Name: efficient transfection of in vitro transcribed mrna in cultured cells using peptide-poloxamine nanoparticles
Uploaded: 2022-08-17T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Transfection of In vitro Transcribed mRNA in Cultured Cells Using Peptide-Poloxamine Nanoparticles at JoVE.com

इस काम को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (एनएसएफसी, ग्रांट नंबर 82041045 और 82173764) द्वारा समर्थित किया गया था, जो चीन के विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय द्वारा रोगजनन और महामारी रोकथाम प्रौद्योगिकी प्रणाली (2021वाईएफसी 2302500) पर अध्ययन की प्रमुख परियोजना, चोंगकिंग प्रतिभा: असाधारण युवा प्रतिभा परियोजना (सीक्यूवाईसी 202005027), और चोंगकिंग के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (सीएसटीसी 202020202027) द्वारा समर्थित थी। लेखक हाइड्रोडायनामिक व्यास (एनएम) और पॉलीडिस्पर्सिटी इंडेक्स (पीडीआई) को मापने के लिए डॉ जियाओयन डिंग के आभारी हैं।

1. रासायनिक रूप से संशोधित एमआरएनए के इन विट्रो प्रतिलेखन में
नोट: न्यूक्लियस मुक्त ट्यूबों, अभिकर्मकों, कांच के बने पदार्थ, पिपेट युक्तियों, आदि का उपयोग करना आवश्यक है, क्योंकि आरए?...

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	<li>Nature milestones in vaccines. Springer Nature Available from: <a target="_blank" href="https://www.nature.com/collections/hcajdiajij">https://www.nature.com/collections/hcajdiajij</a> (2020)</li><li>Barbier, A. J., Jiang, A. Y., Zhang, P., Wooster, R., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+progress+of+mRNA+vaccines+and+immunotherapies.">The clinical progress of mRNA vaccines and immunotherapies.</a> Nature Biotechnology. 40 (6), 840-854 (2022).</li><li>Mulligan, M. 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यहां वर्णित प्रोटोकॉल न केवल परिभाषित गुणों के साथ आईवीटी एमआरएनए वैक्सीन योगों के लागत प्रभावी और तेजी से उत्पादन की अनुमति देता है, बल्कि यह जीन थेरेपी जैसे विशिष्ट चिकित्सीय उद्देश्यों के अनुसार ?...

