiştir2. Bununla birlikte, mekanosensitif sinyal yolakları4'te mekanik stimülasyon3 ile düzenlenen genler ve proteinler büyük ölçüde bilinmemektedir5, mekanik düzenleme mekanizmalarının aydınlatılmasını ve patolojik mekanotransdüksiyonla ilişkili hastalıklar için moleküler hedeflerin belirlenmesini engellemektedir 6,7 . Mekanobiyoloji çalışmalarının ilgili fizyolojik süreçlere yansıtılmasında sınırlayıcı bir faktör, bozulmamış çok hücreli organizmalar yerine geleneksel kültür çanaklarına sahip bireysel hücrelerin kullanılmasıdır. Drosophila melanogaster (meyve sineği) gibi model organizmalar, hayvan gelişiminde rol oynayan genlerin, sinyal yollarının ve proteinlerin anlaşılmasına büyük katkıda bulunmuştur 8,9,10. Bununla birlikte, mekanobiyoloji araştırmalarında Drosophila ve diğer çok hücreli model organizmaların kullanılması, deneysel araçlarla ilgili zorluklarla engellenmiştir. Çeşitli uyaranları hazırlamak, sıralamak, görüntülemek veya uygulamak için kullanılan geleneksel teknikler çoğunlukla manuel manipülasyon gerektirir; Bu yaklaşımlar zaman alıcıdır, uzmanlık gerektirir, değişkenlik getirir ve deneysel tasarımı ve örneklem büyüklüğünü sınırlar11. Son mikroteknolojik gelişmeler, çok yüksek verim ve yüksek kontrollü deneysel parametrelere sahip yeni biyolojik tahlillerin etkinleştirilmesi için harika bir kaynaktır12,13,14.
Bu makalede, yüzlerce Drosophila embriyosuna tek eksenli sıkıştırma şeklinde mekanik stimülasyonu hizalamak, hareketsiz hale getirmek ve hassas bir şekilde uygulamak için geliştirilmiş bir mikroakışkan cihazın geliştirilmesi anlatılmaktadır15 (Şekil 1). Mikroakışkan sistemin bir cam kapak kayışı ile entegrasyonu, stimülasyon sırasında numunelerin yüksek çözünürlüklü konfokal görüntülenmesini sağladı. Mikroakışkan cihaz ayrıca -omik tahlillerin çalıştırılması için stimülasyondan sonra embriyoların hızlı bir şekilde toplanmasını sağladı (Şekil 2). Bu cihazın tasarım hususlarının yanı sıra yumuşak litografi ve deneysel karakterizasyon kullanılarak yapılan imalatın açıklamaları burada açıklanmaktadır. Böyle bir cihazın silikon gofret kalıbını yapmak, yüksek en-boy oranlı (AR) hendeklere (AR >5) sahip geniş alanlar üzerinde kalın fotodirencin (kalınlık >200 μm) düzgün bir kaplamasını gerektirdiğinden, bu yöntem geleneksel fotolitografik kalıp imalat protokolünü önemli ölçüde değiştirdi. Bu şekilde, bu yöntem fotodirencin taşınmasını, yapışmasını, kaplanmasını, desenlenmesini ve geliştirilmesini kolaylaştırdı. Ek olarak, potansiyel tuzaklar ve çözümleri tartışılmaktadır. Son olarak, bu tasarım ve üretim stratejisinin çok yönlülüğü, Drosophila yumurta odaları ve beyin organoidleri16 gibi diğer çok hücreli sistemler kullanılarak gösterilmiştir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mL tri-cornered perforated plastic beakers with 60 mm Petri dishes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-955-111B</td>
			<td>Perferate with air holes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm P B &#60;100&#62; 0-100 500um SSP Test Grade Si Wafer</td>
			<td>University Wafer</td>
			<td>452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punches</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>15110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Not brand specific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt needle set</td>
			<td>CML Supply</td>
			<td>901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Contact Mask Aligner</td>
			<td>Quintel</td>
			<td>Q4000 MA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cutting mat</td>
			<td>Dahle</td>
			<td>Vantage 10670</td>
			<td>size: 24&#34; x 36&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Developer</td>
			<td>Kayaku Advance Materials</td>
			<td>SU-8 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct Write Lithographer</td>
			<td>Heidelberg</td>
			<td>MLA100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any commericailly availble dissecting microscope with transmitted light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass petri dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0710&#160; (CS-24/60)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HMDS Vapor Prime Oven</td>
			<td>Yes Engineering</td>
			<td>YES-3TA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Not brand specific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>I5110A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paintbrush</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Not brand specific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>SU-8 2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable pressure source</td>
			<td>hygger Quietest</td>
			<td>HGD946</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure gauge</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-68950-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin Coater</td>
			<td>Laurell</td>
			<td>WS-650-8B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane (PFOCTS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>448931-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X 100</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA16046AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing</td>
			<td>Saint-Gobain</td>
			<td>02-587-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UX-08895-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Pump</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-07164-87</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mechanostimulation of multicellular organisms through a high-throughput microfluidic compression system

