Name: efficient transfection of in vitro transcribed mrna in cultured cells using peptide-poloxamine nanoparticles
Uploaded: 2022-08-17T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Transfection of In vitro Transcribed mRNA in Cultured Cells Using Peptide-Poloxamine Nanoparticles at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (NSFC, Grant No. 82041045 and 82173764), het grote project van Study on Pathogenesis and Epidemic Prevention Technology System (2021YFC2302500) door het Ministerie van Wetenschap en Technologie van China, het Chongqing Talents: Exceptional Young Talents Project (CQYC202005027) en de Natural Science Foundation of Chongqing (cstc2021jcyj-msxmX0136). De auteurs zijn Dr. Xiaoyan Ding dankbaar voor het meten van de hydrodynamische diameter (nm) en polydispersiteitsindex (PDI).

1. In vitro transcriptie van chemisch gemodificeerd mRNA
OPMERKING: Het is vereist om nucleasevrije buizen, reagentia, glaswerk, pipetpunten, enz. Te gebruiken, omdat RNases alomtegenwoordig zijn in het milieu, zoals laboratoriumoplossingen, instrumentoppervlakken, haar, huid, stof, enz. Reinig de bankoppervlakken en pipetten grondig voor gebruik en draag handschoenen om RNase-besmetting te voorkomen.
<ol><li>Voer linearisatie van het DNA-sjabloon uit.<ol><li>Synthe...