संक्रामक रोगों के कारण होने वाली रुग्णता और मृत्यु दर को कम करने के लिए टीकाकरण को सबसे कुशल चिकित्सा हस्तक्षेपों में से एक के रूप में घोषित किया गयाहै। कोरोना वायरस बीमारी 2019 (कोविड-19) के प्रकोप के बाद से टीकों के महत्व को प्रदर्शित किया गया है। निष्क्रिय या जीवित-क्षीण रोगजनकों को इंजेक्शन लगाने की पारंपरिक अवधारणा के विपरीत, अत्याधुनिक वैक्सीन दृष्टिकोण, जैसे न्यूक्लिक एसिड-आधारित टीके, पारंपरिक संपूर्ण-माइक्रोबियल वायरस से जुड़े संभावित सुरक्षा मुद्दों से बचते हुए लक्ष्य रोगजनकों के प्रतिरक्षा-उत्तेजक गुणों को संरक्षित करने पर ध्यान केंद्रित करते हैं- या बैक्टीरिया-आधारित टीकों में। डीएनए- और आरएनए दोनों (यानी, इन विट्रो ट्रांसक्रिप्टेड मैसेंजर आरएनए, आईवीटी एमआरएनए) -आधारित टीके संक्रामक रोगों और कैंसर 2,3 सहित विभिन्न बीमारियों के खिलाफ चिकित्सीय क्षमता के लिए रोगनिरोधी प्रदर्शन करते हैं। सिद्धांत रूप में, न्यूक्लिक एसिड-आधारित टीकों की क्षमता उनके उत्पादन, प्रभावकारिता और सुरक्षा से संबंधितहै 4. इन टीकों को लागत प्रभावी, स्केलेबल और तेजी से उत्पादन की अनुमति देने के लिए सेल-मुक्त तरीके से निर्मित किया जा सकता है।
एक एकल न्यूक्लिक एसिड-आधारित टीका कई एंटीजन को एन्कोड कर सकता है, जिससे टीकाकरण की कम संख्या के साथ कई वायरल वेरिएंट या बैक्टीरिया के लक्ष्य को सक्षम किया जा सकता है और लचीला रोगजनकों 5,6 के खिलाफ प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को मजबूत किया जा सकता है। इसके अलावा, न्यूक्लिक एसिड-आधारित टीके वायरस या जीवाणु संक्रमण की प्राकृतिक आक्रमण प्रक्रिया की नकल कर सकते हैं, जिससे बी सेल- और टी सेल-मध्यस्थता प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाएं दोनों आती हैं। कुछ वायरस के विपरीत- या डीएनए-आधारित टीकों में, आईवीटी एमआरएनए-आधारित टीके सुरक्षा के मामले में एक बड़ा लाभ प्रदान करते हैं। वे साइटोसोल में वांछित एंटीजन को तेजी से व्यक्त कर सकते हैं और मेजबान जीनोम में एकीकृत नहीं होते हैं, सम्मिलन उत्परिवर्तन7 के बारे में चिंताओं को दूर करते हैं। सफल अनुवाद के बाद आईवीटी-एमआरएनए स्वचालित रूप से अपमानित हो जाता है, इसलिए इसकी प्रोटीन अभिव्यक्ति कैनेटीक्स को आसानी से 8,9 नियंत्रित किया जा सकता है। सीवियर एक्यूट रेस्पिरेटरी सिंड्रोम कोरोनावायरस 2 (सार्स-सीओवी-2) महामारी से प्रेरित, दुनिया भर में कंपनियों/संस्थानों के प्रयासों ने कई प्रकार के टीकों के बाजार में रिलीज को सक्षम किया है। आईवीटी एमआरएनए-आधारित वैक्सीन तकनीक बड़ी क्षमता दिखाती है और पहली बार, इसकी तेजी से डिजाइन और कई महीनों के भीतर किसी भी लक्ष्य एंटीजन के अनुकूल होने की लचीली क्षमता के कारण, इसकी पहले से प्रत्याशित सफलता का प्रदर्शन किया है। नैदानिक अनुप्रयोगों में कोविड-19 के खिलाफ आईवीटी एमआरएनए टीकों की सफलता ने न केवल आईवीटी एमआरएनए वैक्सीन अनुसंधान और विकास के एक नए युग की शुरुआत की, बल्कि संक्रामक रोगों के प्रकोप से निपटने के लिए प्रभावी टीकों के तेजी से विकास के लिए मूल्यवान अनुभव भी संचितकिया।
आईवीटी एमआरएनए टीकों की आशाजनक क्षमता के बावजूद, कार्रवाई की साइट (यानी, साइटोप्लाज्म) के लिए आईवीटी एमआरएनए की कुशल इंट्रासेल्युलर डिलीवरी एक बड़ी बाधा12 पैदा करना जारी रखती है, खासकर वायुमार्ग4 के माध्यम से प्रशासित लोगों के लिए। आईवीटी एमआरएनए स्वाभाविक रूप से एक अत्यंत कम आधा जीवन (~ 7 एच) 13 के साथ एक अस्थिर अणु है, जो आईवीटी एमआरएनए को सर्वव्यापी आरएनएएसई14 द्वारा गिरावट के लिए अत्यधिक प्रवण बनाता है। जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली के लिम्फोसाइट्स विवो अनुप्रयोग के मामलों में मान्यता प्राप्त आईवीटी एमआरएनए को घेर लेते हैं। इसके अलावा, आईवीटी एमआरएनए के उच्च नकारात्मक चार्ज घनत्व और बड़े आणविक भार (1 एक्स 104-1 एक्स 106 डीए) सेलुलर झिल्ली15 के आयनिक लिपिड बाइलेयर में इसके प्रभावी पारगम्यता को खराब करते हैं। इसलिए, आईवीटी एमआरएनए अणुओं के क्षरण को रोकने और सेलुलर अपटेक16 की सुविधा के लिए कुछ जैव-कार्यात्मक सामग्रियों के साथ एक वितरण प्रणाली की आवश्यकता होती है।