Embriyogenez sırasında, koordineli hücre hareketi, gen ekspresyonunu ve aktivitesini düzenleyen mekanik kuvvetler üretir. Bu süreci incelemek için, tüm embriyoları mekanik olarak uyarmak için aspirasyon veya örtü slip sıkıştırma gibi araçlar kullanılmıştır. Bu yaklaşımlar, kesin olmadıkları, manuel kullanım gerektirdikleri ve aynı anda sadece birkaç embriyoyu işleyebildikleri için deneysel tasarımı sınırlar. Mikroakışkan sistemler, verimi ve hassasiyeti artırırken bu tür deneysel görevleri otomatikleştirmek için büyük potansiyele sahiptir. Bu makalede, tüm Drosophila melanogaster (meyve sineği) embriyolarını hassas bir şekilde sıkıştırmak için geliştirilen mikroakışkan bir sistem açıklanmaktadır. Bu sistem, pnömatik olarak çalıştırılan deforme edilebilir yan duvarlara sahip mikro kanallara sahiptir ve embriyo hizalaması, immobilizasyon, sıkıştırma ve stimülasyon sonrası toplanmasını sağlar. Bu mikro kanalları yedi şeride paralel hale getirerek, aynı anda yüzlerce Drosophila embriyosuna sabit veya dinamik sıkıştırma desenleri uygulanabilir. Bu sistemin bir cam kapak parçası üzerinde imal edilmesi, numunelerin yüksek çözünürlüklü mikroskoplarla eşzamanlı mekanik stimülasyonunu ve görüntülenmesini kolaylaştırır. Dahası, PDMS gibi biyouyumlu malzemelerin kullanımı ve sistemden sıvı akıtma yeteneği, bu cihazı medyaya bağımlı numunelerle uzun süreli deneyler yapabilmektedir. Bu yaklaşım aynı zamanda numuneleri mekanik olarak geren manuel montaj gereksinimini de ortadan kaldırır. Ayrıca, mikrokanallardan hızlı bir şekilde numune toplama yeteneği, geleneksel mekanik stimülasyon yaklaşımları kullanılarak elde edilemeyen büyük örneklem sayıları gerektiren -omik testler de dahil olmak üzere stimülasyon sonrası analizlere olanak tanır. Bu sistemin geometrisi, farklı biyolojik sistemlere kolayca ölçeklenebilir ve çok sayıda alanın, yüksek numune verimi, mekanik stimülasyon veya immobilizasyon ve otomatik hizalama dahil olmak üzere burada açıklanan işlevsel özelliklerden yararlanmasını sağlar.

Mikroakışkan sistem, deforme olabilen PDMS yan duvarları ile ayrılmış iki alt bölmeye ayrılmıştır. İlk bölme, Drosophila embriyolarının tanıtıldığı, otomatik olarak hizalandığı, sıralandığı ve sıkıştırıldığı sıvı sistemdir. İkinci bölme, sıkıştırma kanallarının her iki tarafındaki gaz basıncının, sıkıştırma kanallarının etkin genişliğini hassas bir şekilde kontrol etmek için çıkmaz mikro kanallar aracılığıyla kontrol edildiği bir gaz sist...