<ol>
	<li>Nature milestones in vaccines. Springer Nature Available from: <a target="_blank" href="https://www.nature.com/collections/hcajdiajij">https://www.nature.com/collections/hcajdiajij</a> (2020)</li><li>Barbier, A. J., Jiang, A. Y., Zhang, P., Wooster, R., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+progress+of+mRNA+vaccines+and+immunotherapies.">The clinical progress of mRNA vaccines and immunotherapies.</a> Nature Biotechnology. 40 (6), 840-854 (2022).</li><li>Mulligan, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+I/II+study+of+COVID-19+RNA+vaccine+BNT162b1+in+adults.">Phase I/II study of COVID-19 RNA vaccine BNT162b1 in adults.</a> Nature. 586 (7830), 589-593 (2020).</li><li>Tang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotechnologies+in+delivery+of+DNA+and+mRNA+vaccines+to+the+nasal+and+pulmonary+mucosa.">Nanotechnologies in delivery of DNA and mRNA vaccines to the nasal and pulmonary mucosa.</a> Nanomaterials. 12 (2), 226 (2022).</li><li>Freyn, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multi-targeting,+nucleoside-modified+mRNA+influenza+virus+vaccine+provides+broad+protection+in+mice.">A multi-targeting, nucleoside-modified mRNA influenza virus vaccine provides broad protection in mice.</a> Molecular Therapy. 28 (7), 1569-1584 (2020).</li><li>Wu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variant+SARS-CoV-2+mRNA+vaccines+confer+broad+neutralization+as+primary+or+booster+series+in+mice.">Variant SARS-CoV-2 mRNA vaccines confer broad neutralization as primary or booster series in mice.</a> Vaccine. 39 (51), 7394-7400 (2021).</li><li>Chaudhary, N., Weissman, D., Whitehead, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+vaccines+for+infectious+diseases:+Principles,+delivery+and+clinical+translation.">mRNA vaccines for infectious diseases: Principles, delivery and clinical translation.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 20, 817-838 (2021).</li><li>Kormann, M. S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+therapeutic+proteins+after+delivery+of+chemically+modified+mRNA+in+mice.">Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice.</a> Nature Biotechnology. 29 (2), 154-157 (2011).</li><li>Tavernier, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+as+gene+therapeutic:+How+to+control+protein+expression.">mRNA as gene therapeutic: How to control protein expression.</a> Journal of Controlled Release. 150 (3), 238-247 (2011).</li><li>Walsh, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+immunogenicity+of+two+RNA-based+Covid-19+vaccine+candidates.">Safety and immunogenicity of two RNA-based Covid-19 vaccine candidates.</a> The New England Journal of Medicine. 383 (25), 2439-2450 (2020).</li><li>Baden, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+safety+of+the+mRNA-1273+SARS-CoV-2+vaccine.">Efficacy and safety of the mRNA-1273 SARS-CoV-2 vaccine.</a> The New England Journal of Medicine. 384 (5), 403-416 (2021).</li><li>Guan, S., Rosenecker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotechnologies+in+delivery+of+mRNA+therapeutics+using+nonviral+vector-based+delivery+systems.">Nanotechnologies in delivery of mRNA therapeutics using nonviral vector-based delivery systems.</a> Gene Therapy. 24 (3), 133-143 (2017).</li><li>Sharova, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Database+for+mRNA+half-life+of+19+977+genes+obtained+by+DNA+microarray+analysis+of+pluripotent+and+differentiating+mouse+embryonic+stem+cells.">Database for mRNA half-life of 19 977 genes obtained by DNA microarray analysis of pluripotent and differentiating mouse embryonic stem cells.</a> DNA Research. 16 (1), 45-58 (2009).</li><li>Houseley, J., Tollervey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+many+pathways+of+RNA+degradation.">The many pathways of RNA degradation.</a> Cell. 136 (4), 763-776 (2009).</li><li>Kowalski, P. S., Rudra, A., Miao, L., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivering+the+messenger:+Advances+in+technologies+for+therapeutic+mRNA+delivery.">Delivering the messenger: Advances in technologies for therapeutic mRNA delivery.</a> Molecular Therapy. 27 (4), 710-728 (2019).</li><li>Sahin, U., Karik&#243;, K., T&#252;reci, &. #. 2. 1. 4. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MRNA-based+therapeutics-developing+a+new+class+of+drugs.">MRNA-based therapeutics-developing a new class of drugs.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 13, 359-380 (2014).</li><li>Hajj, K. A., Whitehead, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+translation:+Non-viral+materials+for+therapeutic+mRNA+delivery.">Tools for translation: Non-viral materials for therapeutic mRNA delivery.