कुछ असाधारण मामलों के अलावा जिसमें नग्न आईवीटी एमआरएनए का उपयोग सीधे विवो जांच के लिए किया गया था, विभिन्न वितरण प्रणालियों का उपयोग आईवीटी एमआरएनए को कार्रवाई17,18 की चिकित्सीय साइट पर ले जाने के लिए किया जाता है। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि डिलीवरी सिस्टम19 की सहायता के बिना साइटोसोल में केवल कुछ आईवीटी एमआरएनए का पता लगाया जाता है। प्रोटामाइन संक्षेपण से लिपिड एनकैप्सुलेशन20 तक क्षेत्र में निरंतर प्रयासों के साथ आरएनए वितरण में सुधार के लिए कई रणनीतियां विकसित की गई हैं। लिपिड नैनोपार्टिकल्स (एलएनपी) एमआरएनए डिलीवरी वाहनों में सबसे नैदानिक रूप से उन्नत हैं, जैसा कि इस तथ्य से साबित होता है कि नैदानिक उपयोग के लिए सभी अनुमोदित एमआरएनए कोविड -19 टीके एलएनपी-आधारित वितरण प्रणालियोंको नियोजित करते हैं। हालांकि, एलएनपी प्रभावी एमआरएनए अभिकर्मक की मध्यस्थता नहीं कर सकते हैं जब योगों को श्वसन मार्ग22 के माध्यम से वितरित किया जाता है, जो श्लेष्म प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को प्रेरित करने या फुफ्फुसीय से संबंधित बीमारियों जैसे सिस्टिक फाइब्रोसिस या α1-एंटीट्रिप्सिन की कमी को संबोधित करने में इन योगों के आवेदन को उल्लेखनीय रूप से सीमित करता है। इसलिए, वायुमार्ग से संबंधित कोशिकाओं में आईवीटी एमआरएनए के कुशल वितरण और अभिकर्मक को सुविधाजनक बनाने के लिए एक उपन्यास वितरण प्रणाली विकसित करना इस अपूर्ण आवश्यकता को हल करने के लिए आवश्यक है।
यह पुष्टि की गई है कि पेप्टाइड-पोलोक्सामाइन स्व-इकट्ठे नैनोपार्टिकल (पीपी-एसएनपी) वितरण प्रणाली चूहों के श्वसन पथ में न्यूक्लिक एसिड के कुशल अभिकर्मक की मध्यस्थता कर सकतीहै 23. पीपी-एसएनपी एक बहुआयामी मॉड्यूलर डिजाइन दृष्टिकोण को गोद लेता है, जो तेजी से स्क्रीनिंग और अनुकूलन23 के लिए नैनोकणों में विभिन्न कार्यात्मक मॉड्यूल को एकीकृत कर सकता है। पीपी-एसएनपी के भीतर सिंथेटिक पेप्टाइड्स और विद्युत रूप से तटस्थ एम्फीफिलिक ब्लॉक कॉपोलिमर (पोलोक्सामाइन) एक कॉम्पैक्ट संरचना और चिकनी सतह23 के साथ समान रूप से वितरित नैनोकणों को उत्पन्न करने के लिए आईवीटी एमआरएनए के साथ अनायास बातचीत कर सकते हैं। पीपी-एसएनपी सुसंस्कृत कोशिकाओं में आईवीटी एमआरएनए अणुओं के जीन अभिकर्मक प्रभाव और चूहों के श्वसन पथ में सुधार कर सकताहै 23. वर्तमान अध्ययन में आईपीटी एमआरएनए युक्त पीपी-एसएनपी उत्पन्न करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है जो मेट्रिडिया ल्यूसिफेरेज़ (मेटलुक-एमआरएनए) (चित्रा 1) को एन्कोड करता है। माइक्रोफ्लुइडिक मिक्सिंग डिवाइस के माध्यम से नियंत्रित और तेजी से मिश्रण, जो कंपित हेरिंगबोन मिश्रण डिजाइन को नियोजित करता है, इस प्रोटोकॉल में उपयोग किया जाता है। प्रक्रिया निष्पादित करना आसान है और अधिक समान आकार के साथ पीपी-एसएनपी की पीढ़ी की अनुमति देता है। माइक्रोफ्लुइडिक मिक्सर का उपयोग करके पीपी-एसएनपी उत्पादन का सामान्य लक्ष्य एक अच्छी तरह से नियंत्रित तरीके से एमआरएनए जटिलता के लिए पीपी-एसएनपी बनाना है, इस प्रकार इन विट्रो में कुशल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य सेल अभिकर्मक की अनुमति देता है। वर्तमान प्रोटोकॉल मेटलुक-एमआरएनए युक्त पीपी-एसएनपी की तैयारी, असेंबली और लक्षण वर्णन का वर्णन करता है।