Watch this Scientific Journal Video about Mechanostimulation of Multicellular Organisms Through a High-Throughput Microfluidic Compression System at JoVE.com

Mechanostimulation of Multicellular Organisms Through a High-Throughput Microfluidic Compression System

Mevcut protokol, yüzlerce Drosophila melanogaster embriyosunu minimum kullanıcı müdahalesiyle hizalayabilen, hareketsiz hale getirebilen ve hassas bir şekilde sıkıştırabilen mikroakışkan bir sistemin tasarımını, üretimini ve karakterizasyonunu açıklamaktadır. Bu sistem, stimülasyon sonrası analiz için numunelerin yüksek çözünürlüklü görüntülenmesini ve geri kazanılmasını sağlar ve diğer çok hücreli biyolojik sistemlere uyum sağlayacak şekilde ölçeklendirilebilir.

Çok Hücreli Organizmaların Yüksek Verimli Bir Mikroakışkan Sıkıştırma Sistemi Aracılığıyla Mekanostimülasyonu

During embryogenesis, coordinated cell movement generates mechanical forces that regulate gene expression and activity. To study this process, tools such ...

Bu protokol, numune çıktısı, otomatik elleçleme ve numuneleri görselleştirirken mekanik gerilimi hassas bir şekilde uygulama yeteneğindeki deneysel avantajlardan yararlanmak için mikroakışkan teknolojilerinin nasıl üretileceğini ve kullanılacağını açıklamaktadır. Bu teknik, embriyolar ve organoidler gibi çok hücreli biyolojik organizmaların immobilizasyonları, hizalamaları ve canlı görüntülemeleri için manuel olarak kullanılmasını en aza indirir. Ayrıca mekanobiyoloji çalışmaları için mekanik sıkıştırmanın onlara uygulanmasını sağlar.Bu mikroakışkan çip için yüksek en boy oranı özelliklerine sahip kalıpların üretimi, geleneksel mikrofabrikasyon teknikleriyle zor olabilir. Bu video makalesinde açıklanan ipuçları bu zorlukların üstesinden gelebilir. Başlamak için, silikon gofreti önce asetonla, sonra izopropil alkolle temizleyin.Silikon gofreti 30 dakika boyunca 250 santigrat derecelik bir sıcak plakaya yerleştirin. dehidrasyon fırını için. Silikon gofreti bir buhar asal fırında hekzametildisiloksan ile kaplayın.Viskozitesini azaltmak için bir şişe SU-8 2100 Fotodirenci 60 santigrat derece fırına 15 dakika koyun. Photoresist yüzeyin çoğunu kaplayana kadar sıcak plakaya yerleştirilen silikon gofretin her bir inç için ısıtılmış Fotodirencin bir mililitresini dökün. Ön spini önce 30 saniye boyunca dakikada 250 rotasyonda, ardından 30 saniye boyunca dakikada 350 rotasyonda uygulayın ve her ikisi de saniyede 100 RPM hızlanma ile 30 saniye daha uygulayın.Ardından, önce saniyede 100 RPM hızlanma ile 15 saniye boyunca dakikada 500 dönüşte ve ardından saniyede 300 RPM hızlanma ile 30 saniye boyunca dakikada 1.450 dönüşte bir spin uygulayın. Kenar boncuğu temiz oda çubuğu ile çıkarın ve kusurları gidermek ve düzgün kaplamayı teşvik etmek için gofret üzerine aseton püskürtün. Silikon gofreti, fotoğraf maskesi aracılığıyla santimetre kare başına 350 milijoule UV ışığına maruz bırakın.Kontak maskesi hizalayıcısını kullanarak, silikon gofrete maruz kalma sonrası fırını uygulayın ve oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. Beheri başka bir büyük kabın içine yerleştirin ve daha büyük beheri yeni bir geliştirici çözümüyle doldurun. Beher üzerine metal bir ağ yerleştirin.Silikon gofreti metal ağın üzerine baş aşağı yerleştirin. Silikon gofreti, karıştırıcı açıkken 30 dakika boyunca geliştiriciye batırılmış halde bırakın. Silikon gofreti, 40 kilohertz'de bir saat boyunca taze geliştirici ile doldurulmuş bir ultrasonik banyo sonicator'a aktarın.Ardından gofreti beherden çıkarın ve yeni bir geliştirici çözümüyle yıkayın. PDMS tabanını kürleme maddesi ile 10'a bir oranında karıştırarak önceden kürlenmiş PDMS çözeltisini hazırlayın. Karışımı oda sıcaklığında beş dakika boyunca 500 g için bir santrifüje yerleştirerek gazdan arındırın.