</a> Nature Reviews Materials. 2, 17056 (2017).</li><li>Deering, R. P., Kommareddy, S., Ulmer, J. B., Brito, L. A., Geall, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+acid+vaccines:+Prospects+for+non-viral+delivery+of+mRNA+vaccines.">Nucleic acid vaccines: Prospects for non-viral delivery of mRNA vaccines.</a> Expert Opinion on Drug Delivery. 11 (6), 885-899 (2014).</li><li>Wadhwa, A., Aljabbari, A., Lokras, A., Foged, C., Thakur, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opportunities+and+challenges+in+the+delivery+of+mRNA-based+vaccines.">Opportunities and challenges in the delivery of mRNA-based vaccines.</a> Pharmaceutics. 12 (2), 102 (2020).</li><li>Hou, X., Zaks, T., Langer, R., Dong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+nanoparticles+for+mRNA+delivery.">Lipid nanoparticles for mRNA delivery.</a> Nature Reviews Materials. 6 (12), 1078-1094 (2021).</li><li>Sahin, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COVID-19+vaccine+BNT162b1+elicits+human+antibody+and+T(H)1+T+cell+responses.">COVID-19 vaccine BNT162b1 elicits human antibody and T(H)1 T cell responses.</a> Nature. 586 (7830), 594-599 (2020).</li><li>Azzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+immune+response+in+BNT162b2+COVID-19+vaccine+recipients.">Mucosal immune response in BNT162b2 COVID-19 vaccine recipients.</a> EBioMedicine. 75, 103788 (2022).</li><li>Guan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+peptide-poloxamine+nanoparticles+enable+in+vitro+and+in+vivo+genome+restoration+for+cystic+fibrosis.">Self-assembled peptide-poloxamine nanoparticles enable in vitro and in vivo genome restoration for cystic fibrosis.</a> Nature Nanotechnology. 14 (3), 287-297 (2019).</li><li>Pitard, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negatively+charged+self-assembling+DNA/poloxamine+nanospheres+for+in+vivo+gene+transfer.">Negatively charged self-assembling DNA/poloxamine nanospheres for in vivo gene transfer.</a> Nucleic Acids Research. 32 (20), 159 (2004).</li><li>Hiroi, T., Shibayama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+particle+size+distribution+in+turbid+solutions+by+dynamic+light+scattering+microscopy.">Measurement of particle size distribution in turbid solutions by dynamic light scattering microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), e54885 (2017).</li><li>Hassett, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+lipid+nanoparticle+size+on+mRNA+vaccine+immunogenicity.">Impact of lipid nanoparticle size on mRNA vaccine immunogenicity.</a> Journal of Controlled Release. 335, 237-246 (2021).</li><li>Suk, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+penetration+of+fresh+undiluted+sputum+expectorated+by+cystic+fibrosis+patients+by+non-adhesive+polymer+nanoparticles.">The penetration of fresh undiluted sputum expectorated by cystic fibrosis patients by non-adhesive polymer nanoparticles.</a> Biomaterials. 30 (13), 2591-2597 (2009).</li><li>Kim, N., Duncan, G. A., Hanes, J., Suk, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barriers+to+inhaled+gene+therapy+of+obstructive+lung+diseases:+A+review.">Barriers to inhaled gene therapy of obstructive lung diseases: A review.</a> Journal of Controlled Release. 240, 465-488 (2016).</li><li>Liu, Z., Fontana, F., Python, A., Hirvonen, J. T., Santos, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+production+of+particles:+Mechanism,+methodology,+and+applications.">Microfluidics for production of particles: Mechanism, methodology, and applications.</a> Small. 16 (9), 1904673 (2020).</li><li>Guan, S., Darmst&#228;dter, M., Xu, C., Rosenecker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+investigations+on+optimizing+and+nebulization+of+IVT-mRNA+formulations+for+potential+pulmonary-based+alpha-1-antitrypsin+deficiency+treatment.">In vitro investigations on optimizing and nebulization of IVT-mRNA formulations for potential pulmonary-based alpha-1-antitrypsin deficiency treatment.</a> Pharmaceutics. 13 (8), 1281 (2021).</li><li>Shepherd, S. J., Issadore, D., Mitchell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+formulation+of+nanoparticles+for+biomedical+applications.">Microfluidic formulation of nanoparticles for biomedical applications.</a> Biomaterials. 274, 120826 (2021).</li><li>Han, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+confined+impingement+jets+mixer+for+flash+nanoprecipitation.">A simple confined impingement jets mixer for flash nanoprecipitation.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 101 (10), 4018-4023 (2012).</li></ol>

Het hier beschreven protocol maakt niet alleen de kosteneffectieve en snelle productie van IVT-mRNA-vaccinformuleringen met gedefinieerde eigenschappen mogelijk, maar biedt ook de mogelijkheid om de PP-sNp-formulering aan te passen aan specifieke therapeutische doeleinden, zoals gentherapie. Om de succesvolle generatie van IVT-mRNA/PP-sNp te garanderen, wordt voorgesteld om extra aandacht te besteden aan enkele kritieke stappen. Wanneer u met mRNA werkt, moet u altijd onthouden dat RNase-vrije omstandigheden gedurende he...

Vaccinatie is aangekondigd als een van de meest efficiënte medische interventies voor het verminderen van de morbiditeit en mortaliteit veroorzaakt door infectieziekten1. Het belang van vaccins is aangetoond sinds de uitbraak van coronavirusziekte 2019 (COVID-19). In tegenstelling tot het traditionele concept van het injecteren van geïnactiveerde of levend verzwakte pathogenen, concentreren state-of-the-art vaccinbenaderingen, zoals vaccins op basis van nucleïnezuur, zich op het behoud van de immuunstimulerende eigenschappen van de doelpathogenen, terwijl de potentiële veiligheidsproblemen in verband met het conventionele geheel-microbiële virus- of in op bacteriën gebaseerde vaccins worden vermeden. Zowel DNA- als RNA (d.w.z. in vitro getranscribeerd boodschapper-RNA, IVT-mRNA) -gebaseerde vaccins vertonen profylactisch tot therapeutisch potentieel tegen een verscheidenheid aan ziekten, waaronder infectieziekten en kankers 2,3. In principe heeft het potentieel van op nucleïnezuur gebaseerde vaccins betrekking op hun productie, werkzaamheid en veiligheid4. Deze vaccins kunnen op een celvrije manier worden vervaardigd om kosteneffectieve, schaalbare en snelle productie mogelijk te maken.
Een enkel vaccin op basis van nucleïnezuur kan coderen voor meerdere antigenen, waardoor het doelwit van talrijke virale varianten of bacteriën met een verminderd aantal inentingen mogelijk wordt en de immuunrespons tegen veerkrachtige pathogenen wordt versterkt 5,6. Bovendien kunnen op nucleïnezuur gebaseerde vaccins het natuurlijke invasieproces van virus- of bacteriële infectie nabootsen, waardoor zowel B-cel- als T-celgemedieerde immuunresponsen worden gebracht. In tegenstelling tot sommige virus- of DNA-gebaseerde vaccins, bieden IVT-mRNA-gebaseerde vaccins een enorm voordeel in termen van veiligheid. Ze kunnen snel het gewenste antigeen in het cytosol tot expressie brengen en zijn niet geïntegreerd in het gastheergenoom, waardoor zorgen over insertionele mutageneseworden weggenomen 7. IVT-mRNA wordt automatisch afgebroken na succesvolle translatie, zodat de kinetiek van de eiwitexpressie gemakkelijk kan worden gecontroleerd 8,9. Gekatalyseerd door de pandemie van het severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2), hebben inspanningen van bedrijven / instellingen over de hele wereld de introductie van vele soorten vaccins op de markt mogelijk gemaakt. Ivt-mRNA-gebaseerde vaccintechnologie toont een groot potentieel en heeft voor het eerst zijn eerder verwachte succes aangetoond, dankzij het snelle ontwerp en het flexibele vermogen om zich binnen enkele maanden aan te passen aan doelantigenen. Het succes van IVT-mRNA-vaccins tegen COVID-19 in klinische toepassingen opende niet alleen een nieuw tijdperk van onderzoek en ontwikkeling van IVT-mRNA-vaccins, maar heeft ook waardevolle ervaring opgedaan voor de snelle ontwikkeling van effectieve vaccins voor het omgaan met uitbraken van infectieziekten10,11.
Ondanks het veelbelovende potentieel van IVT-mRNA-vaccins, blijft de efficiënte intracellulaire afgifte van IVT-mRNA op de plaats van actie (d.w.z. cytoplasma) een belangrijke hindernis vormen12, vooral voor degenen die via de luchtwegen worden toegediend4. IVT-mRNA is inherent een onstabiel molecuul met een extreem korte halfwaardetijd (~ 7 h)13, waardoor IVT-mRNA zeer gevoelig is voor afbraak door het alomtegenwoordige RNase14. De lymfocyten van het aangeboren immuunsysteem hebben de neiging om het erkende IVT-mRNA te verzwelgen in gevallen van in vivo toepassing. Bovendien schaden de hoge negatieve ladingsdichtheid en het grote molecuulgewicht (1 x 104-1 x 106 Da) van IVT-mRNA de effectieve permeatie ervan over de anionische lipide-bilaag van cellulaire membranen15. Daarom is een afgiftesysteem met bepaalde bio-functionele materialen nodig om de afbraak van de IVT-mRNA-moleculen te remmen en cellulaire opnamete vergemakkelijken 16.
Afgezien van een paar uitzonderlijke gevallen waarin naakt IVT-mRNA direct werd gebruikt voor in vivo onderzoek, worden verschillende toedieningssystemen gebruikt om IVT-mRNA naar de therapeutische plaats van actie te brengen17,18. Eerdere studies hebben aangetoond dat slechts enkele IVT mRNA's worden gedetecteerd in cytosol zonder de hulp van een toedieningssysteem19. Er zijn talloze strategieën ontwikkeld om de RNA-afgifte te verbeteren met voortdurende inspanningen in het veld, variërend van protaminecondensatie tot lipideninkapseling20. Lipide nanodeeltjes (LNP's) zijn de meest klinisch geavanceerde onder de mRNA-toedieningsvoertuigen, zoals blijkt uit het feit dat alle goedgekeurde mRNA COVID-19-vaccins voor klinisch gebruik gebruik maken van op LNP gebaseerde toedieningssystemen21. LNP's kunnen echter geen effectieve mRNA-transfectie bemiddelen wanneer de formuleringen worden toegediend via de ademhalingsroute22, wat de toepassing van deze formuleringen opmerkelijk beperkt bij het induceren van mucosale immuunresponsen of het aanpakken van longgerelateerde ziekten zoals cystische fibrose of α1-antitrypsinedeficiëntie. Daarom is het ontwikkelen van een nieuw toedieningssysteem nodig om de efficiënte levering en transfectie van IVT-mRNA in luchtweggerelateerde cellen te vergemakkelijken om deze onvervulde behoefte op te lossen.
Het is bevestigd dat het peptide-poloxamine zelfgeassembleerde nanodeeltjes (PP-sNp) afgiftesysteem de efficiënte transfectie van nucleïnezuren in de luchtwegen van muizen kan bemiddelen23. De PP-sNp hanteert een multifunctionele modulaire ontwerpbenadering, die verschillende functionele modules in de nanodeeltjes kan integreren voor snelle screening en optimalisatie23. De synthetische peptiden en elektrisch neutrale amfifiele blokcopolymeren (poloxamine) in de PP-sNp kunnen spontaan interageren met IVT-mRNA om uniform verdeelde nanodeeltjes te genereren met een compacte structuur en een glad oppervlak23. PP-sNp kan het gentransfectie-effect van IVT-mRNA-moleculen in gekweekte cellen en de luchtwegen van muizen verbeteren23. De huidige studie beschrijft een protocol voor het genereren van PP-sNp bevattend IVT-mRNA dat codeert voor Metridia luciferase (MetLuc-mRNA) (Figuur 1). Gecontroleerd en snel mengen via een microfluïdisch mengapparaat, dat gebruik maakt van het gespreide visgraatmengontwerp, wordt in dit protocol gebruikt. De procedure is eenvoudig uit te voeren en maakt het genereren van PP-sNp met meer uniforme maten mogelijk. Het algemene doel van PP-sNp-productie met behulp van de microfluïdische mixer is om PP-sNp voor mRNA-complexatie op een goed gecontroleerde manier te creëren, waardoor efficiënte en reproduceerbare celtransfectie in vitro mogelijk is. Het huidige protocol beschrijft de voorbereiding, assemblage en karakterisering van PP-sNp met MetLuc-mRNA.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BamHI</td>
			<td>Takara</td>
			<td>1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cap 1 capping system</td>
			<td>Jinan</td>
			<td>M082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dendritic cell-line</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SCC142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA sequence</td>
			<td>Genescript</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human bronchial epithelial cells</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SCC150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KpnI</td>
			<td>Takara</td>
			<td>1068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LP</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium chloride</td>
			<td>APEXBio</td>
			<td>B6083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malvern Zetasizer Nano ZS90</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>NB007605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic chip</td>
			<td>ZHONGXINQIHENG</td>
			<td>Standard PDMS chip</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate readers</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Varioskan lux</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>ND-ONE-W (A30221)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudouridine</td>
			<td>APE&#215;Bio</td>
			<td>B7972</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quanti-Luc</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>Rep-qlc2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RiboRuler High Range RNA Ladder</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>SM1821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free conical tube</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BS-100-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium 1640</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C11875500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Chemyx</td>
			<td>Fusion 101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 transcription Kit</td>
			<td>Jinan</td>
			<td>E131</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient transfection of in vitro transcribed mrna in cultured cells using peptide-poloxamine nanoparticles

In vitro getranscribeerde messenger RNA (mRNA) vaccins hebben een enorm potentieel getoond in de strijd tegen de coronavirusziekte 2019 (COVID-19) pandemie. Efficiënte en veilige toedieningssystemen moeten worden opgenomen in de mRNA-vaccins vanwege de fragiele eigenschappen van mRNA. Een zelfgeassembleerd peptide-poloxamine nanodeeltje (PP-sNp) genafgiftesysteem is specifiek ontworpen voor de pulmonale afgifte van nucleïnezuren en vertoont veelbelovende mogelijkheden bij het bemiddelen van succesvolle mRNA-transfectie. Hier wordt een verbeterde methode voor het bereiden van PP-sNp beschreven om uit te werken hoe de PP-sNp Metridia luciferase (MetLuc) mRNA inkapselt en met succes gekweekte cellen transfecteert. MetLuc-mRNA wordt verkregen door een in vitro transcriptieproces van een lineair DNA-sjabloon. Een PP-sNp wordt geproduceerd door synthetische peptide/poloxamine te mengen met mRNA-oplossing met behulp van een microfluïdische mixer, waardoor de zelfassemblage van PP-sNp mogelijk is. De lading van PP-sNp wordt vervolgens geëvalueerd door het zetapotentiaal te meten. Ondertussen worden de polydispersiteit en hydrodynamische grootte van PP-sNp nanodeeltjes gemeten met behulp van dynamische lichtverstrooiing. De mRNA/PP-sNp nanodeeltjes worden getransfecteerd in gekweekte cellen en supernatanten uit de celcultuur worden getest op luciferase-activiteit. De representatieve resultaten tonen hun vermogen tot in vitro transfectie aan. Dit protocol kan licht werpen op de ontwikkeling van mRNA-vaccinafgiftesystemen van de volgende generatie.

Het recombinante plasmide werd verteerd om het gelineariseerde DNA-sjabloon te produceren (figuur 2A). Met behulp van het beschreven protocol kan de T7 in vitro transcriptiekit tot 80-120 μg ongecapituleerd MetLuc-mRNA per 20 μL-reactie en 50-60 μg afgetopt MetLuc-mRNA per 100 μL-reactie produceren. Bij analyse met elektroforese moet intact MetLuc-mRNA met hoge kwaliteit een enkele en duidelijke band vertonen, zoals weergegeven in figuur 2B. Verontr...

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Transfection of In vitro Transcribed mRNA in Cultured Cells Using Peptide-Poloxamine Nanoparticles at JoVE.com

Efficient Transfection of In vitro Transcribed mRNA in Cultured Cells Using Peptide-Poloxamine Nanoparticles

Een zelfgeassembleerd peptide-poloxamine nanodeeltje (PP-sNp) wordt ontwikkeld met behulp van een microfluïdisch mengapparaat om in vitro getranscribeerd boodschapper-RNA in te kapselen en af te leveren. Het beschreven mRNA/PP-sNp kon in vitro efficiënt gekweekte cellen transfecteren.

Efficiënte transfectie van in vitro getranscribeerd mRNA in gekweekte cellen met behulp van peptide-poloxamine nanodeeltjes

In vitro transcribed messenger RNA (mRNA) vaccines have displayed enormous potential in fighting against the coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic. ...

Peptide-poloxamine nanodeeltjes is een van de potentiële pulmonale mRNA-afgiftesystemen. Ons protocol maakt de peptide-poloxamine nanodeeltjes met een hogere productiviteit en efficiëntie, wat de ontwikkeling van het mucosale mRNA-vaccin vergemakkelijkt. De materialen die nodig zijn voor de techniek zijn goedkoop en het protocol kan in korte tijd worden voltooid.De peptide-poloxamine nanodeeltjes hebben het vermogen om efficiënte mRNA-transfectie te bemiddelen. Peptide-poloxamine nanodeeltjes vertoonden succesvolle mRNA-transfectie in menselijke bronchiale epitheelcellen, wat extra toepassingen impliceert voor mucosale COVID-19-vaccins, behandeling van longkanker en cystic fibrosis-gentherapie. Ik verwacht dat het individu enige basiskennis heeft op een gerelateerd gebied en met het protocol en veel van de technieken, voordat hij of zij de experimenten begint uit te voeren.Nadat u het open leesframe van Metridia luciferase hebt gesynthetiseerd en in de pUC57-vector hebt gekloond, bereidt u een gelineariseerd DNA-sjabloon voor met BamHI en KpnI bij 37 graden Celsius gedurende een uur. Bereid een reactie van 20-microliter volume voor mRNA-synthese voor met behulp van een T7-transcriptiekit en pseudouridine zoals beschreven in het manuscript. Meng de componenten grondig en incubeer drie uur bij 37 graden Celsius.Verwijder vervolgens de secundaire structuur van 50 microgram ongecapituleerd IVT-mRNA door het gedurende 10 minuten op 65 graden Celsius te verwarmen. Gebruik het Cap 1-afdeksysteem voor de IVT-mRNA-aftopping en bereid Cap 1 voor door de 7-methylguanosine-dopstructuur gedurende 30 tot 60 minuten te wijzigen met behulp van S-adenosylmethionine en 2'O-methyltransferases bij 37 graden Celsius. Meet de concentratie van afgedekt IVT-mRNA met een UV-zichtbare spectrofotometer.Analyseer met behulp van een RNA-marker de moleculaire grootte van afgetopt IVT-mRNA in een 1% formaldehyde denaturerende agarose-gel die 18% formaldehyde bevat. Bereid 10 milligram per milliliter stamoplossing van poloxamine 704 door de T704 op te lossen in nucleasevrij water. Bereid 2 milligram per milliliter stamoplossing van het peptide door het peptide op te lossen in nucleasevrij water.Bewaar de bereide oplossing bij 4 graden Celsius. Ontdooi het IVT-mRNA op ijs. Voordat u de buis opent, centrifugeert u de buis op 300 keer G gedurende drie seconden bij kamertemperatuur en verdunt u de IVT-mRNA-oplossing met nucleasevrij water.Bereid T704 en synthetische peptidemixoplossing door de T704-oplossing te verdunnen tot acht microgram per microliterconcentratie en de synthetische peptideoplossing tot 0,555 microgram per microliterconcentratie, met respectievelijk nucleasevrij water. Incubeer de gemengde oplossing gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur voor verder gebruik. Zuig de IVT-mRNA-oplossing in een spuit van één milliliter en vermijd luchtspleten of bellen in de punt van de spuit.Plaats de spuit in één zijde van de patroon naast het roterende blok. Vul vervolgens een spuit van één milliliter met T704 en synthetische peptidemixoplossing en verwijder eventuele bellen of luchtspleten aan de punt van de spuit. Plaats de spuit in de andere inlaat van de pomp en stel de pomp in met een totaal debiet van 4 tot 10 milliliter per minuut.Plaats een tien milliliter RNase-vrije conische buis om de gemengde IVT-mRNA/PP-sNp-oplossing aan het einde van het stroompad van het mengapparaat te verzamelen. Laat de pomp draaien om het mengen te starten en zorg ervoor dat de parameters correct worden ingevoerd. Nadat u de pomp zes seconden hebt laten draaien, verzamelt u het IVT-mRNA/PP-sNp-monster uit de conische buis.Plaat menselijke bronchiale epitheelcellen en een dendritische cellijn in 96-well platen 24 uur vóór transfectie. Kweek de cellen in een kweekmedium aangevuld met 10% warmte-geïnactiveerd foetaal runderserum en 1% penicilline streptomycine. Was na het verwijderen van het groeimedium de vergulde cellen met 0,2 milliliter per put PBS.Voeg 170 microliter serumvrij kweekmedium toe aan elke put die de vergulde celculturen bevat. Voeg vervolgens 30 microliter IVT-mRNA / PP-sNp-formulering toe die 0,4 microgram Metridia luciferase-mRNA druppelsgewijs in elke put bevat. Incubeer de cellen met de IVT mRNA/ PP-sNp formulering in een bevochtigde 5% koolstofdioxide-verrijkte atmosfeer bij 37 graden Celsius gedurende vier uur.Aspirateer het transfectiemedium en voeg 0,2 milliliter vers kweekmedium toe, aangevuld met 10% hitte-geïnactiveerd foetaal runderserum en 1% penicilline streptomycine. Incubeer de getransfecteerde cellen gedurende 24 uur zoals eerder aangetoond en verzamel de supernatanten die uit elke put moeten worden gedetecteerd. Bereid een verse testoplossing door PBS toe te voegen aan het coelenterazinesubstraat.Meng de oplossing grondig door gedurende 10 seconden te vortexen. Voeg 50 microliter van het verzamelde supernatant toe aan een plaat met 96 putten. Stel de microplaatlezer in met een leestijd van 1.000 milliseconden en voeg handmatig of via geautomatiseerde injectie 30 microliter coelenterazine-oplossing toe aan elke put.Direct na het toevoegen van de coelenterazine-oplossing aan het supernatant, klikt u op Start om het luminescentiesignaal te meten. Het recombinante plasmide werd geïsoleerd en verteerd om het gelineariseerde DNA-sjabloon te produceren. De in vitro transcriptie produceerde upcapped en capped MetLuc mRNA.Cellen getransfecteerd met Metridia luciferase mRNA/PP-sNp vertoonden een significant hogere expressie van luciferase in vergelijking met die getransfecteerd met commercieel beschikbare lipide-gebaseerde transfectiereagens, naakt Metridia luciferase mRNA, PBS of T7044 synthetische peptiden, gemengde oplossing in menselijke bronchiale epitheelcellen, 16 HBE en dendritische cellijn DC2.4 Metridia luciferase mRNA / PP-sNp vertoonde een hogere luciferase-expressie dan LP.wat suggereert dat het PP-sNp-afgiftesysteem belangrijk is voor het beschermen van het MetLuc mRNA tegen afbraak en voor het bevorderen van de transfectie-efficiëntie van het exogene Metridia luciferase mRNA. Zorg ervoor dat de synthetische structuur van ongecapped Met-mRNA met succes is verwijderd. Bereken en download de Met-mRNA T704 en peptideverbinding zorgvuldig om de poloxamine nanodeeltjes voor te bereiden en te verdichten.Transmissie-elektronenmicroscopie kan worden uitgevoerd om de morfologie van peptide-poloxamine nanodeeltjes te observeren. Deze techniek helpt onderzoekers om mucosale mRNA-vaccins te ontwikkelen en high-throughput screening van gentherapieformuleringen voor elke gerelateerde cel mogelijk te maken.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Efficient Transfection of In vitro Transcribed mRNA in Cultured Cells Using Peptide-Poloxamine Nanoparticles

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Retrovirale Transductie van T-cel-receptoren in Mouse T-cellen

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Genotypische Inferentie van HIV-1 tropisme de populatie-gebaseerde Sequencing van V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Seven Steps to Stellate Cells

Zeven Stappen naar cellen stellatum

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

Geoptimaliseerd protocol voor Efficiënte Transfectie van dendritische cellen zonder Cell Rijping

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Kwantitatief<em&gt; In vitro</em&gt; Assay om neutrofieladhesie Maatregel om Activated primaire humane microvasculaire endotheelcellen onder statische omstandigheden

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Met behulp van fluorescerende eiwitten te visualiseren en te kwantificeren<em&gt; Chlamydia</em&gt; Vacuole groeidynamiek in levende cellen

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial antigeen presenterende cellen (KaAPC) voor Efficient<em&gt; In Vitro</em&gt; Uitputting van Human Antigeen-specifieke T-cellen

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Zeer efficiënte transfectie van Human THP-1 macrofagen door Nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Afleiding van T cellen<em&gt; In Vitro</em&gt; Van muis embryonale stamcellen

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...