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	<tbody>
		<tr>
			<td>BamHI</td>
			<td>Takara</td>
			<td>1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cap 1 capping system</td>
			<td>Jinan</td>
			<td>M082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dendritic cell-line</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SCC142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA sequence</td>
			<td>Genescript</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human bronchial epithelial cells</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SCC150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KpnI</td>
			<td>Takara</td>
			<td>1068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LP</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium chloride</td>
			<td>APEXBio</td>
			<td>B6083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malvern Zetasizer Nano ZS90</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>NB007605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic chip</td>
			<td>ZHONGXINQIHENG</td>
			<td>Standard PDMS chip</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate readers</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Varioskan lux</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>ND-ONE-W (A30221)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudouridine</td>
			<td>APE&#215;Bio</td>
			<td>B7972</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quanti-Luc</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>Rep-qlc2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RiboRuler High Range RNA Ladder</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>SM1821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free conical tube</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BS-100-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium 1640</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C11875500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Chemyx</td>
			<td>Fusion 101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 transcription Kit</td>
			<td>Jinan</td>
			<td>E131</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient transfection of in vitro transcribed mrna in cultured cells using peptide-poloxamine nanoparticles

इन विट्रो ट्रांसक्रिप्टेड मैसेंजर आरएनए (एमआरएनए) टीकों ने कोरोनोवायरस रोग 2019 (सीओवीआईडी -19) महामारी के खिलाफ लड़ने में भारी क्षमता प्रदर्शित की है। एमआरएनए के नाजुक गुणों के कारण एमआरएनए टीकों में कुशल और सुरक्षित वितरण प्रणालियों को शामिल किया जाना चाहिए। एक स्व-इकट्ठे पेप्टाइड-पोलोक्सामाइन नैनोपार्टिकल (पीपी-एसएनपी) जीन वितरण प्रणाली विशेष रूप से न्यूक्लिक एसिड के फुफ्फुसीय वितरण के लिए डिज़ाइन की गई है और सफल एमआरएनए अभिकर्मक की मध्यस्थता में आशाजनक क्षमताओं को प्रदर्शित करती है। यहां, पीपी-एसएनपी तैयार करने के लिए एक बेहतर विधि का वर्णन यह बताने के लिए किया गया है कि पीपी-एसएनपी मेट्रिडिया ल्यूसिफेरेज़ (मेटलुक) एमआरएनए को कैसे समाहित करता है और सफलतापूर्वक सुसंस्कृत कोशिकाओं को स्थानांतरित करता है। मेटलुक-एमआरएनए एक रैखिक डीएनए टेम्पलेट से इन विट्रो प्रतिलेखन प्रक्रिया द्वारा प्राप्त किया जाता है। पोलोक्सामाइन को माइक्रोफ्लुइडिक मिक्सर का उपयोग करके एमआरएनए समाधान के साथ मिलाकर उत्पादित किया जाता है, जिससे पीपी-एसएनपी की आत्म-असेंबली की अनुमति मिलती है। पीपी-एसएनपी के चार्ज का मूल्यांकन बाद में जीटा क्षमता को मापकर किया जाता है। इस बीच, पीपी-एसएनपी नैनोकणों के पॉलीडिस्पर्सिटी और हाइड्रोडायनामिक आकार को गतिशील प्रकाश बिखरने का उपयोग करके मापा जाता है। पीपी-एसएनपी नैनोकणों को सुसंस्कृत कोशिकाओं में स्थानांतरित किया जाता है, और सेल संस्कृति से सतह पर तैरनेवालों को लूसिफेरेज़ गतिविधि के लिए परख किया जाता है। प्रतिनिधि परिणाम इन विट्रो अभिकर्मक के लिए अपनी क्षमता का प्रदर्शन करते हैं। यह प्रोटोकॉल अगली पीढ़ी के एमआरएनए वैक्सीन वितरण प्रणालियों को विकसित करने पर प्रकाश डाल सकता है।

पुनः संयोजक प्लास्मिड रैखिक डीएनए टेम्पलेट (चित्रा 2 ए) का उत्पादन करने के लिए पच गया था। वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, टी 7 इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन किट 20 μL प्रतिक्रिया प्रति अनकैप्...