Önceden kürlenmiş PDMS'yi bir silikon gofret üzerine dökün ve tekrar gazını çözün. Son olarak, kürlenmemiş PDMS'yi kürleme için 60 santigrat derece fırına yerleştirin. Mikroakışkan çip geometrisine karşılık gelen kürlenmiş PDMS bölgesinin sınırlarını kesmek için bir neşter kullanın.PDMS'deki giriş ve çıkış deliklerini biyopsi zımbasını veya künt uçlu bir iğneyi kullanın. PDMS'yi, plazma işleminden sonra desenli yüzeyi cam slayta bakacak şekilde cam slaytın üzerine yerleştirin ve mikrokanalları kovalent yapıştırma yoluyla kapatın. Oregon-R yetişkin sineklerinin elma suyu agar plakalarına yumurta bırakmasına izin verin ve verilen deney için yumurtlamadan sonra plakaları istenen gelişim zamanında toplayın.Agar'ı embriyo yumurtası yıkama ile doldurun ve embriyoları agardan çıkarmak için bir boya fırçasıyla hafifçe çalkalayın. Embriyoları, ara sıra karıştırarak, 90 saniye boyunca% 50'lik bir ağartıcı çözeltisine aktarın. Embriyoları bir doku eleğinden süzün ve ağartıcı çözeltisini suyla iyice yıkayın.Embriyoları, embriyoları tamamen örtmek için yeterli embriyo yumurta yıkama ile 90 milimetrelik bir cam Petri kabına aktarın. Embriyoları diseksiyon mikroskobunda transillumination ile inceleyin ve mikroakışkan cihaza yüklenmek üzere istenen gelişim aşamasındaki embriyoları seçin. Yedi embriyo mikrokanalının tümünü, ana embriyo giriş portundan 0.4 mikrometre filtrelenmiş IPA ile doldurarak astarlayın.IPA'yı 0,4 mikrometre filtrelenmiş deiyonize su ile değiştirin. Daha sonra DI suyunu embriyo yumurta yıkama çözeltisi ile değiştirin. Cam pipet kullanarak cam Petri kabından yaklaşık 100 önceden seçilmiş embriyo toplayın.Daha sonra, embriyoları embriyo giriş portuna pipetleyin ve embriyo mikrokanallarını açmak için portatif bir vakum pompası kullanarak gaz girişine yaklaşık üç PSI negatif basınç uygulayın. Ardından, embriyoların otomatik olarak hizalanması ve embriyo mikrokanallarına yerleşmesi için mikroakışkan çipi aşağı doğru eğin. Embriyo mikrokanal girişleri aynı anda giren birden fazla embriyo tarafından tıkanırsa, mikroakışkan çipi yukarı doğru eğin ve ardından tıkanmayı temizlemek için tekrar aşağı doğru eğin.Gerekli verime dayanarak, embriyo mikrokanallarına 300 kadar embriyo sokuldu. Embriyo yüklemesi tamamlandıktan sonra, embriyoları hareketsiz hale getirmek için vakumu çıkarın. Ardından mikro akışkan çipi yatay konuma geri eğin.Üç PSI sıkıştırması uygulamak için gaz girişine basınç göstergesine sahip taşınabilir bir pozitif basınç kaynağı bağlayın. Mekanik olarak uyarılan embriyolar üzerinde canlı görüntüleme deneyleri yapılacaksa, mikroakışkan çipi, basınç kaynağına bağlı gaz girişi ile standart bir mikroskop sahne cam slayt tutucusuna yerleştirin. Embriyoları mikroakışkan kanalların içindeki floresan mikroskop altında inceleyin.Sıkıştırma deneyi tamamlandıktan sonra, embriyolar aşağı akış analizi için toplanabilir. Bunu yapmak için, önce embriyoları serbest bırakmak için vakumu gaz girişine uygulayın. Ardından, embriyoların embriyo giriş portuna doğru aşağı doğru hareket etmesi için mikroakışkan çipi yukarı doğru eğin.Bir cam pipet kullanarak embriyoları mikroakışkan çipten toplayın. Mikroakışkan cihazın işlevselliği, Drosophila embriyolarının sıkıştırma kanallarına yüklenmesi ve gaz kanallarına pozitif basınç uygulanması ile deneysel olarak belirlendi. Embriyolar vakum altında veya nötr basınç durumlarında önemli bir sıkıştırma yaşamaz.Pozitif basınç uygulandığında sıkıştırılırlar. Mikroskop altında embriyoların azalan genişliğinin ölçümleri, gaz basıncının hedef sıkıştırma seviyesini elde etmek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. Bu şekilde yapılan mikroakışkan cihazlar, hareketsiz numunelerin kimyasal olarak uyarılmasına izin verir.Stimülasyon, yüksek uzaysal zamansal görüntülemeye izin verir. Gelişim biyolojisindeki temel bir soru, mekanik kuvvetlerin gelişim sırasında protein ve gen ekspresyonunu nasıl düzenlediğidir? Bu teknoloji, aynı anda çok sayıda embriyoya mekanik stimülasyon uygulamamıza izin verir, böylece karşılaştırmalı proteomik veya transkriptomik deneyler yapmak için yeterli miktarda protein ve RNA'yı izole edebiliriz.Bu, araştırmacıların mekanik kuvvetlere duyarlı proteinler ve genler hakkında daha fazla bilgi edinmelerini sağlayacaktır.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

