Name: efficient transfection of in vitro transcribed mrna in cultured cells using peptide-poloxamine nanoparticles
Uploaded: 2022-08-17T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Transfection of In vitro Transcribed mRNA in Cultured Cells Using Peptide-Poloxamine Nanoparticles at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (NSFC, מענק מס '82041045 ו- 82173764), הפרויקט הגדול של מחקר על פתוגנזה ומערכת טכנולוגיה למניעת מגיפות (2021YFC2302500) על ידי משרד המדע והטכנולוגיה של סין, פרויקט הכישרונות הצעירים יוצאי הדופן של צ'ונגצ'ינג: כישרונות צעירים יוצאי דופן (CQYC202005027), והקרן למדעי הטבע של צ'ונגצ'ינג (cstc2021jcyj-msxmX0136). המחברים מודים לד"ר שיאויאן דינג על מדידת הקוטר ההידרודינמי (nm) ומדד הפולידיספרסיה (PDI).

1. שעתוק חוץ גופי של mRNA שעבר שינוי כימי
הערה: זה נדרש להשתמש צינורות ללא נוקלאז, ריאגנטים, כלי זכוכית, טיפים פיפטה, וכו ', כי RNases נמצאים בכל מקום בסביבה, כגון פתרונות מעבדה, משטחי מכשיר, שיער, עור, אבק, וכו ' נקו היטב את משטחי הספסל והפיפטות לפני השימוש, ולבשו כפפות כדי...