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Efficient Transfection of In vitro Transcribed mRNA in Cultured Cells Using Peptide-Poloxamine Nanoparticles

इन विट्रो ट्रांसक्रिप्टेड मैसेंजर आरएनए को समाहित करने और वितरित करने के लिए एक माइक्रोफ्लुइडिक मिक्सिंग डिवाइस का उपयोग करके एक स्व-इकट्ठे पेप्टाइड-पोलोक्सामाइन नैनोपार्टिकल (पीपी-एसएनपी) विकसित किया गया है। वर्णित एमआरएनए / पीपी-एसएनपी इन विट्रो में सुसंस्कृत कोशिकाओं को कुशलतापूर्वक स्थानांतरित कर सकता है।

पेप्टाइड-पोलोक्सामाइन नैनोकणों का उपयोग करके सुसंस्कृत कोशिकाओं में इन विट्रो ट्रांसक्रिप्टेड एमआरएनए का कुशल अभिकर्मक

In vitro transcribed messenger RNA (mRNA) vaccines have displayed enormous potential in fighting against the coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic. ...

पेप्टाइड-पोलोक्सामाइन नैनोकणों संभावित फुफ्फुसीय एमआरएनए वितरण प्रणालियों में से एक है। हमारा प्रोटोकॉल पेप्टाइड-पोलोक्सामाइन नैनोकणों को उच्च उत्पादकता और दक्षता के साथ बनाता है, जो म्यूकोसल एमआरएनए वैक्सीन के विकास की सुविधा प्रदान करता है। तकनीक द्वारा आवश्यक सामग्री कम लागत वाली है, और प्रोटोकॉल को थोड़े समय में पूरा किया जा सकता है।पेप्टाइड-पोलोक्सामाइन नैनोकणों में कुशल एमआरएनए अभिकर्मक की मध्यस्थता करने की क्षमता होती है। पेप्टाइड-पोलोक्सामाइन नैनोकणों ने मानव ब्रोन्कियल उपकला कोशिकाओं में सफल एमआरएनए अभिकर्मक का प्रदर्शन किया, जो म्यूकोसल कोविड -19 टीकों, फेफड़ों के कैंसर के उपचार और सिस्टिक फाइब्रोसिस जीन थेरेपी के लिए अतिरिक्त अनुप्रयोगों को शामिल करता है। मुझे उम्मीद है कि व्यक्ति को संबंधित क्षेत्र में और प्रोटोकॉल और बहुत सारी तकनीकों के साथ कुछ बुनियादी ज्ञान होगा, इससे पहले कि वह प्रयोग करना शुरू कर दे।मेट्रिडिया लूसिफेरेज़ के खुले रीडिंग फ्रेम को संश्लेषित करने और इसे पीयूसी 57 वेक्टर में क्लोन करने के बाद, एक घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर बामएचआई और केपीएनआई का उपयोग करके एक रैखिक डीएनए टेम्पलेट तैयार करें। पांडुलिपि में वर्णित टी 7 प्रतिलेखन किट और स्यूडोरिडीन का उपयोग करके एमआरएनए संश्लेषण के लिए 20-माइक्रोलीटर वॉल्यूम की प्रतिक्रिया तैयार करें। घटकों को अच्छी तरह से मिलाएं और तीन घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।फिर, 50 माइक्रोग्राम अनकैप्ड आईवीटी एमआरएनए की माध्यमिक संरचना को 10 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करके हटा दें। आईवीटी एमआरएनए कैपिंग के लिए कैप 1 कैपिंग सिस्टम का उपयोग करें, और 30 से 60 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एस-एडेनोसिलमेथियोनीन और 2'ओ-मिथाइलट्रांसफेरेज़ का उपयोग करके 7-मिथाइलगुआनोसिन कैप संरचना को संशोधित करके कैप 1 तैयार करें। यूवी-दृश्य स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ कैप्ड आईवीटी एमआरएनए की एकाग्रता को मापें।एक आरएनए मार्कर का उपयोग करके, 18% फॉर्मलाडेहाइड युक्त 1% फॉर्मलाडेहाइड विकृत एगरोज जेल में कैप्ड आईवीटी एमआरएनए के आणविक आकार का विश्लेषण करें। न्यूक्लियस मुक्त पानी में टी 704 को घुलनशील करके पोलोक्सामाइन 704 के 10 मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर स्टॉक समाधान तैयार करें। न्यूक्लियस मुक्त पानी में पेप्टाइड को घुलनशील करके पेप्टाइड के 2 मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर स्टॉक समाधान तैयार करें।तैयार घोल को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। बर्फ पर आईवीटी एमआरएनए को पिघलाएं। ट्यूब खोलने से पहले, कमरे के तापमान पर तीन सेकंड के लिए 300 गुना जी पर ट्यूब अपकेंद्रित्र करें, और न्यूक्लीज मुक्त पानी के साथ आईवीटी एमआरएनए समाधान को पतला करें।टी 704 और सिंथेटिक पेप्टाइड मिश्रण समाधान को आठ माइक्रोग्राम प्रति माइक्रोलीटर एकाग्रता में पतला करके, और क्रमशः न्यूक्लियस मुक्त पानी के साथ 0.555 माइक्रोग्राम प्रति माइक्रोलीटर एकाग्रता के लिए सिंथेटिक पेप्टाइड समाधान तैयार करें। आगे उपयोग करने से पहले कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए मिश्रित समाधान सेते हैं। सिरिंज टिप में हवा के अंतराल या बुलबुले से परहेज करते हुए, आईवीटी एमआरएनए समाधान को एक मिलीलीटर सिरिंज में खींचें।