Name: efficient transfection of in vitro transcribed mrna in cultured cells using peptide-poloxamine nanoparticles
Uploaded: 2022-08-17T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Transfection of In vitro Transcribed mRNA in Cultured Cells Using Peptide-Poloxamine Nanoparticles at JoVE.com

Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (NSFC, Grant No. 82041045 and 82173764), dem Großprojekt Study on Pathogenesis and Epidemic Prevention Technology System (2021YFC2302500) des chinesischen Ministeriums für Wissenschaft und Technologie, dem Chongqing Talents: Exceptional Young Talents Project (CQYC202005027) und der Natural Science Foundation of Chongqing (cstc2021jcyj-msxmX0136) unterstützt. Die Autoren danken Dr. Xiaoyan Ding für die Messung des hydrodynamischen Durchmessers (nm) und des Polydispersitätsindex (PDI).

1. In-vitro-Transkription chemisch modifizierter mRNA
HINWEIS: Es ist erforderlich, nukleasefreie Röhrchen, Reagenzien, Glaswaren, Pipettenspitzen usw. zu verwenden, da RNasen in der Umwelt allgegenwärtig sind, wie Laborlösungen, Instrumentenoberflächen, Haare, Haut, Staub usw. Reinigen Sie die Tischoberflächen und Pipetten vor Gebrauch gründlich und tragen Sie Handschuhe, um eine RNase-Kontamination zu vermeiden.
<ol><li>Führen Sie eine Linearisierung der DN...

<ol>
	<li>Nature milestones in vaccines. Springer Nature Available from: <a target="_blank" href="https://www.nature.com/collections/hcajdiajij">https://www.nature.com/collections/hcajdiajij</a> (2020)</li><li>Barbier, A. J., Jiang, A. Y., Zhang, P., Wooster, R., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+progress+of+mRNA+vaccines+and+immunotherapies.">The clinical progress of mRNA vaccines and immunotherapies.</a> Nature Biotechnology. 40 (6), 840-854 (2022).</li><li>Mulligan, M. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+formulation+of+nanoparticles+for+biomedical+applications.">Microfluidic formulation of nanoparticles for biomedical applications.</a> Biomaterials. 274, 120826 (2021).</li><li>Han, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+confined+impingement+jets+mixer+for+flash+nanoprecipitation.">A simple confined impingement jets mixer for flash nanoprecipitation.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 101 (10), 4018-4023 (2012).</li></ol>

Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht nicht nur die kostengünstige und schnelle Herstellung von IVT-mRNA-Impfstoffformulierungen mit definierten Eigenschaften, sondern bietet auch die Möglichkeit, die PP-sNp-Formulierung an spezifische therapeutische Zwecke, wie z.B. Gentherapie, anzupassen. Um die erfolgreiche Generierung von IVT mRNA/PP-sNp zu gewährleisten, wird empfohlen, einige kritische Schritte besonders zu beachten. Denken Sie bei der Arbeit mit mRNA immer daran, dass RNase-freie Bedingungen während des...