<ol>
	<li>Nature milestones in vaccines. Springer Nature Available from: <a target="_blank" href="https://www.nature.com/collections/hcajdiajij">https://www.nature.com/collections/hcajdiajij</a> (2020)</li><li>Barbier, A. J., Jiang, A. Y., Zhang, P., Wooster, R., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+progress+of+mRNA+vaccines+and+immunotherapies.">The clinical progress of mRNA vaccines and immunotherapies.</a> Nature Biotechnology. 40 (6), 840-854 (2022).</li><li>Mulligan, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+I/II+study+of+COVID-19+RNA+vaccine+BNT162b1+in+adults.">Phase I/II study of COVID-19 RNA vaccine BNT162b1 in adults.</a> Nature. 586 (7830), 589-593 (2020).</li><li>Tang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotechnologies+in+delivery+of+DNA+and+mRNA+vaccines+to+the+nasal+and+pulmonary+mucosa.">Nanotechnologies in delivery of DNA and mRNA vaccines to the nasal and pulmonary mucosa.</a> Nanomaterials. 12 (2), 226 (2022).</li><li>Freyn, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multi-targeting,+nucleoside-modified+mRNA+influenza+virus+vaccine+provides+broad+protection+in+mice.">A multi-targeting, nucleoside-modified mRNA influenza virus vaccine provides broad protection in mice.</a> Molecular Therapy. 28 (7), 1569-1584 (2020).</li><li>Wu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variant+SARS-CoV-2+mRNA+vaccines+confer+broad+neutralization+as+primary+or+booster+series+in+mice.">Variant SARS-CoV-2 mRNA vaccines confer broad neutralization as primary or booster series in mice.</a> Vaccine. 39 (51), 7394-7400 (2021).</li><li>Chaudhary, N., Weissman, D., Whitehead, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+vaccines+for+infectious+diseases:+Principles,+delivery+and+clinical+translation.">mRNA vaccines for infectious diseases: Principles, delivery and clinical translation.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 20, 817-838 (2021).</li><li>Kormann, M. S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+therapeutic+proteins+after+delivery+of+chemically+modified+mRNA+in+mice.">Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice.</a> Nature Biotechnology. 29 (2), 154-157 (2011).</li><li>Tavernier, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+as+gene+therapeutic:+How+to+control+protein+expression.">mRNA as gene therapeutic: How to control protein expression.</a> Journal of Controlled Release. 150 (3), 238-247 (2011).</li><li>Walsh, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+immunogenicity+of+two+RNA-based+Covid-19+vaccine+candidates.">Safety and immunogenicity of two RNA-based Covid-19 vaccine candidates.</a> The New England Journal of Medicine. 383 (25), 2439-2450 (2020).</li><li>Baden, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+safety+of+the+mRNA-1273+SARS-CoV-2+vaccine.">Efficacy and safety of the mRNA-1273 SARS-CoV-2 vaccine.</a> The New England Journal of Medicine. 384 (5), 403-416 (2021).</li><li>Guan, S., Rosenecker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotechnologies+in+delivery+of+mRNA+therapeutics+using+nonviral+vector-based+delivery+systems.">Nanotechnologies in delivery of mRNA therapeutics using nonviral vector-based delivery systems.</a> Gene Therapy. 24 (3), 133-143 (2017).</li><li>Sharova, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Database+for+mRNA+half-life+of+19+977+genes+obtained+by+DNA+microarray+analysis+of+pluripotent+and+differentiating+mouse+embryonic+stem+cells.">Database for mRNA half-life of 19 977 genes obtained by DNA microarray analysis of pluripotent and differentiating mouse embryonic stem cells.</a> DNA Research. 16 (1), 45-58 (2009).</li><li>Houseley, J., Tollervey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+many+pathways+of+RNA+degradation.">The many pathways of RNA degradation.</a> Cell. 136 (4), 763-776 (2009).</li><li>Kowalski, P. S., Rudra, A., Miao, L., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivering+the+messenger:+Advances+in+technologies+for+therapeutic+mRNA+delivery.">Delivering the messenger: Advances in technologies for therapeutic mRNA delivery.</a> Molecular Therapy. 27 (4), 710-728 (2019).</li><li>Sahin, U., Karik&#243;, K., T&#252;reci, &. #. 2. 1. 4. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MRNA-based+therapeutics-developing+a+new+class+of+drugs.">MRNA-based therapeutics-developing a new class of drugs.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 13, 359-380 (2014).</li><li>Hajj, K. A., Whitehead, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+translation:+Non-viral+materials+for+therapeutic+mRNA+delivery.">Tools for translation: Non-viral materials for therapeutic mRNA delivery.</a> Nature Reviews Materials. 2, 17056 (2017).</li><li>Deering, R. P., Kommareddy, S., Ulmer, J. B., Brito, L. A., Geall, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+acid+vaccines:+Prospects+for+non-viral+delivery+of+mRNA+vaccines.">Nucleic acid vaccines: Prospects for non-viral delivery of mRNA vaccines.</a> Expert Opinion on Drug Delivery. 11 (6), 885-899 (2014).</li><li>Wadhwa, A., Aljabbari, A., Lokras, A., Foged, C., Thakur, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opportunities+and+challenges+in+the+delivery+of+mRNA-based+vaccines.">Opportunities and challenges in the delivery of mRNA-based vaccines.</a> Pharmaceutics. 12 (2), 102 (2020).</li><li>Hou, X., Zaks, T., Langer, R., Dong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+nanoparticles+for+mRNA+delivery.">Lipid nanoparticles for mRNA delivery.</a> Nature Reviews Materials. 6 (12), 1078-1094 (2021).</li><li>Sahin, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COVID-19+vaccine+BNT162b1+elicits+human+antibody+and+T(H)1+T+cell+responses.">COVID-19 vaccine BNT162b1 elicits human antibody and T(H)1 T cell responses.</a> Nature. 586 (7830), 594-599 (2020).</li><li>Azzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+immune+response+in+BNT162b2+COVID-19+vaccine+recipients.">Mucosal immune response in BNT162b2 COVID-19 vaccine recipients.</a> EBioMedicine. 75, 103788 (2022).</li><li>Guan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+peptide-poloxamine+nanoparticles+enable+in+vitro+and+in+vivo+genome+restoration+for+cystic+fibrosis.">Self-assembled peptide-poloxamine nanoparticles enable in vitro and in vivo genome restoration for cystic fibrosis.</a> Nature Nanotechnology. 14 (3), 287-297 (2019).</li><li>Pitard, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negatively+charged+self-assembling+DNA/poloxamine+nanospheres+for+in+vivo+gene+transfer.">Negatively charged self-assembling DNA/poloxamine nanospheres for in vivo gene transfer.</a> Nucleic Acids Research. 32 (20), 159 (2004).</li><li>Hiroi, T., Shibayama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+particle+size+distribution+in+turbid+solutions+by+dynamic+light+scattering+microscopy.">Measurement of particle size distribution in turbid solutions by dynamic light scattering microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), e54885 (2017).</li><li>Hassett, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+lipid+nanoparticle+size+on+mRNA+vaccine+immunogenicity.">Impact of lipid nanoparticle size on mRNA vaccine immunogenicity.</a> Journal of Controlled Release. 335, 237-246 (2021).</li><li>Suk, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+penetration+of+fresh+undiluted+sputum+expectorated+by+cystic+fibrosis+patients+by+non-adhesive+polymer+nanoparticles.">The penetration of fresh undiluted sputum expectorated by cystic fibrosis patients by non-adhesive polymer nanoparticles.</a> Biomaterials. 30 (13), 2591-2597 (2009).</li><li>Kim, N., Duncan, G. A., Hanes, J., Suk, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barriers+to+inhaled+gene+therapy+of+obstructive+lung+diseases:+A+review.">Barriers to inhaled gene therapy of obstructive lung diseases: A review.</a> Journal of Controlled Release. 240, 465-488 (2016).</li><li>Liu, Z., Fontana, F., Python, A., Hirvonen, J. T., Santos, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+production+of+particles:+Mechanism,+methodology,+and+applications.">Microfluidics for production of particles: Mechanism, methodology, and applications.</a> Small. 16 (9), 1904673 (2020).</li><li>Guan, S., Darmst&#228;dter, M., Xu, C., Rosenecker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+investigations+on+optimizing+and+nebulization+of+IVT-mRNA+formulations+for+potential+pulmonary-based+alpha-1-antitrypsin+deficiency+treatment.">In vitro investigations on optimizing and nebulization of IVT-mRNA formulations for potential pulmonary-based alpha-1-antitrypsin deficiency treatment.</a> Pharmaceutics. 13 (8), 1281 (2021).</li><li>Shepherd, S. J., Issadore, D., Mitchell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+formulation+of+nanoparticles+for+biomedical+applications.">Microfluidic formulation of nanoparticles for biomedical applications.</a> Biomaterials. 274, 120826 (2021).</li><li>Han, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+confined+impingement+jets+mixer+for+flash+nanoprecipitation.">A simple confined impingement jets mixer for flash nanoprecipitation.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 101 (10), 4018-4023 (2012).</li></ol>