घूर्णन ब्लॉक के बगल में कारतूस के एक तरफ सिरिंज लोड करें। फिर, टी 704 और सिंथेटिक पेप्टाइड मिश्रण समाधान के साथ एक मिलीलीटर सिरिंज भरें, और सिरिंज टिप पर किसी भी बुलबुले या हवा के अंतराल को हटा दें। सिरिंज को पंप के दूसरे इनलेट में रखें, और पंप को 4 से 10 मिलीलीटर प्रति मिनट की कुल प्रवाह दर के साथ सेट करें।मिश्रण डिवाइस के प्रवाह पथ के अंत में मिश्रित आईवीटी एमआरएनए / पीपी-एसएनपी समाधान एकत्र करने के लिए दस मिलीलीटर आरएनए-मुक्त शंक्वाकार ट्यूब रखें। मिश्रण शुरू करने के लिए पंप चलाएं, यह सुनिश्चित करते हुए कि पैरामीटर सही ढंग से इनपुट हैं। छह सेकंड के लिए पंप चलाने के बाद, शंक्वाकार ट्यूब से आईवीटी एमआरएनए / पीपी-एसएनपी नमूना एकत्र करें।अभिकर्मक से 24 घंटे पहले 96-अच्छी तरह से प्लेटों में प्लेट मानव ब्रोन्कियल उपकला कोशिकाओं और एक डेंड्राइटिक सेल लाइन। 10% गर्मी-निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम और 1% पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक एक संस्कृति माध्यम में कोशिकाओं को बढ़ाएं। विकास माध्यम को हटाने के बाद, अच्छी तरह से पीबीएस प्रति 0.2 मिलीलीटर के साथ चढ़ाया कोशिकाओं धो लें।मढ़वाया सेल संस्कृतियों युक्त प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए सीरम मुक्त संस्कृति माध्यम के 170 माइक्रोलीटर जोड़ें। पीपी-एसएनपी फॉर्मूलेशन के 30 माइक्रोलीटर जोड़ें जिसमें 0.4 माइक्रोग्राम मेट्रिडिया ल्यूसिफेरेज़ एमआरएनए ड्रॉप वार प्रत्येक कुएं में शामिल हैं। चार घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर आर्द्र 5% कार्बन डाइऑक्साइड समृद्ध वातावरण में आईवीटी एमआरएनए / पीपी-एसएनपी फॉर्मूलेशन के साथ कोशिकाओं को सेते हैं।अभिकर्मक माध्यम की आकांक्षा करें और 10% गर्मी-निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम और 1% पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक ताजा संस्कृति माध्यम के 0.2 मिलीलीटर जोड़ें। 24 घंटे के लिए ट्रांसफेक्टेड कोशिकाओं सेते हैं जैसा कि पहले दिखाया गया है और प्रत्येक कुएं से पता लगाने के लिए सतह पर तैरनेवालों को इकट्ठा करें। कोएलेंटेराज़िन सब्सट्रेट में पीबीएस जोड़कर एक ताजा परख समाधान तैयार करें।10 सेकंड के लिए भंवर द्वारा समाधान को अच्छी तरह से मिलाएं। एक 96 अच्छी तरह से प्लेट करने के लिए एकत्र सतह पर तैरनेवाला के 50 माइक्रोलीटर जोड़ें। 1, 000 मिलीसेकंड के पढ़ने के समय के साथ माइक्रोप्लेट रीडर सेट करें और मैन्युअल रूप से या स्वचालित इंजेक्शन द्वारा प्रत्येक कुएं में कोलेंटेराज़िन समाधान के 30 माइक्रोलीटर जोड़ें।सतह पर तैरनेवाला करने के लिए कोएलेंटेराज़िन समाधान जोड़ने के तुरंत बाद, ल्यूमिनेसेंस सिग्नल को मापने के लिए स्टार्ट पर क्लिक करें। पुनः संयोजक प्लास्मिड को रैखिक डीएनए टेम्पलेट का उत्पादन करने के लिए अलग और पचाया गया था। इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन ने अपकैप्ड और कैप्ड मेटलुक एमआरएनए का उत्पादन किया।पीपी-एसएनपी से संक्रमित कोशिकाओं ने व्यावसायिक रूप से उपलब्ध लिपिड-आधारित अभिकर्मक अभिकर्मक, नग्न मेट्रिडिया ल्यूसिफेरेज़ एमआरएनए, पीबीएस, या टी 7044 सिंथेटिक पेप्टाइड्स, मानव ब्रोन्कियल उपकला कोशिकाओं में मिश्रित समाधान, 16 एचबीई और डेंड्राइटिक सेल लाइन डीसी 2.4 मेट्रिडिया ल्यूसिफेरेज़ से संक्रमित लोगों की तुलना में ल्यूसिफेरेज़ की काफी अधिक अभिव्यक्ति प्रदर्शित की गिरावट के खिलाफ मेटलुक एमआरएनए की रक्षा करना और बहिर्जात मेट्रिडिया ल्यूसिफेरेज़ एमआरएनए की अभिकर्मक दक्षता को बढ़ावा देना। कृपया सुनिश्चित करें कि अनकैप्ड मेट-एमआरएनए की सिंथेटिक संरचना सफलतापूर्वक हटा दी गई है। पोलोक्सामाइन नैनोकणों को तैयार करने और कॉम्पैक्ट करने के लिए मेट-एमआरएनए टी 704 और पेप्टाइड यौगिक को सावधानीपूर्वक गणना और डाउनलोड करें।पेप्टाइड-पोलोक्सामाइन नैनोकणों की आकृति विज्ञान का निरीक्षण करने के लिए ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी किया जा सकता है। यह तकनीक शोधकर्ताओं को म्यूकोसल एमआरएनए टीके विकसित करने और प्रत्येक संबंधित कोशिकाओं के लिए जीन थेरेपी योगों की उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग को सक्षम करने में मदद करती है।