Die Impfung gilt als eine der effizientesten medizinischen Maßnahmen zur Verringerung der Morbidität und Mortalität durch Infektionskrankheiten1. Die Bedeutung von Impfstoffen zeigt sich seit dem Ausbruch der Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19). Im Gegensatz zum traditionellen Konzept der Injektion inaktivierter oder lebend attenuierter Krankheitserreger konzentrieren sich moderne Impfstoffansätze, wie z. B. Impfstoffe auf Nukleinsäurebasis, darauf, die immunstimulierenden Eigenschaften der Zielpathogene zu erhalten und gleichzeitig die potenziellen Sicherheitsprobleme zu vermeiden, die mit den herkömmlichen ganzmikrobiellen Virus- oder bakterienbasierten Impfstoffen verbunden sind. Sowohl DNA- als auch RNA-Impfstoffe (d. h. in vitro transkribierte Boten-RNA, IVT mRNA) weisen ein prophylaktisches bis therapeutisches Potenzial gegen eine Vielzahl von Krankheiten, einschließlich Infektionskrankheiten undKrebs, auf 2,3. Grundsätzlich bezieht sich das Potenzial von Impfstoffen auf Nukleinsäurebasis auf ihre Herstellung, Wirksamkeit und Sicherheit4. Diese Impfstoffe können zellfrei hergestellt werden, um eine kostengünstige, skalierbare und schnelle Produktion zu ermöglichen.
Ein einziger Impfstoff auf Nukleinsäurebasis kann mehrere Antigene kodieren, was das Ziel zahlreicher viraler Varianten oder Bakterien mit einer reduzierten Anzahl von Impfungen ermöglicht und die Immunantwort gegen resistente Krankheitserreger stärkt 5,6. Außerdem könnten Impfstoffe auf Nukleinsäurebasis den natürlichen Invasionsprozess von Virus- oder Bakterieninfektionen nachahmen und sowohl B-Zell- als auch T-Zell-vermittelte Immunantworten hervorrufen. Im Gegensatz zu einigen virus- oder DNA-basierten Impfstoffen bieten IVT-mRNA-basierte Impfstoffe einen großen Sicherheitsvorteil. Sie können das gewünschte Antigen schnell im Zytosol exprimieren und sind nicht in das Wirtsgenom integriert, was Bedenken hinsichtlich der Insertionsmutagenese beseitigt7. IVT-mRNA wird nach erfolgreicher Translation automatisch abgebaut, so dass ihre Proteinexpressionskinetik leicht kontrolliert werden kann 8,9. Katalysiert durch die Pandemie des schweren akuten respiratorischen Syndroms Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) haben die Bemühungen von Unternehmen / Institutionen weltweit die Markteinführung vieler Arten von Impfstoffen ermöglicht. Die IVT-mRNA-basierte Impfstofftechnologie zeigt großes Potenzial und hat zum ersten Mal ihren zuvor erwarteten Erfolg gezeigt, da sie schnell entwickelt und flexibel in der Lage ist, sich innerhalb weniger Monate an beliebige Zielantigene anzupassen. Der Erfolg von IVT-mRNA-Impfstoffen gegen COVID-19 in klinischen Anwendungen eröffnete nicht nur eine neue Ära der Forschung und Entwicklung von IVT-mRNA-Impfstoffen, sondern sammelte auch wertvolle Erfahrungen für die schnelle Entwicklung wirksamer Impfstoffe zur Behandlung von Ausbrüchen von Infektionskrankheiten10,11.
Trotz des vielversprechenden Potenzials von IVT-mRNA-Impfstoffen stellt die effiziente intrazelluläre Abgabe von IVT-mRNA an den Wirkort (d. h. Zytoplasma) weiterhin eine große Hürdedar 12, insbesondere für diejenigen, die über die Atemwege verabreichtwerden 4. IVT mRNA ist von Natur aus ein instabiles Molekül mit einer extrem kurzen Halbwertszeit (~7 h)13, was IVT mRNA sehr anfällig für den Abbau durch die ubiquitäre RNase14 macht. Die Lymphozyten des angeborenen Immunsystems neigen dazu, die anerkannte IVT-mRNA in Fällen der in vivo-Anwendung zu verschlingen. Darüber hinaus beeinträchtigen die hohe negative Ladungsdichte und das große Molekulargewicht (1 x 104-1 x 106 Da) der IVT-mRNA ihre effektive Permeation über die anionische Lipiddoppelschicht von Zellmembranen15. Daher ist ein Abgabesystem mit bestimmten biofunktionellen Materialien erforderlich, um den Abbau der IVT-mRNA-Moleküle zu hemmen und die zelluläre Aufnahme zu erleichtern16.
Abgesehen von einigen Ausnahmefällen, in denen nackte IVT-mRNA direkt für in vivo Untersuchungen verwendet wurde, werden verschiedene Abgabesysteme verwendet, um IVT-mRNA zum therapeutischen Wirkortzu transportieren 17,18. Frühere Studien haben gezeigt, dass nur wenige IVT-mRNAs im Zytosol ohne die Hilfe eines Abgabesystems nachgewiesen werden19. Zahlreiche Strategien wurden entwickelt, um die RNA-Lieferung mit kontinuierlichen Bemühungen auf diesem Gebiet zu verbessern, die von der Protaminkondensation bis zur Lipidverkapselung reichen20. Lipid-Nanopartikel (LNPs) sind die klinisch am weitesten fortgeschrittenen mRNA-Verabreichungsvehikel, wie die Tatsache beweist, dass alle zugelassenen mRNA-COVID-19-Impfstoffe für den klinischen Gebrauch LNP-basierte Verabreichungssysteme verwenden21. LNPs können jedoch keine effektive mRNA-Transfektion vermitteln, wenn die Formulierungen über den respiratorischen Weg22 verabreicht werden, was die Anwendung dieser Formulierungen bei der Induktion von Schleimhautimmunantworten oder bei der Behandlung pulmonalbedingter Erkrankungen wie Mukoviszidose oder α1-Antitrypsin-Mangel bemerkenswert einschränkt. Daher ist die Entwicklung eines neuartigen Abgabesystems erforderlich, um die effiziente Abgabe und Transfektion von IVT-mRNA in atemwegsbezogenen Zellen zu erleichtern, um diesen ungedeckten Bedarf zu decken.
Es wurde bestätigt, dass das Peptid-Poloxamin-selbstorganisierende Nanopartikel-Abgabesystem (PP-sNp) die effiziente Transfektion von Nukleinsäuren in den Atemwegen von Mäusen vermitteln kann23. Das PP-sNp verfolgt einen multifunktionalen modularen Designansatz, der verschiedene Funktionsmodule in die Nanopartikel für ein schnelles Screening und Optimierung integrieren kann23. Die synthetischen Peptide und elektrisch neutralen amphiphilen Blockcopolymere (Poloxamin) innerhalb des PP-sNp können spontan mit IVT-mRNA interagieren, um gleichmäßig verteilte Nanopartikel mit kompakter Struktur und glatter Oberfläche zu erzeugen23. PP-sNp kann den Gentransfektionseffekt von IVT-mRNA-Molekülen in kultivierten Zellen und den Atemwegen von Mäusen verbessern23. Die vorliegende Studie beschreibt ein Protokoll zur Erzeugung von PP-sNp mit IVT-mRNA, das Metridia luciferase (MetLuc-mRNA) kodiert (Abbildung 1). In diesem Protokoll wird eine kontrollierte und schnelle Durchmischung über eine mikrofluidische Mischvorrichtung verwendet, die das versetzte Fischgrätenmischdesign verwendet. Das Verfahren ist einfach durchzuführen und ermöglicht die Erzeugung von PP-sNp mit einheitlicheren Größen. Das allgemeine Ziel der PP-sNp-Produktion mit dem mikrofluidischen Mischer ist es, PP-sNp für die mRNA-Komplexierung auf gut kontrollierte Weise zu erzeugen und so eine effiziente und reproduzierbare Zelltransfektion in vitro zu ermöglichen. Das vorliegende Protokoll beschreibt die Herstellung, Montage und Charakterisierung von PP-sNp enthaltender MetLuc-mRNA.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BamHI</td>
			<td>Takara</td>
			<td>1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cap 1 capping system</td>
			<td>Jinan</td>
			<td>M082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dendritic cell-line</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SCC142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA sequence</td>
			<td>Genescript</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human bronchial epithelial cells</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SCC150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KpnI</td>
			<td>Takara</td>
			<td>1068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LP</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium chloride</td>
			<td>APEXBio</td>
			<td>B6083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malvern Zetasizer Nano ZS90</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>NB007605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic chip</td>
			<td>ZHONGXINQIHENG</td>
			<td>Standard PDMS chip</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate readers</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Varioskan lux</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>ND-ONE-W (A30221)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudouridine</td>
			<td>APE&#215;Bio</td>
			<td>B7972</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quanti-Luc</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>Rep-qlc2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RiboRuler High Range RNA Ladder</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>SM1821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free conical tube</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BS-100-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium 1640</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C11875500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Chemyx</td>
			<td>Fusion 101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 transcription Kit</td>
			<td>Jinan</td>
			<td>E131</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient transfection of in vitro transcribed mrna in cultured cells using peptide-poloxamine nanoparticles