הפרוטוקול המתואר כאן לא רק מאפשר ייצור חסכוני ומהיר של פורמולציות חיסון IVT mRNA עם תכונות מוגדרות, אלא הוא גם מציע את האפשרות להתאים אישית את נוסחת PP-sNp בהתאם למטרות טיפוליות ספציפיות, כגון ריפוי גנטי. על מנת להבטיח את הדור המוצלח של IVT mRNA/PP-sNp, מומלץ להקדיש תשומת לב נוספת לכמה שלבים קריטיים. כאש...

החיסון הוכרז כאחת ההתערבויות הרפואיות היעילות ביותר להפחתת התחלואה והתמותה הנגרמות ממחלות זיהומיות1. חשיבות החיסונים הוכחה מאז פרוץ מחלת הקורונה 2019 (COVID-19). בניגוד לתפיסה המסורתית של הזרקת פתוגנים מומתים או מוחלשים, גישות חיסונים מתקדמות, כגון חיסונים מבוססי חומצות גרעין, מתרכזות בשימור התכונות הממריצות את מערכת החיסון של פתוגני המטרה תוך הימנעות מבעיות הבטיחות הפוטנציאליות הקשורות לנגיף המיקרוביאלי השלם הקונבנציונלי - או בחיסונים מבוססי חיידקים. הן חיסונים מבוססי דנ"א והן רנ"א (כלומר, רנ"א שליח מתועתק במבחנה, IVT mRNA) מציגים פוטנציאל מניעתי עד טיפולי נגד מגוון מחלות, כולל מחלות זיהומיות וסרטן 2,3. באופן עקרוני, הפוטנציאל של חיסונים מבוססי חומצות גרעין קשור לייצורם, יעילותם ובטיחותם4. חיסונים אלה יכולים להיות מיוצרים באופן ללא תאים כדי לאפשר ייצור חסכוני, מדרגי ומהיר.
חיסון יחיד המבוסס על חומצות גרעין יכול לקודד אנטיגנים מרובים, מה שמאפשר מטרה לווריאנטים נגיפיים רבים או חיידקים עם מספר מופחת של חיסונים ולחזק את התגובה החיסונית נגד פתוגנים עמידים 5,6. חוץ מזה, חיסונים המבוססים על חומצות גרעין יכולים לחקות את תהליך הפלישה הטבעי של זיהום נגיפי או חיידקי, ולהביא הן לתגובות חיסוניות בתיווך תאי B והן בתאי T. בניגוד לחלק מהחיסונים מבוססי הנגיפים או הדנ"א, חיסונים מבוססי IVT mRNA מציעים יתרון עצום מבחינת בטיחות. הם יכולים לבטא במהירות את האנטיגן הרצוי בציטוזול ואינם משולבים בגנום המארח, מה שמייתר את החששות לגבי מוטגנזה החדרתית7. IVT-mRNA מתפרק באופן אוטומטי לאחר תרגום מוצלח, כך שניתן לשלוט בקלות בקינטיקה של ביטוי החלבון שלו 8,9. על ידי מגיפת נגיף הקורונה 2 (SARS-CoV-2) של תסמונת נשימתית חריפה חמורה, מאמצים של חברות/מוסדות ברחבי העולם אפשרו שחרור לשוק של סוגים רבים של חיסונים. טכנולוגיית חיסון מבוססת mRNA IVT מראה פוטנציאל גדול, ולראשונה, הוכיחה את הצלחתה הצפויה בעבר, הודות לתכנון המהיר שלה ויכולתה הגמישה להסתגל לכל אנטיגן מטרה תוך מספר חודשים. ההצלחה של חיסוני mRNA IVT נגד COVID-19 ביישומים קליניים לא רק פתחה עידן חדש של מחקר ופיתוח חיסוני mRNA IVT, אלא גם צברה ניסיון רב ערך לפיתוח מהיר של חיסונים יעילים להתמודדות עם התפרצויות של מחלות זיהומיות10,11.
למרות הפוטנציאל המבטיח של חיסוני mRNA IVT, ההעברה התוך-תאית היעילה של mRNA IVT לאתר הפעולה (כלומר, ציטופלסמה) ממשיכה להוות מכשול גדול12, במיוחד עבור אלה הניתנים דרך דרכי הנשימה4. IVT mRNA היא מטבעה מולקולה לא יציבה עם זמן מחצית חיים קצר ביותר (~7 שעות)13, מה שהופך את ה-IVT mRNA לנוטה מאוד להתפרקות על ידי RNase14 הנמצא בכל מקום. הלימפוציטים של מערכת החיסון המולדת נוטים לבלוע את ה- mRNA המוכר של IVT במקרים של יישום in vivo . יתר על כן, צפיפות המטען השלילי הגבוהה והמשקל המולקולרי הגדול (1 x 104-1 x 106 Da) של mRNA IVT פוגעים בחדירתו היעילה על פני דו-שכבת השומנים האניונית של קרומי התאים15. לכן, נדרשת מערכת אספקה עם חומרים ביו-פונקציונליים מסוימים כדי לעכב את הפירוק של מולקולות ה-mRNA של IVT ולהקל על ספיגת התאים16.
מלבד כמה מקרים חריגים שבהם נעשה שימוש ישיר ב-mRNA IVT עירום לחקירות in vivo, נעשה שימוש במערכות אספקה שונות כדי לשאת את ה-IVT mRNA לאתר הטיפולי של פעולה17,18. מחקרים קודמים גילו כי רק כמה mRNA IVT מזוהים בציטוזול ללא סיוע של מערכת אספקה19. אסטרטגיות רבות פותחו כדי לשפר את אספקת ה-RNA במאמצים מתמשכים בתחום, החל מעיבוי פרוטמין ועד אנקפסולציה של שומנים20. ננו-חלקיקי ליפידים (LNPs) הם המתקדמים ביותר מבחינה קלינית מבין כלי ההעברה של mRNA, כפי שמוכיחה העובדה שכל חיסוני ה-mRNA COVID-19 המאושרים לשימוש קליני משתמשים במערכות אספקה מבוססות LNP21. עם זאת, LNPs אינם יכולים לתווך טרנספקציה יעילה של mRNA כאשר הפורמולציות מועברות דרך נתיב הנשימה22, מה שמגביל באופן מדהים את היישום של פורמולציות אלה בגרימת תגובות חיסוניות של הרירית או בטיפול במחלות הקשורות לריאתיות כגון סיסטיק פיברוזיס או מחסור ב-α1-antitrypsin. לכן, פיתוח מערכת אספקה חדשנית כדי להקל על אספקה יעילה והעברה של mRNA IVT בתאים הקשורים לדרכי הנשימה נדרש כדי לפתור את הצורך הבלתי מסופק הזה.