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Efficient Transfection of In vitro Transcribed mRNA in Cultured Cells Using Peptide-Poloxamine Nanoparticles

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

माउस टी कोशिकाओं में टी सेल रिसेप्टर्स की रेट्रोवायरल transduction

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

V3 के एचआईवी -1 tropism के genotypic निष्कर्ष का प्रयोग जनसंख्या आधारित अनुक्रमण

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Seven Steps to Stellate Cells

सात कदम कक्ष तारामय

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

सेल परिपक्वता के बिना वृक्ष के समान कोशिकाओं के कुशल अभिकर्मक के लिए अनुकूलित प्रोटोकॉल

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

मात्रात्मक<em&gt; इन विट्रो में</emस्टेटिक शर्तों के तहत सक्रिय प्राथमिक मानव microvascular endothelial कोशिकाओं को न्युट्रोफिल आसंजन उपाय&gt; परख

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

कल्पना और quantitate फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उपयोग<em&gt; क्लैमाइडिया</em&gt; रिक्तिका विकास की गतिशीलता जीवित कोशिकाओं में

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

कुशल के लिए खूनी कृत्रिम एंटीजन पेश कोशिकाओं (KaAPC)<em&gt; इन विट्रो</em&gt; मानव प्रतिजन विशेष टी कोशिकाओं की कमी

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Nucleofection द्वारा मानव THP-1 मैक्रोफेज की अत्यधिक कुशल अभिकर्मक

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

टी कोशिकाओं की व्युत्पत्ति<em&gt; इन विट्रो</em&gt; माउस भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं से

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...