In-vitro-transkribierte Boten-RNA (mRNA)-Impfstoffe haben ein enormes Potenzial im Kampf gegen die Coronavirus-Pandemie 2019 (COVID-19) gezeigt. Aufgrund der fragilen Eigenschaften der mRNA müssen effiziente und sichere Verabreichungssysteme in die mRNA-Impfstoffe aufgenommen werden. Ein selbstorganisierendes Peptid-Poloxamin-Nanopartikel (PP-sNp)-Genabgabesystem wurde speziell für die pulmonale Abgabe von Nukleinsäuren entwickelt und zeigt vielversprechende Fähigkeiten bei der Vermittlung einer erfolgreichen mRNA-Transfektion. Hier wird eine verbesserte Methode zur Herstellung von PP-sNp beschrieben, um zu erläutern, wie das PP-sNp Metridia luciferase (MetLuc) mRNA einkapselt und kultivierte Zellen erfolgreich transfiziert. MetLuc-mRNA wird durch einen in vitro Transkriptionsprozess aus einer linearen DNA-Vorlage gewonnen. Ein PP-sNp wird durch Mischen von synthetischem Peptid / Poloxamin mit mRNA-Lösung unter Verwendung eines mikrofluidischen Mischers hergestellt, was die Selbstorganisation von PP-sNp ermöglicht. Die Ladung von PP-sNp wird anschließend durch Messung des Zetapotentials bewertet. Gleichzeitig werden die Polydispersität und hydrodynamische Größe von PP-sNp-Nanopartikeln mittels dynamischer Lichtstreuung gemessen. Die mRNA/PP-sNp-Nanopartikel werden in kultivierte Zellen transfiziert, und Überstände aus der Zellkultur werden auf Luciferase-Aktivität untersucht. Die repräsentativen Ergebnisse belegen ihre Fähigkeit zur In-vitro-Transfektion . Dieses Protokoll könnte Aufschluss über die Entwicklung von mRNA-Impfstoffverabreichungssystemen der nächsten Generation geben.

Das rekombinante Plasmid wurde verdaut, um die linearisierte DNA-Vorlage herzustellen (Abbildung 2A). Unter Verwendung des beschriebenen Protokolls kann das T7 in vitro Transkriptionskit bis zu 80-120 μg unverschlossene MetLuc-mRNA pro 20 μL Reaktion und 50-60 μg verschlossene MetLuc-mRNA pro 100 μL Reaktion erzeugen. Bei der Analyse mit Elektrophorese sollte intakte MetLuc-mRNA mit hoher Qualität eine einzige und klare Bande aufweisen, wie in Abbildung 2B<...

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Efficient Transfection of In vitro Transcribed mRNA in Cultured Cells Using Peptide-Poloxamine Nanoparticles

Ein selbstorganisiertes Peptid-Poloxamin-Nanopartikel (PP-sNp) wird unter Verwendung einer mikrofluidischen Mischvorrichtung entwickelt, um in vitro transkribierte Boten-RNA zu verkapseln und zu liefern. Die beschriebene mRNA/PP-sNp konnte kultivierte Zellen in vitro effizient transfizieren.

Effiziente Transfektion von in vitro transkribierter mRNA in kultivierten Zellen mit Peptid-Poloxamin-Nanopartikeln

In vitro transcribed messenger RNA (mRNA) vaccines have displayed enormous potential in fighting against the coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic. ...

Peptid-Poloxamin-Nanopartikel sind eines der potenziellen pulmonalen mRNA-Abgabesysteme. Unser Protokoll stellt die Peptid-Poloxamin-Nanopartikel mit höherer Produktivität und Effizienz her, was die Entwicklung des mukosalen mRNA-Impfstoffs erleichtert. Die für die Technik erforderlichen Materialien sind kostengünstig und das Protokoll kann in kurzer Zeit fertiggestellt werden.Die Peptid-Poloxamin-Nanopartikel haben die Fähigkeit, eine effiziente mRNA-Transfektion zu vermitteln. Peptid-Poloxamin-Nanopartikel zeigten eine erfolgreiche mRNA-Transfektion in menschlichen Bronchialepithelzellen, was zusätzliche Anwendungen für schleimige COVID-19-Impfstoffe, die Behandlung von Lungenkrebs und die Mukoviszidose-Gentherapie impliziert. Ich erwarte, dass der Einzelne einige Grundkenntnisse in einem verwandten Bereich und mit dem Protokoll und vielen Techniken hat, bevor er oder sie mit der Durchführung der Experimente beginnt.Nachdem Sie den offenen Leserahmen von Metridia luciferase synthetisiert und in den pUC57-Vektor geklont haben, bereiten Sie eine linearisierte DNA-Vorlage mit BamHI und KpnI bei 37 Grad Celsius für eine Stunde vor. Bereiten Sie eine Reaktion von 20 Mikrolitern Volumen für die mRNA-Synthese mit einem T7-Transkriptionskit und Pseudouridin vor, wie im Manuskript beschrieben. Die Komponenten gründlich mischen und drei Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren.Entfernen Sie dann die Sekundärstruktur von 50 Mikrogramm ungedeckelter IVT-mRNA, indem Sie sie 10 Minuten lang bei 65 Grad Celsius erhitzen. Verwenden Sie das Cap 1-Capping-System für das IVT-mRNA-Capping und bereiten Sie Cap 1 vor, indem Sie die 7-Methylguanosin-Cap-Struktur unter Verwendung von S-Adenosylmethionin und 2'O-Methyltransferasen bei 37 Grad Celsius für 30 bis 60 Minuten modifizieren. Messen Sie die Konzentration der gekappten IVT-mRNA mit einem UV-sichtbaren Spektralphotometer.Analysieren Sie mit einem RNA-Marker die Molekülgröße der verschlossenen IVT-mRNA in einem 1% formaldehyddenaturierenden Agarosegel, das 18% Formaldehyd enthält. Bereiten Sie 10 Milligramm pro Milliliter Stammlösung von Poloxamin 704 durch Solubilisieren des T704 in nukleasefreiem Wasser vor. Bereiten Sie 2 Milligramm pro Milliliter Stammlösung des Peptids durch Solubilisierung des Peptids in nukleasefreiem Wasser vor.Lagern Sie die vorbereitete Lösung bei 4 Grad Celsius. Die IVT-mRNA auf Eis auftauen. Bevor Sie das Röhrchen öffnen, zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 300 mal G für drei Sekunden bei Raumtemperatur und verdünnen Sie die IVT-mRNA-Lösung mit nukleasefreiem Wasser.T704 und synthetische Peptidmischungslösung werden durch Verdünnen der T704-Lösung auf acht Mikrogramm pro Mikroliterkonzentration und der synthetischen Peptidlösung auf 0,555 Mikrogramm pro Mikroliterkonzentration mit nukleasefreiem Wasser hergestellt. Die Mischlösung vor der weiteren Verwendung 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Ziehen Sie die IVT-mRNA-Lösung in eine Ein-Milliliter-Spritze und vermeiden Sie Luftspalte oder Blasen in der Spritzenspitze.Legen Sie die Spritze in eine Seite der Patrone neben dem rotierenden Block ein. Füllen Sie dann eine Ein-Milliliter-Spritze mit T704 und synthetischer Peptidmischungslösung und entfernen Sie alle Blasen oder Luftspalte an der Spritzenspitze. Setzen Sie die Spritze in den anderen Einlass der Pumpe ein und stellen Sie die Pumpe auf eine Gesamtdurchflussrate von 4 bis 10 Milliliter pro Minute ein.Platzieren Sie ein zehn-Milliliter-RNase-freies konisches Röhrchen, um die gemischte IVT-mRNA/PP-sNp-Lösung am Ende des Fließwegs der Mischvorrichtung zu sammeln. Führen Sie die Pumpe aus, um das Mischen zu starten, und stellen Sie sicher, dass die Parameter korrekt eingegeben werden. Nachdem Sie die Pumpe sechs Sekunden lang laufen lassen, entnehmen Sie die IVT-mRNA/PP-sNp-Probe aus dem konischen Röhrchen.Plate humane Bronchialepithelzellen und eine dendritische Zelllinie in 96-Well-Platten 24 Stunden vor der Transfektion. Züchten Sie die Zellen in einem Kulturmedium, das mit 10% hitzeinaktiviertem fetalem Rinderserum und 1% Penicillin-Streptomycin ergänzt wird. Nach dem Entfernen des Wachstumsmediums waschen Sie die plattierten Zellen mit 0,2 Milliliter pro Vertiefung PBS.In jede Vertiefung, die die plattierten Zellkulturen enthält, werden 170 Mikroliter serumfreies Kulturmedium gegeben. Dann fügen Sie 30 Mikroliter IVT mRNA / PP-sNp Formulierung mit 0,4 Mikrogramm Metridia luciferase mRNA tropfenweise in jede Vertiefung hinzu. Inkubieren Sie die Zellen mit der IVT mRNA / PP-sNp Formulierung in einer befeuchteten 5% Kohlendioxid-angereicherten Atmosphäre bei 37 Grad Celsius für vier Stunden.Das Transfektionsmedium absaugen und 0,2 Milliliter frisches Kulturmedium hinzufügen, ergänzt mit 10% hitzeinaktiviertem fetalem Rinderserum und 1% Penicillin-Streptomycin. Inkubieren Sie die transfizierten Zellen für 24 Stunden, wie zuvor gezeigt, und sammeln Sie die zu erkennenden Überstände aus jedem Bohrloch. Bereiten Sie eine frische Assaylösung vor, indem Sie PBS zum Coelenterazin-Substrat hinzufügen.Mischen Sie die Lösung gründlich, indem Sie 10 Sekunden lang wirbeln. Fügen Sie 50 Mikroliter des gesammelten Überstands zu einer 96-Well-Platte hinzu. Stellen Sie den Mikrotiterplattenleser mit einer Lesezeit von 1.000 Millisekunden ein und geben Sie 30 Mikroliter Coelenterazin-Lösung manuell oder durch automatisierte Injektion in jede Vertiefung.Klicken Sie unmittelbar nach der Zugabe der Coelenterazin-Lösung zum Überstand auf Start, um das Lumineszenzsignal zu messen. Das rekombinante Plasmid wurde isoliert und verdaut, um die linearisierte DNA-Vorlage herzustellen. Die In-vitro-Transkription erzeugte Upcapped und Capped MetLuc mRNA.Zellen, die mit Metridia luciferase mRNA/PP-sNp transfiziert wurden, zeigten eine signifikant höhere Expression von Luciferase im Vergleich zu denen, die mit kommerziell erhältlichem lipidbasiertem Transfektionsreagenz, nackter Metridia luciferase mRNA, PBS oder synthetischen T7044-Peptiden, gemischter Lösung in menschlichen Bronchialepithelzellen, 16 HBE und dendritischen Zelllinien DC2.4 Metridia luciferase mRNA/PP-sNp transfiziert wurden, zeigten eine höhere Luciferase-Expression als LP, was darauf hindeutet, dass das PP-sNp-Abgabesystem wichtig ist für Schutz der MetLuc mRNA vor Abbau und zur Förderung der Transfektionseffizienz der exogenen Metridia luciferase mRNA. Bitte stellen Sie sicher, dass die synthetische Struktur der ungekappten Met-mRNA erfolgreich entfernt wird. Berechnen und laden Sie die Met-mRNA T704 und die Peptidverbindung sorgfältig herunter, um die Poloxamin-Nanopartikel vorzubereiten und zu verdichten.Transmissionselektronenmikroskopie kann durchgeführt werden, um die Morphologie von Peptid-Poloxamin-Nanopartikeln zu beobachten. Diese Technik hilft Forschern, mukosale mRNA-Impfstoffe zu entwickeln und ermöglicht ein Hochdurchsatz-Screening von Gentherapieformulierungen für alle verwandten Zellen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Efficient Transfection of In vitro Transcribed mRNA in Cultured Cells Using Peptide-Poloxamine Nanoparticles

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Retrovirale Transduktion von T-Zell-Rezeptoren in Maus-T-Zellen

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Genotypische Inference von HIV-1 Tropismus mit Populations-basierte Sequenzierung von V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Seven Steps to Stellate Cells

Seven Steps to Cells Stellate

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

Optimiertes Protokoll für die effiziente Transfektion von dendritischen Zellen ohne Zell-Reifung

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative<em&gt; In-vitro-</em&gt; Assay auf Neutrophile Haftung auf Aktiviert primären humanen mikrovaskulären Endothelzellen unter statischen Bedingungen messen

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Verwendung Fluoreszierende Proteine, zu visualisieren und zu quantifizieren<em&gt; Chlamydia</em&gt; Vakuole Wachstumsdynamik in lebenden Zellen

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Künstliche Antigen-präsentierenden Zellen (KaAPC) für effiziente<em&gt; In-vitro-</em&gt; Depletion von humanen Antigen-spezifischen T-Zellen

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Hocheffiziente Transfektion von humanen THP-1 Makrophagen durch Nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Ableitung von T-Zellen<em&gt; In-vitro-</em&gt; Aus embryonalen Stammzellen der Maus

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...