אושר כי מערכת העברת הננו-חלקיקים בהרכבה עצמית של פפטיד-פולוקסאמין (PP-sNp) יכולה לתווך את ההעברה היעילה של חומצות גרעין בדרכי הנשימה של עכברים23. PP-sNp מאמצת גישת תכנון מודולרי רב-תכליתית, שיכולה לשלב מודולים פונקציונליים שונים בננו-חלקיקים לצורך סינון ואופטימיזציה מהירים23. הפפטידים הסינתטיים וקופולימרים של בלוקים אמפיפיליים ניטרליים חשמלית (פולוקסאמין) בתוך PP-sNp יכולים לקיים אינטראקציה ספונטנית עם mRNA IVT כדי ליצור ננו-חלקיקים המפוזרים באופן אחיד עם מבנה קומפקטי ומשטח חלק23. PP-sNp יכול לשפר את השפעת הטרנספקציה הגנטית של מולקולות mRNA IVT בתאים בתרבית ובדרכי הנשימה של עכברים23. המחקר הנוכחי מתאר פרוטוקול ליצירת PP-sNp המכיל mRNA IVT המקודד את Metridia luciferase (MetLuc-mRNA) (איור 1). בפרוטוקול זה נעשה שימוש בערבוב מבוקר ומהיר באמצעות מכשיר ערבוב מיקרופלואידי, המשתמש בעיצוב ערבוב עצמות הרינג המדשדש. ההליך קל לביצוע ומאפשר יצירת PP-sNp בגדלים אחידים יותר. המטרה הכללית של ייצור PP-sNp באמצעות מערבל מיקרופלואידי היא ליצור PP-sNp עבור קומפלקס mRNA באופן מבוקר היטב, ובכך לאפשר טרנספקציה יעילה וניתנת לשחזור של תאים במבחנה. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את ההכנה, ההרכבה והאפיון של PP-sNp המכיל MetLuc-mRNA.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BamHI</td>
			<td>Takara</td>
			<td>1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cap 1 capping system</td>
			<td>Jinan</td>
			<td>M082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dendritic cell-line</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SCC142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA sequence</td>
			<td>Genescript</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human bronchial epithelial cells</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SCC150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KpnI</td>
			<td>Takara</td>
			<td>1068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LP</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium chloride</td>
			<td>APEXBio</td>
			<td>B6083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malvern Zetasizer Nano ZS90</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>NB007605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic chip</td>
			<td>ZHONGXINQIHENG</td>
			<td>Standard PDMS chip</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate readers</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Varioskan lux</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>ND-ONE-W (A30221)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudouridine</td>
			<td>APE&#215;Bio</td>
			<td>B7972</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quanti-Luc</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>Rep-qlc2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RiboRuler High Range RNA Ladder</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>SM1821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free conical tube</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BS-100-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium 1640</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C11875500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Chemyx</td>
			<td>Fusion 101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 transcription Kit</td>
			<td>Jinan</td>
			<td>E131</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient transfection of in vitro transcribed mrna in cultured cells using peptide-poloxamine nanoparticles