Biyomalzemelerin Yüksek Verimli Discovery için Polimer Mikroarray&#39;ler

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Bir mikroakışkan Platform kullanarak Yüksek throughput Protein Ekspresyonu Jeneratör

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

High Throughput Microfluidic Rapid and Low Cost Prototyping Packaging Methods

In this work, 3 different packaging and assembly techniques are presented. They can be classified into two categories: one-time use and reusable packaging ...

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

Sistematik Analizi<em&gt; In Vitro</emÇok-çukurlu plaka mikroakışkan Sistemi ile&gt; Hücre Rolling

A major challenge for cell-based therapy is the inability to systemically target a large quantity of viable cells with high efficiency to tissues of ...

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

Yüksek verimli bir kullanımı<em&gt; İn Vitro</em&gt; Mikroakışkan Sistemi Ağız Çok türler biyofilm Geliştirmek İçin

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Tomoauto kullanma: Bir Protokol Yüksek verim Otomatik Cryo-elektron Tomografi için

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Yüksek verim Tek hücreli İzolasyonu ve Kültür mikroakışkan Platformu

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

High-throughput Identification of Bacteria Repellent Polymers for Medical Devices

Tıbbi Cihazlar Bakterilerin yüksek verimlilik Kimlik Savar Polimerler

Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Yüksek üretilen iş kullanımı otomatik Microbioreactor sistemi modeli Igg1 CHO hücrelerdeki imalatı için

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

A Microfluidic Platform for Stimulating Chondrocytes with Dynamic Compression

Dinamik Sıkıştırma ile Chondrocytes Uyarıcı için Bir Mikroakışkan Platform

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth ...