Name: efficient transfection of in vitro transcribed mrna in cultured cells using peptide-poloxamine nanoparticles
Uploaded: 2022-08-17T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Transfection of In vitro Transcribed mRNA in Cultured Cells Using Peptide-Poloxamine Nanoparticles at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (NSFC ، المنحة رقم 82041045 و 82173764) ، والمشروع الرئيسي لدراسة نظام تكنولوجيا الإمراض والوقاية من الأوبئة (2021YFC2302500) من قبل وزارة العلوم والتكنولوجيا في الصين ، ومشروع تشونغتشينغ للمواهب: المواهب الشابة الاستثنائية (CQYC202005027) ، ومؤسسة العلوم الطبيعية في تشونغتشينغ (cstc2021jcyj-msxmX0136). المؤلفون ممتنون للدكتور شياويان دينغ لقياس القطر الهيدروديناميكي (نانومتر) ومؤشر التشتت المتعدد (PDI).

1. النسخ في المختبر من الحمض النووي الريبي المرسال المعدل كيميائيا
ملاحظة: يلزم استخدام أنابيب خالية من النوكليز ، والكواشف ، والأواني الزجاجية ، ونصائح الماصة ، وما إلى ذلك ، لأن RNases موجودة في كل مكان في البيئة ، مثل المحاليل المختبرية ، وأسطح الأدوات ، والشعر ?...

<ol>
	<li>Nature milestones in vaccines. Springer Nature Available from: <a target="_blank" href="https://www.nature.com/collections/hcajdiajij">https://www.nature.com/collections/hcajdiajij</a> (2020)</li><li>Barbier, A. J., Jiang, A. Y., Zhang, P., Wooster, R., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+progress+of+mRNA+vaccines+and+immunotherapies.">The clinical progress of mRNA vaccines and immunotherapies.</a> Nature Biotechnology. 40 (6), 840-854 (2022).</li><li>Mulligan, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+I/II+study+of+COVID-19+RNA+vaccine+BNT162b1+in+adults.">Phase I/II study of COVID-19 RNA vaccine BNT162b1 in adults.</a> Nature. 586 (7830), 589-593 (2020).</li><li>Tang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotechnologies+in+delivery+of+DNA+and+mRNA+vaccines+to+the+nasal+and+pulmonary+mucosa.">Nanotechnologies in delivery of DNA and mRNA vaccines to the nasal and pulmonary mucosa.</a> Nanomaterials. 12 (2), 226 (2022).</li><li>Freyn, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multi-targeting,+nucleoside-modified+mRNA+influenza+virus+vaccine+provides+broad+protection+in+mice.">A multi-targeting, nucleoside-modified mRNA influenza virus vaccine provides broad protection in mice.</a> Molecular Therapy. 28 (7), 1569-1584 (2020).</li><li>Wu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variant+SARS-CoV-2+mRNA+vaccines+confer+broad+neutralization+as+primary+or+booster+series+in+mice.">Variant SARS-CoV-2 mRNA vaccines confer broad neutralization as primary or booster series in mice.</a> Vaccine. 39 (51), 7394-7400 (2021).</li><li>Chaudhary, N., Weissman, D., Whitehead, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+vaccines+for+infectious+diseases:+Principles,+delivery+and+clinical+translation.">mRNA vaccines for infectious diseases: Principles, delivery and clinical translation.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 20, 817-838 (2021).</li><li>Kormann, M. S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+therapeutic+proteins+after+delivery+of+chemically+modified+mRNA+in+mice.">Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice.</a> Nature Biotechnology. 29 (2), 154-157 (2011).</li><li>Tavernier, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+as+gene+therapeutic:+How+to+control+protein+expression.">mRNA as gene therapeutic: How to control protein expression.</a> Journal of Controlled Release. 150 (3), 238-247 (2011).</li><li>Walsh, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+immunogenicity+of+two+RNA-based+Covid-19+vaccine+candidates.">Safety and immunogenicity of two RNA-based Covid-19 vaccine candidates.</a> The New England Journal of Medicine. 383 (25), 2439-2450 (2020).</li><li>Baden, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+safety+of+the+mRNA-1273+SARS-CoV-2+vaccine.">Efficacy and safety of the mRNA-1273 SARS-CoV-2 vaccine.</a> The New England Journal of Medicine. 384 (5), 403-416 (2021).</li><li>Guan, S., Rosenecker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotechnologies+in+delivery+of+mRNA+therapeutics+using+nonviral+vector-based+delivery+systems.">Nanotechnologies in delivery of mRNA therapeutics using nonviral vector-based delivery systems.</a> Gene Therapy. 24 (3), 133-143 (2017).</li><li>Sharova, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Database+for+mRNA+half-life+of+19+977+genes+obtained+by+DNA+microarray+analysis+of+pluripotent+and+differentiating+mouse+embryonic+stem+cells.">Database for mRNA half-life of 19 977 genes obtained by DNA microarray analysis of pluripotent and differentiating mouse embryonic stem cells.</a> DNA Research. 16 (1), 45-58 (2009).</li><li>Houseley, J., Tollervey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+many+pathways+of+RNA+degradation.">The many pathways of RNA degradation.</a> Cell. 136 (4), 763-776 (2009).</li><li>Kowalski, P. S., Rudra, A., Miao, L., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivering+the+messenger:+Advances+in+technologies+for+therapeutic+mRNA+delivery.">Delivering the messenger: Advances in technologies for therapeutic mRNA delivery.</a> Molecular Therapy. 27 (4), 710-728 (2019).</li><li>Sahin, U., Karik&#243;, K., T&#252;reci, &. #. 2. 1. 4. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MRNA-based+therapeutics-developing+a+new+class+of+drugs.">MRNA-based therapeutics-developing a new class of drugs.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 13, 359-380 (2014).</li><li>Hajj, K. A., Whitehead, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+translation:+Non-viral+materials+for+therapeutic+mRNA+delivery.">Tools for translation: Non-viral materials for therapeutic mRNA delivery.</a> Nature Reviews Materials. 2, 17056 (2017).</li><li>Deering, R. P., Kommareddy, S., Ulmer, J. B., Brito, L. A., Geall, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+acid+vaccines:+Prospects+for+non-viral+delivery+of+mRNA+vaccines.">Nucleic acid vaccines: Prospects for non-viral delivery of mRNA vaccines.</a> Expert Opinion on Drug Delivery. 11 (6), 885-899 (2014).</li><li>Wadhwa, A., Aljabbari, A., Lokras, A., Foged, C., Thakur, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opportunities+and+challenges+in+the+delivery+of+mRNA-based+vaccines.">Opportunities and challenges in the delivery of mRNA-based vaccines.</a> Pharmaceutics. 12 (2), 102 (2020).</li><li>Hou, X., Zaks, T., Langer, R., Dong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+nanoparticles+for+mRNA+delivery.">Lipid nanoparticles for mRNA delivery.</a> Nature Reviews Materials. 6 (12), 1078-1094 (2021).</li><li>Sahin, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COVID-19+vaccine+BNT162b1+elicits+human+antibody+and+T(H)1+T+cell+responses.">COVID-19 vaccine BNT162b1 elicits human antibody and T(H)1 T cell responses.</a> Nature. 586 (7830), 594-599 (2020).</li><li>Azzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+immune+response+in+BNT162b2+COVID-19+vaccine+recipients.">Mucosal immune response in BNT162b2 COVID-19 vaccine recipients.</a> EBioMedicine. 75, 103788 (2022).</li><li>Guan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+peptide-poloxamine+nanoparticles+enable+in+vitro+and+in+vivo+genome+restoration+for+cystic+fibrosis.">Self-assembled peptide-poloxamine nanoparticles enable in vitro and in vivo genome restoration for cystic fibrosis.</a> Nature Nanotechnology. 14 (3), 287-297 (2019).</li><li>Pitard, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negatively+charged+self-assembling+DNA/poloxamine+nanospheres+for+in+vivo+gene+transfer.">Negatively charged self-assembling DNA/poloxamine nanospheres for in vivo gene transfer.</a> Nucleic Acids Research. 32 (20), 159 (2004).</li><li>Hiroi, T., Shibayama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+particle+size+distribution+in+turbid+solutions+by+dynamic+light+scattering+microscopy.">Measurement of particle size distribution in turbid solutions by dynamic light scattering microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), e54885 (2017).</li><li>Hassett, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+lipid+nanoparticle+size+on+mRNA+vaccine+immunogenicity.">Impact of lipid nanoparticle size on mRNA vaccine immunogenicity.</a> Journal of Controlled Release. 335, 237-246 (2021).</li><li>Suk, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+penetration+of+fresh+undiluted+sputum+expectorated+by+cystic+fibrosis+patients+by+non-adhesive+polymer+nanoparticles.">The penetration of fresh undiluted sputum expectorated by cystic fibrosis patients by non-adhesive polymer nanoparticles.</a> Biomaterials. 30 (13), 2591-2597 (2009).</li><li>Kim, N., Duncan, G. A., Hanes, J., Suk, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barriers+to+inhaled+gene+therapy+of+obstructive+lung+diseases:+A+review.">Barriers to inhaled gene therapy of obstructive lung diseases: A review.</a> Journal of Controlled Release. 240, 465-488 (2016).</li><li>Liu, Z., Fontana, F., Python, A., Hirvonen, J. T., Santos, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+production+of+particles:+Mechanism,+methodology,+and+applications.">Microfluidics for production of particles: Mechanism, methodology, and applications.</a> Small. 16 (9), 1904673 (2020).</li><li>Guan, S., Darmst&#228;dter, M., Xu, C., Rosenecker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+investigations+on+optimizing+and+nebulization+of+IVT-mRNA+formulations+for+potential+pulmonary-based+alpha-1-antitrypsin+deficiency+treatment.">In vitro investigations on optimizing and nebulization of IVT-mRNA formulations for potential pulmonary-based alpha-1-antitrypsin deficiency treatment.</a> Pharmaceutics. 13 (8), 1281 (2021).</li><li>Shepherd, S. J., Issadore, D., Mitchell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+formulation+of+nanoparticles+for+biomedical+applications.">Microfluidic formulation of nanoparticles for biomedical applications.</a> Biomaterials. 274, 120826 (2021).</li><li>Han, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+confined+impingement+jets+mixer+for+flash+nanoprecipitation.">A simple confined impingement jets mixer for flash nanoprecipitation.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 101 (10), 4018-4023 (2012).</li></ol>

لا يسمح البروتوكول الموصوف هنا فقط بالإنتاج الفعال من حيث التكلفة والسريع لتركيبات لقاح IVT mRNA ذات الخصائص المحددة ، ولكنه يوفر أيضا إمكانية تخصيص تركيبة PP-sNp وفقا لأغراض علاجية محددة ، مثل العلاج الجيني. من أجل ضمان التوليد الناجح ل IVT mRNA / PP-sNp ، يقترح إيلاء المزيد من الاهتمام لبعض الخطوات ا?...

وقد تم الإعلان عن التطعيم باعتباره واحدا من أكثر التدخلات الطبية كفاءة للحد من المراضة والوفيات الناجمة عن الأمراض المعدية1. وقد أثبتت أهمية اللقاحات منذ تفشي مرض فيروس كورونا 2019 (كوفيد-19). وعلى عكس المفهوم التقليدي لحقن مسببات الأمراض المعطلة أو الموهنة الحية، تركز أحدث نهج اللقاحات، مثل اللقاحات القائمة على الأحماض النووية، على الحفاظ على الخصائص المناعية لمسببات الأمراض المستهدفة مع تجنب قضايا السلامة المحتملة المرتبطة بالفيروس الميكروبي الكامل التقليدي أو في اللقاحات القائمة على البكتيريا. تظهر كل من الحمض النووي والحمض النووي الريبي (أي الحمض النووي الريبي المرسال المنسوخ في المختبر ، IVT mRNA) إمكانات وقائية إلى علاجية ضد مجموعة متنوعة من الأمراض ، بما في ذلك الأمراض المعدية والسرطانات 2,3. من حيث المبدأ، ترتبط إمكانات اللقاحات القائمة على الأحماض النووية بإنتاجها وفعاليتها وسلامتها4. يمكن تصنيع هذه اللقاحات بطريقة خالية من الخلايا للسماح بإنتاج فعال من حيث التكلفة وقابل للتطوير وسريع.
يمكن للقاح واحد قائم على الحمض النووي تشفير مستضدات متعددة ، مما يتيح استهداف العديد من المتغيرات الفيروسية أو البكتيريا مع انخفاض عدد التطعيمات وتعزيز الاستجابة المناعية ضد مسببات الأمراض المرنة 5,6. إلى جانب ذلك، يمكن أن تحاكي اللقاحات القائمة على الحمض النووي عملية الغزو الطبيعي للفيروس أو العدوى البكتيرية، مما يجلب استجابات مناعية بوساطة الخلايا البائية والخلايا التائية. على عكس بعض الفيروسات أو في اللقاحات القائمة على الحمض النووي ، توفر اللقاحات القائمة على IVT mRNA ميزة كبيرة من حيث السلامة. يمكنهم التعبير بسرعة عن المستضد المطلوب في السيتوسول ولا يتم دمجهم في الجينوم المضيف ، مما يغني عن المخاوف بشأن الطفرات الإدخالية7. يتحلل IVT-mRNA تلقائيا بعد الترجمة الناجحة ، لذلك يمكن التحكم بسهولة في حركية التعبير عن البروتين 8,9. بتحفيز من جائحة فيروس كورونا 2 (SARS-CoV-2) المسبب للمتلازمة التنفسية الحادة الوخيمة، مكنت الجهود التي تبذلها الشركات/المؤسسات في جميع أنحاء العالم من إطلاق العديد من أنواع اللقاحات في السوق. وتظهر تكنولوجيا اللقاحات القائمة على الحمض النووي الريبوزي المرسال IVT إمكانات كبيرة، وقد أثبتت لأول مرة نجاحها المتوقع سابقا، نظرا لتصميمها السريع وقدرتها المرنة على التكيف مع أي مستضدات مستهدفة في غضون عدة أشهر. لم يفتح نجاح لقاحات IVT mRNA ضد COVID-19 في التطبيقات السريرية حقبة جديدة من البحث والتطوير في لقاح IVT mRNA فحسب ، بل تراكم أيضا خبرة قيمة للتطوير السريع للقاحات الفعالة للتعامل مع تفشي الأمراض المعدية10,11.
على الرغم من الإمكانات الواعدة للقاحات الحمض النووي الريبوزي المرسال IVT ، فإن التسليم الفعال داخل الخلايا ل IVT mRNA إلى موقع العمل (أي السيتوبلازم) لا يزال يشكل عقبة رئيسية12 ، خاصة بالنسبة لتلك التي تدار عبر الشعب الهوائية4. IVT mRNA هو بطبيعته جزيء غير مستقر مع عمر نصف قصير للغاية (~ 7 h)13 ، مما يجعل IVT mRNA عرضة للغاية للتدهور بواسطة RNase14 في كل مكان. تميل الخلايا الليمفاوية في الجهاز المناعي الفطري إلى ابتلاع الحمض النووي الريبوزي المرسال IVT المعترف به في حالات التطبيق في الجسم الحي . علاوة على ذلك ، فإن كثافة الشحنة السالبة العالية والوزن الجزيئي الكبير (1 × 104-1 × 106 Da) ل IVT mRNA تضعف نفاذيتها الفعالة عبر الطبقة الثنائية من الدهون الأنيونية للأغشية الخلوية15. لذلك ، هناك حاجة إلى نظام توصيل مع بعض المواد الحيوية الوظيفية لمنع تدهور جزيئات الحمض النووي الريبوزي المرسال IVT وتسهيل امتصاص الخلايا16.
بصرف النظر عن بعض الحالات الاستثنائية التي تم فيها استخدام الحمض النووي الريبوزي المرسال IVT العاري مباشرة في التحقيقات في الجسم الحي ، يتم استخدام أنظمة التسليم المختلفة لنقل الحمض النووي الريبي المرسال IVT إلى الموقع العلاجي للعمل17,18. وقد كشفت الدراسات السابقة أنه يتم الكشف عن عدد قليل فقط من الحمض النووي الريبوزي المرسال IVT في سيتوسول دون مساعدة من نظام التسليم19. تم تطوير العديد من الاستراتيجيات لتحسين توصيل الحمض النووي الريبي مع الجهود المستمرة في هذا المجال ، بدءا من تكثيف البروتامين إلى تغليف الدهون20. الجسيمات النانوية الدهنية (LNPs) هي الأكثر تقدما سريريا بين مركبات توصيل الحمض النووي الريبوزي المرسال ، كما ثبت من حقيقة أن جميع لقاحات mRNA COVID-19 المعتمدة للاستخدام السريري تستخدم أنظمة توصيل قائمة على LNP21. ومع ذلك، لا يمكن لل LNPs التوسط في نقل الحمض النووي الريبوزي المرسال الفعال عندما يتم تسليم التركيبات عبر الطريق التنفسي22، مما يحد بشكل ملحوظ من تطبيق هذه التركيبات في تحفيز الاستجابات المناعية المخاطية أو معالجة الأمراض المرتبطة بالرئة مثل التليف الكيسي أو نقص α1-antitrypsin. لذلك ، فإن تطوير نظام تسليم جديد لتسهيل التسليم الفعال ونقل الحمض النووي الريبوزي المرسال IVT في الخلايا المرتبطة بمجرى الهواء مطلوب لحل هذه الحاجة غير الملباة.
وقد تأكد أن نظام إيصال الجسيمات النانوية ذاتية التجميع من الببتيد والبولوكسامين (PP-sNp) يمكن أن يتوسط في النقل الفعال للأحماض النووية في الجهاز التنفسي للفئران23. يعتمد PP-sNp نهج تصميم معياري متعدد الوظائف ، والذي يمكنه دمج وحدات وظيفية مختلفة في الجسيمات النانوية للفحص السريع والتحسين23. يمكن أن تتفاعل الببتيدات الاصطناعية والبوليمرات المشتركة للكتلة البرمائية المحايدة كهربائيا (البولوكسامين) داخل PP-sNp تلقائيا مع IVT mRNA لتوليد جسيمات نانوية موزعة بشكل موحد مع بنية مدمجة وسطح أملس23. يمكن ل PP-sNp تحسين تأثير نقل الجينات لجزيئات IVT mRNA في الخلايا المستزرعة والجهاز التنفسي للفئران23. تصف هذه الدراسة بروتوكولا لتوليد PP-sNp يحتوي على الحمض النووي الريبوزي المرسال IVT الذي يشفر Metridia luciferase (MetLuc-mRNA) (الشكل 1). يتم استخدام الخلط السريع والمتحكم فيه عبر جهاز خلط الموائع الدقيقة ، والذي يستخدم تصميم خلط العظام المتعرجة المتداخلة ، في هذا البروتوكول. الإجراء سهل التنفيذ ويسمح بتوليد PP-sNp بأحجام أكثر اتساقا. الهدف العام من إنتاج PP-sNp باستخدام خلاط الموائع الدقيقة هو إنشاء PP-sNp لتعقيد mRNA بطريقة يتم التحكم فيها جيدا ، مما يسمح بنقل الخلايا بكفاءة وقابلية للتكرار في المختبر. يصف هذا البروتوكول إعداد وتجميع وتوصيف PP-sNp المحتوي على MetLuc-mRNA.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BamHI</td>
			<td>Takara</td>
			<td>1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cap 1 capping system</td>
			<td>Jinan</td>
			<td>M082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dendritic cell-line</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SCC142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA sequence</td>
			<td>Genescript</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human bronchial epithelial cells</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SCC150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KpnI</td>
			<td>Takara</td>
			<td>1068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LP</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium chloride</td>
			<td>APEXBio</td>
			<td>B6083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malvern Zetasizer Nano ZS90</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>NB007605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic chip</td>
			<td>ZHONGXINQIHENG</td>
			<td>Standard PDMS chip</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate readers</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Varioskan lux</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>ND-ONE-W (A30221)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudouridine</td>
			<td>APE&#215;Bio</td>
			<td>B7972</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quanti-Luc</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>Rep-qlc2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RiboRuler High Range RNA Ladder</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>SM1821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free conical tube</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BS-100-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium 1640</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C11875500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Chemyx</td>
			<td>Fusion 101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 transcription Kit</td>
			<td>Jinan</td>
			<td>E131</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient transfection of in vitro transcribed mrna in cultured cells using peptide-poloxamine nanoparticles

أظهرت لقاحات الحمض النووي الريبي المرسال المنسوخة في المختبر إمكانات هائلة في مكافحة جائحة مرض فيروس كورونا 2019 (COVID-19). يجب تضمين أنظمة التسليم الفعالة والآمنة في لقاحات الحمض النووي الريبوزي المرسال بسبب الخصائص الهشة للحمض النووي الريبوزي المرسال. تم تصميم نظام توصيل الجينات النانوية الببتيد بولوكسامين (PP-sNp) ذاتي التجميع خصيصا للتوصيل الرئوي للأحماض النووية ويعرض قدرات واعدة في التوسط في نقل الحمض النووي الريبوزي المرسال الناجح. هنا ، يتم وصف طريقة محسنة لإعداد PP-sNp لتوضيح كيفية تغليف PP-sNp ل Metridia luciferase (MetLuc) mRNA ونقل الخلايا المستزرعة بنجاح. يتم الحصول على MetLuc-mRNA عن طريق عملية النسخ في المختبر من قالب الحمض النووي الخطي. يتم إنتاج PP-sNp عن طريق خلط الببتيد الاصطناعي / البولوكسامين مع محلول mRNA باستخدام خلاط microfluidic ، مما يسمح بالتجميع الذاتي ل PP-sNp. يتم تقييم شحنة PP-sNp لاحقا عن طريق قياس إمكانات زيتا. وفي الوقت نفسه ، يتم قياس التشتت المتعدد والحجم الهيدروديناميكي للجسيمات النانوية PP-sNp باستخدام تشتت الضوء الديناميكي. يتم نقل الجسيمات النانوية mRNA / PP-sNp إلى خلايا مستزرعة ، ويتم فحص المواد الفائقة من زراعة الخلايا لنشاط luciferase. تظهر النتائج التمثيلية قدرتها على النقل في المختبر. قد يلقي هذا البروتوكول الضوء على تطوير الجيل التالي من أنظمة توصيل لقاح الحمض النووي الريبوزي المرسال.

تم هضم البلازميد المؤتلف لإنتاج قالب الحمض النووي الخطي (الشكل 2A). باستخدام البروتوكول الموصوف ، يمكن لمجموعة النسخ T7 في المختبر إنتاج ما يصل إلى 80-120 ميكروغرام من MetLuc-mRNA غير المغطى لكل تفاعل 20 ميكرولتر و 50-60 ميكروغرام من MetLuc-mRNA المغطى لكل تفاعل 100 ميكرولتر. عند تحليلها ب...

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Transfection of In vitro Transcribed mRNA in Cultured Cells Using Peptide-Poloxamine Nanoparticles at JoVE.com

Efficient Transfection of In vitro Transcribed mRNA in Cultured Cells Using Peptide-Poloxamine Nanoparticles

تم تطوير جسيم نانوي من الببتيد والبولوكسامين ذاتي التجميع (PP-sNp) باستخدام جهاز خلط ميكروفلويديك لتغليف وتسليم الحمض النووي الريبي المرسال المنسوخ في المختبر . يمكن ل mRNA / PP-sNp الموصوف نقل الخلايا المستزرعة بكفاءة في المختبر.

النقل الفعال للحمض النووي الريبوزي المرسال المنسوخ في المختبر في الخلايا المستزرعة باستخدام جسيمات الببتيد والبولوكسامين النانوية

In vitro transcribed messenger RNA (mRNA) vaccines have displayed enormous potential in fighting against the coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic. ...

جسيمات الببتيد بولوكسامين النانوية هي واحدة من أنظمة توصيل الحمض النووي الريبوزي المرسال الرئوية المحتملة. يصنع بروتوكولنا جسيمات الببتيد بولوكسامين النانوية ذات إنتاجية وكفاءة أعلى ، مما يسهل تطوير لقاح الحمض النووي الريبوزي المرسال المخاطي. المواد التي تتطلبها هذه التقنية منخفضة التكلفة ، ويمكن إكمال البروتوكول في وقت قصير.تتمتع جسيمات الببتيد والبولوكسامين النانوية بالقدرة على التوسط في نقل الحمض النووي الريبوزي المرسال بكفاءة. أظهرت جسيمات الببتيد والبولوكسامين النانوية انتقالا ناجحا للحمض النووي الريبوزي المرسال في الخلايا الظهارية للشعب الهوائية البشرية، مما ينطوي على تطبيقات إضافية للقاحات كوفيد-19 المخاطية، وعلاج سرطانات الرئة، والعلاج الجيني للتليف الكيسي. أتوقع أن يكون لدى الفرد بعض المعرفة الأساسية في مجال ذي صلة ومع البروتوكول والكثير من التقنيات أيضا ، قبل أن يبدأ في إجراء التجارب.بعد توليف إطار القراءة المفتوح ل Metridia luciferase واستنساخه في متجه pUC57 ، قم بإعداد قالب حمض نووي خطي باستخدام BamHI و KpnI عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. قم بإعداد تفاعل بحجم 20 ميكرولتر لتوليف الحمض النووي الريبوزي المرسال باستخدام مجموعة نسخ T7 والسودو أوريدين كما هو موضح في المخطوطة. تخلط المكونات جيدا وتحضن عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات.ثم ، قم بإزالة البنية الثانوية ل 50 ميكروغرام من الحمض النووي الريبوزي المرسال IVT غير المغطى عن طريق تسخينه عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. استخدم نظام تغطية Cap 1 لسد الحمض النووي الريبوزي المرسال IVT ، وقم بإعداد Cap 1 عن طريق تعديل بنية غطاء 7-methylguanosine باستخدام S-adenosylmethionine و 2'O-methyltransferases عند 37 درجة مئوية لمدة 30 إلى 60 دقيقة. قم بقياس تركيز الحمض النووي الريبوزي المرسال IVT المغطى باستخدام مقياس الطيف الضوئي المرئي للأشعة فوق البنفسجية.باستخدام علامة الحمض النووي الريبي ، قم بتحليل الحجم الجزيئي ل IVT mRNA المغطى في هلام أغاروز 1٪ من الفورمالديهايد الذي يحتوي على 18٪ من الفورمالديهايد. تحضير 10 ملليغرام لكل ملليلتر محلول مخزون من البولوكسامين 704 عن طريق إذابة T704 في الماء الخالي من النوكليز. تحضير 2 ملليغرام لكل ملليلتر محلول مخزون من الببتيد عن طريق إذابة الببتيد في الماء الخالي من النوكليز.تخزين الحل المحضر في 4 درجات مئوية. إذابة الحمض النووي الريبوزي المرسال IVT على الجليد. قبل فتح الأنبوب ، قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 300 مرة G لمدة ثلاث ثوان في درجة حرارة الغرفة ، وقم بتخفيف محلول IVT mRNA بالماء الخالي من النوكليز.قم بإعداد محلول مزيج الببتيد T704 والببتيد الاصطناعي عن طريق تخفيف محلول T704 إلى ثمانية ميكروغرام لكل تركيز ميكرولتر ، ومحلول الببتيد الاصطناعي إلى 0.555 ميكروغرام لكل تركيز ميكرولتر ، مع ماء خال من النوكليز ، على التوالي. احتضن المحلول المختلط لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام مرة أخرى. اسحب محلول IVT mRNA إلى حقنة سعة ملليلتر واحد ، وتجنب فجوات الهواء أو الفقاعات في طرف المحقنة.قم بتحميل المحقنة في جانب واحد من الخرطوشة بجوار الكتلة الدوارة. ثم املأ حقنة سعة ملليلتر واحد بمحلول مزيج الببتيد الاصطناعي T704 وقم بإزالة أي فقاعات أو فجوات هوائية عند طرف المحقنة. ضع المحقنة في المدخل الآخر للمضخة ، واضبط المضخة بمعدل تدفق إجمالي يتراوح من 4 إلى 10 ملليلتر في الدقيقة.ضع أنبوبا مخروطيا خاليا من RNase سعة 10 ملليلتر لجمع محلول mRNA / PP-sNp المختلط IVT في نهاية مسار تدفق جهاز الخلط. قم بتشغيل المضخة لبدء الخلط ، مما يضمن إدخال المعلمات بشكل صحيح. بعد تشغيل المضخة لمدة ست ثوان ، اجمع عينة IVT mRNA / PP-sNp من الأنبوب المخروطي.صفيحة الخلايا الظهارية للشعب الهوائية البشرية وخط الخلايا المتغصنة في لوحات 96 بئر قبل 24 ساعة من النقل. تنمو الخلايا في وسط ثقافة مكمل بمصل بقري جنيني معطل حراريا بنسبة 10٪ و 1٪ ستربتومايسين البنسلين. بعد إزالة وسط النمو ، اغسل الخلايا المطلية ب 0.2 ملليلتر لكل بئر PBS.أضف 170 ميكرولتر من وسط الاستزراع الخالي من المصل إلى كل بئر يحتوي على مزارع الخلايا المطلية. ثم ، أضف 30 ميكرولتر من تركيبة IVT mRNA / PP-sNp التي تحتوي على 0.4 ميكروغرام من Metridia luciferase mRNA تسقط بحكمة في كل بئر. احتضن الخلايا بتركيبة IVT mRNA / PP-sNp في جو رطب غني بثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية لمدة أربع ساعات.استنشق وسط النقل وأضف 0.2 ملليلتر من وسط الثقافة الطازجة المكمل بمصل بقري جنيني معطل حراريا بنسبة 10٪ و 1٪ ستربتومايسين البنسلين. احتضان الخلايا المنقولة لمدة 24 ساعة كما هو موضح سابقا وجمع المواد الفائقة ليتم اكتشافها من كل بئر. قم بإعداد محلول فحص جديد عن طريق إضافة PBS إلى ركيزة coelenterazine.امزج المحلول جيدا عن طريق الدوامة لمدة 10 ثوان. أضف 50 ميكرولتر من السوبرناتانت التي تم جمعها إلى طبق من 96 بئرا. قم بإعداد قارئ microplate مع وقت قراءة يبلغ 1،000 مللي ثانية وإضافة 30 ميكرولتر من محلول coelenterazine إلى كل بئر يدويا أو عن طريق الحقن الآلي.مباشرة بعد إضافة محلول coelenterazine إلى supernatant ، انقر فوق Start (ابدأ) لقياس إشارة التلألؤ. تم عزل البلازميد المؤتلف وهضمه لإنتاج قالب الحمض النووي الخطي. أنتج النسخ في المختبر mRNA MetLuc ومتوجا.أظهرت الخلايا المنقولة باستخدام Metridia luciferase mRNA / PP-sNp تعبيرا أعلى بكثير عن luciferase مقارنة بتلك المنقولة باستخدام كاشف النقل القائم على الدهون المتاح تجاريا ، والببتيدات الاصطناعية Metridia luciferase mRNA أو PBS أو T7044 العارية ، والمحلول المختلط في الخلايا الظهارية للشعب الهوائية البشرية ، و 16 HBE ، وخط الخلايا المتغصنة DC2.4 Metridia luciferase mRNA / PP-sNp أظهر تعبير luciferase أعلى من LP.مما يشير إلى أن نظام توصيل PP-sNp مهم ل حماية الحمض النووي الريبوزي المرسال MetLuc من التدهور وتعزيز كفاءة نقل الحمض النووي الريبوزي المرسال (mRNA) من Metridia luciferase الخارجي. يرجى التأكد من إزالة الهيكل الاصطناعي ل Met-mRNA غير المغطى بنجاح. قم بحساب وتنزيل مركب Met-mRNA T704 والببتيد بعناية لإعداد وضغط جسيمات البولوكسامين النانوية.يمكن إجراء الفحص المجهري الإلكتروني الناقل لمراقبة مورفولوجيا جسيمات الببتيد والبولوكسامين النانوية. تساعد هذه التقنية الباحثين على تطوير لقاحات الحمض النووي الريبوزي المرسال المخاطي وتمكين الفحص عالي الإنتاجية لتركيبات العلاج الجيني لكل خلية ذات صلة.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Efficient Transfection of In vitro Transcribed mRNA in Cultured Cells Using Peptide-Poloxamine Nanoparticles

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

تنبيغ من فيروسات تي خلية المستقبلات في الخلايا التائية ماوس

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

الاستدلال الوراثي من HIV - 1 Tropism باستخدام السكان على أساس تسلسل V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Seven Steps to Stellate Cells

سبع خطوات لخلايا النجمية

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

بروتوكول الأمثل لترنسفكأيشن كفاءة الخلايا الجذعية من دون نضوج الخلايا

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

كمي<em&gt; في المختبر</em&gt; الفحص لقياس التصاق العدلات إلى تنشيط الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة الإنسان الأساسية بموجب الشروط ثابت

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

باستخدام نيون البروتينات إلى تصور وQuantitate<em&gt; الكلاميديا</em&gt; فجوة النمو حيوية في الخلايا الحية

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

القاتل مستضد تقديم الخلايا الاصطناعي (KaAPC) للكفاءة<em&gt; في المختبر</em&gt; استنفاد خلايا T الإنسان مستضد محددة

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

ترنسفكأيشن كفاءة عالية من الإنسان THP-1 الضامة بواسطة Nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

اشتقاق خلايا T<em&gt; في المختبر</em&gt; من الفأر الجنينية الخلايا الجذعية

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...