חיסוני RNA שליח מתועתקים במבחנה (mRNA) הציגו פוטנציאל עצום במאבק במגפת הקורונה 2019 (COVID-19). מערכות אספקה יעילות ובטוחות חייבות להיכלל בחיסוני ה-mRNA בשל התכונות השבריריות של mRNA. מערכת העברת גנים של ננו-חלקיקי פפטיד-פולוקסאמין (PP-sNp) בהרכבה עצמית תוכננה במיוחד להעברה ריאתית של חומצות גרעין ומציגה יכולות מבטיחות בתיווך העברה מוצלחת של mRNA. כאן מתוארת שיטה משופרת להכנת PP-sNp כדי לפרט כיצד ה-PP-sNp עוטף את ה-mRNA של Metridia luciferase (MetLuc) ומעביר בהצלחה תאים בתרבית. MetLuc-mRNA מתקבל על ידי תהליך שעתוק במבחנה מתבנית DNA ליניארית. PP-sNp מיוצר על ידי ערבוב פפטיד/פולוקסאמין סינתטי עם תמיסת mRNA באמצעות מערבל מיקרופלואידי, המאפשר הרכבה עצמית של PP-sNp. המטען של PP-sNp מוערך לאחר מכן על ידי מדידת פוטנציאל הזטה. בינתיים, הפולידיספריות והגודל ההידרודינמי של ננו-חלקיקי PP-sNp נמדדים באמצעות פיזור אור דינמי. הננו-חלקיקים mRNA/PP-sNp מועברים לתאים בתרבית, וסופרנאטנטים מתרבית התאים נבדקים לפעילות לוציפראז. התוצאות המייצגות מדגימות את יכולתן להעברה חוץ-גופית. פרוטוקול זה עשוי לשפוך אור על פיתוח מערכות אספקת חיסוני mRNA מהדור הבא.

הפלסמיד הרקומביננטי עוכל כדי לייצר את תבנית הדנ"א הליניארית (איור 2A). באמצעות הפרוטוקול המתואר, ערכת השעתוק במבחנה T7 יכולה לייצר עד 80-120 מיקרוגרם של MetLuc-mRNA ללא כיסוי לכל תגובת 20 μL ו-50-60 מיקרוגרם של MetLuc-mRNA מכוסה לכל תגובת 100 μL. כאשר מנתחים אותו באמצעות אלקטרופורזה, MetLuc-mRNA ש...

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Transfection of In vitro Transcribed mRNA in Cultured Cells Using Peptide-Poloxamine Nanoparticles at JoVE.com

Efficient Transfection of In vitro Transcribed mRNA in Cultured Cells Using Peptide-Poloxamine Nanoparticles

ננו-חלקיק פפטיד-פולוקסאמין בהרכבה עצמית (PP-sNp) פותח באמצעות מכשיר ערבוב מיקרופלואידי כדי לתמצת ולהעביר רנ"א שליח מתועתק במבחנה . ה-mRNA/PP-sNp המתואר יכול להעביר ביעילות תאים בתרבית במבחנה.

טרנספקציה יעילה של mRNA מתועתק במבחנה בתאים בתרבית באמצעות ננו-חלקיקים פפטיד-פולוקסאמין

In vitro transcribed messenger RNA (mRNA) vaccines have displayed enormous potential in fighting against the coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic. ...

ננו-חלקיקי פפטיד-פולוקסאמין היא אחת ממערכות העברת ה-mRNA הריאתיות הפוטנציאליות. הפרוטוקול שלנו מייצר את הננו-חלקיקים פפטיד-פולוקסאמין עם פרודוקטיביות ויעילות גבוהות יותר, מה שמקל על פיתוח חיסון ה-mRNA הרירי. החומרים הנדרשים על ידי הטכניקה הם בעלות נמוכה, ואת הפרוטוקול ניתן להשלים בתוך זמן קצר.לננו-חלקיקי הפפטיד-פולוקסאמין יש את היכולת לתווך העברה יעילה של mRNA. ננו-חלקיקי פפטיד-פולוקסאמין הציגו טרנספקציה מוצלחת של mRNA בתאי אפיתל הסימפונות האנושיים, מה שמרמז על יישומים נוספים לחיסוני COVID-19 ברירית, טיפול בסרטן ריאות וטיפול גנטי בסיסטיק פיברוזיס. אני מצפה מהאדם להיות בעל ידע בסיסי בתחום קשור ועם הפרוטוקול והרבה מהטכניקות גם כן, לפני שהוא או היא מתחילים לבצע את הניסויים.לאחר סינתזה של מסגרת הקריאה הפתוחה של Metridia luciferase ושיבוט שלה לווקטור pUC57, הכינו תבנית דנ"א ליניארית באמצעות BamHI ו-KpnI בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת. הכן תגובה של נפח של 20 מיקרוליטרים לסינתזת mRNA באמצעות ערכת שעתוק T7 ופסאודורידין כמתואר בכתב היד. מערבבים היטב את הרכיבים ודוגרים בחום של 37 מעלות במשך שלוש שעות.לאחר מכן, הסר את המבנה המשני של 50 מיקרוגרם של mRNA IVT uncapped על ידי חימום אותו ב 65 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. השתמש במערכת המכסה Cap 1 עבור מכסה ה-mRNA של IVT, והכן את Cap 1 על-ידי שינוי מבנה המכסה של 7-מתילגואנוזין באמצעות S-אדנוזיל-מתיונין ו-2'O-מתיל-טרנספראזות ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 עד 60 דקות. מדוד את הריכוז של mRNA IVT מכוסה באמצעות ספקטרופוטומטר הנראה לעין UV.באמצעות סמן RNA, נתחו את הגודל המולקולרי של ה-mRNA של IVT ב-1% פורמלדהיד דנטורינג אגרוז ג'ל המכיל 18% פורמלדהיד. הכינו תמיסת מלאי של 10 מיליגרם למיליליטר של פולוקסאמין 704 על ידי סילוק T704 במים נטולי נוקלאז. הכינו 2 מיליגרם לתמיסת מלאי מיליליטר של הפפטיד על ידי התזת הפפטיד במים נטולי נוקלאז.לאחסן את הפתרון מוכן ב 4 מעלות צלזיוס. הפשרת ה-mRNA של IVT על קרח. לפני פתיחת הצינור, צנטריפוגה של הצינור ב 300 פעמים G במשך שלוש שניות בטמפרטורת החדר, ולדלל את תמיסת ה- IVT mRNA במים נטולי נוקלאז.הכן תמיסת תערובת פפטידים סינתטית T704 וסינתטית על ידי דילול תמיסת T704 לריכוז של שמונה מיקרוגרם למיקרוליטר, ותמיסת פפטידים סינתטית לריכוז של 0.555 מיקרוגרם למיקרוליטר, עם מים נטולי נוקלאז, בהתאמה. יש לדגום את התמיסה המעורבת למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר לפני שימוש נוסף. שאבו את תמיסת ה-mRNA של IVT לתוך מזרק של מיליליטר אחד, תוך הימנעות מרווחי אוויר או בועות בקצה המזרק.טען את המזרק לצד אחד של המחסנית ליד הבלוק המסתובב. לאחר מכן, מלא מזרק של מיליליטר אחד עם T704 ותמיסת תערובת פפטידים סינתטית, והסר את כל הבועות או מרווחי האוויר בקצה המזרק. מניחים את המזרק לתוך הכניסה השנייה של המשאבה, ולהגדיר את המשאבה עם קצב זרימה כולל של 4 עד 10 מיליליטר לדקה.הנח צינור חרוטי ללא RNase של עשרה מיליליטר כדי לאסוף את תמיסת ה- IVT mRNA / PP-sNp המעורבת בסוף נתיב הזרימה של התקן הערבוב. הפעל את המשאבה כדי להתחיל את הערבוב, תוך הקפדה על קלט נכון של הפרמטרים. לאחר הפעלת המשאבה במשך שש שניות, אסוף את דגימת ה-MRNA/PP-SNp של IVT מהצינור החרוטי.צלחת תאי אפיתל הסימפונות האנושיים וקו תאים דנדריטיים בלוחות 96-well 24 שעות לפני הטרנספקציה. לגדל את התאים במדיום תרבית בתוספת 10% סרום בקר עוברי מומת בחום ו-1% פניצילין סטרפטומיצין. לאחר הסרת מדיום הצמיחה, לשטוף את התאים מצופים עם 0.2 מיליליטר לכל PBS היטב.הוסף 170 מיקרוליטרים של מדיום תרבית ללא סרום לכל באר המכילה את תרביות התאים המצופות. לאחר מכן, הוסיפו 30 מיקרוליטרים של נוסחת IVT mRNA/PP-sNp המכילה 0.4 מיקרוגרם של Metridia luciferase mRNA טיפה חכמה לתוך כל באר. דגרו על התאים עם נוסחת ה-IVT mRNA/PP-sNp באטמוספרה מועשרת ב-5% פחמן דו-חמצני בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות.שאפו את מדיום ההעברה והוסיפו 0.2 מיליליטר של מדיום תרבית טרי בתוספת 10% סרום בקר עוברי מומת בחום ו-1% פניצילין סטרפטומיצין. לדגור על התאים הטרנספקטיביים למשך 24 שעות כפי שהוכח קודם לכן ולאסוף את הסופרנטנטים שיזוהו מכל באר. הכן פתרון בדיקה טרי על ידי הוספת PBS למצע coelenterazine.ערבבו היטב את התמיסה על ידי מערבולת במשך 10 שניות. הוסיפו 50 מיקרוליטרים של הסופרנטנט שנאסף לצלחת של 96 בארות. הגדר את קורא microplate עם זמן קריאה של 1, 000 אלפיות השנייה ולהוסיף 30 microliters של פתרון coelenterazine לכל באר באופן ידני או על ידי הזרקה אוטומטית.מיד לאחר הוספת תמיסת coelenterazine לסופרנטנט, לחץ על התחל כדי למדוד את אות הזוהר. הפלסמיד הרקומביננטי בודד ועוכל כדי לייצר את תבנית הדנ"א הליניארית. השעתוק במבחנה הפיק mRNA של MetLuc.תאים שעברו טרנספקציה עם Metridia luciferase mRNA/PP-sNp הציגו ביטוי גבוה יותר באופן משמעותי של לוציפראז בהשוואה לאלה שעברו טרנספקציה עם מגיב טרנספקציה מבוסס שומנים זמין מסחרית, mRNA של Metridia luciferase עירום, PBS או T7044 פפטידים סינתטיים, תמיסה מעורבת בתאי אפיתל הסימפונות האנושיים, 16 HBE, וקו תאים דנדריטיים DC2.4 Metridia luciferase mRNA/PP-sNp הראה ביטוי לוציפראז גבוה יותר מאשר LP.מה שמרמז על כך שמערכת האספקה של PP-sNp חשובה עבור הגנה על ה-mRNA של MetLuc מפני השפלה ולקידום יעילות ההעברה של ה-mRNA האקסוגני Metridia luciferase. אנא ודא כי המבנה הסינתטי של Met-mRNA uncapped הוסר בהצלחה. חשב והורד את תרכובת Met-mRNA T704 והפפטיד בקפידה כדי להכין ולדחוס את חלקיקי הפולוקסאמין.ניתן לבצע מיקרוסקופיית אלקטרונים כדי לבחון את המורפולוגיה של ננו-חלקיקי פפטיד-פולוקסאמין. טכניקה זו מסייעת לחוקרים לפתח חיסוני mRNA ברירית ולאפשר סריקה בתפוקה גבוהה של פורמולציות של ריפוי גנטי עבור כל התאים הקשורים.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Efficient Transfection of In vitro Transcribed mRNA in Cultured Cells Using Peptide-Poloxamine Nanoparticles

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

התמרה retroviral של T-cell קולטנים עכבר מתאי T

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

הסקה Genotypic של כמיהות HIV-1 שימוש אוכלוסייה מבוססת רצף של V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Seven Steps to Stellate Cells

שבעה צעדים Stellate תאים

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

פרוטוקול אופטימיזציה עבור transfection יעילה של תאים דנדריטים ללא ההבשלה Cell

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

כמותי<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay כדי למדוד הידבקות נויטרופילים לתאים מופעלים עיקריים אדם אנדותל כלי הדם בתנאים סטטיים

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

שימוש בחלבוני ניאון כדי לחזות ולכמת<em&gt; כלמידיה</em&gt; חלולית דינמיקת צמיחה בתאים חיים

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

תאי מציגי הרוצח המלאכותי Antigen (KaAPC) ליעיל<em&gt; במבחנה</em&gt; דלדול של תאי T אנושי אנטיגן ספציפי

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Transfection יעיל ביותר של של אדם המקרופאגים THP-1 על ידי nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

גזירה של תאי T<em&gt; במבחנה</em&gt; מתאי עכבר גזע העובריים

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...