Name: efficient transfection of in vitro transcribed mrna in cultured cells using peptide-poloxamine nanoparticles
Uploaded: 2022-08-17T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Transfection of In vitro Transcribed mRNA in Cultured Cells Using Peptide-Poloxamine Nanoparticles at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (NSFC, Grant No. 82041045 and 82173764), dal grande progetto di Study on Pathogenesis and Epidemic Prevention Technology System (2021YFC2302500) del Ministero della Scienza e della Tecnologia della Cina, dal Chongqing Talents: Exceptional Young Talents Project (CQYC202005027) e dalla Natural Science Foundation di Chongqing (cstc2021jcyj-msxmX0136). Gli autori sono grati al Dr. Xiaoyan Ding per aver misurato il diametro idrodinamico (nm) e l'indice di polidispersità (PDI).

1. Trascrizione in vitro di mRNA chimicamente modificato
NOTA: È necessario utilizzare tubi privi di nucleasi, reagenti, vetreria, punte per pipette, ecc., perché le RNasi sono onnipresenti nell'ambiente, come soluzioni di laboratorio, superfici di strumenti, capelli, pelle, polvere, ecc. Pulire accuratamente le superfici del banco e le pipette prima dell'uso e indossare guanti per evitare la contaminazione da RNasi.
<ol><li>Eseguire la linearizzazione del modello...

<ol>
	<li>Nature milestones in vaccines. Springer Nature Available from: <a target="_blank" href="https://www.nature.com/collections/hcajdiajij">https://www.nature.com/collections/hcajdiajij</a> (2020)</li><li>Barbier, A. J., Jiang, A. Y., Zhang, P., Wooster, R., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+progress+of+mRNA+vaccines+and+immunotherapies.">The clinical progress of mRNA vaccines and immunotherapies.</a> Nature Biotechnology. 40 (6), 840-854 (2022).</li><li>Mulligan, M. 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Il protocollo qui descritto non solo consente la produzione economica e rapida di formulazioni di vaccini mRNA IVT con proprietà definite, ma offre anche la possibilità di personalizzare la formulazione PP-sNp in base a specifici scopi terapeutici, come la terapia genica. Al fine di garantire il successo della generazione di mRNA / PP-sNp IVT, si suggerisce di prestare particolare attenzione ad alcuni passaggi critici. Quando si lavora con l'mRNA, ricordare sempre che le condizioni libere da RNasi devono essere mantenu...

La vaccinazione è stata annunciata come uno degli interventi medici più efficaci per ridurre la morbilità e la mortalità causate da malattie infettive1. L'importanza dei vaccini è stata dimostrata dallo scoppio della malattia da coronavirus 2019 (COVID-19). A differenza del concetto tradizionale di iniezione di agenti patogeni inattivati o vivi attenuati, gli approcci vaccinali all'avanguardia, come i vaccini a base di acidi nucleici, si concentrano sulla conservazione delle proprietà immunostimolatorie dei patogeni bersaglio, evitando i potenziali problemi di sicurezza associati ai vaccini convenzionali a base di virus interi o batteri. Sia i vaccini basati sul DNA che sull'RNA (cioè l'RNA messaggero trascritto in vitro, l'mRNA IVT) mostrano un potenziale profilattico terapeutico contro una varietà di malattie, comprese le malattie infettive e i tumori 2,3. In linea di principio, il potenziale dei vaccini a base di acidi nucleici si riferisce alla loro produzione, efficacia e sicurezza4. Questi vaccini possono essere prodotti in modo privo di cellule per consentire una produzione economica, scalabile e rapida.
Un singolo vaccino a base di acido nucleico può codificare più antigeni, consentendo il bersaglio di numerose varianti virali o batteri con un numero ridotto di inoculazioni e rafforzando la risposta immunitaria contro i patogeni resilienti 5,6. Inoltre, i vaccini a base di acidi nucleici potrebbero imitare il naturale processo di invasione del virus o dell'infezione batterica, portando risposte immunitarie mediate da cellule B e cellule T. A differenza di alcuni vaccini basati su virus o DNA, i vaccini basati su mRNA IVT offrono un enorme vantaggio in termini di sicurezza. Possono esprimere rapidamente l'antigene desiderato nel citosol e non sono integrati nel genoma ospite, ovviando alle preoccupazioni sulla mutagenesi inserzionale7. IVT-mRNA viene automaticamente degradato dopo una traduzione riuscita, quindi la sua cinetica di espressione proteica può essere facilmente controllata 8,9. Catalizzata dalla pandemia di sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2), gli sforzi di aziende / istituzioni di tutto il mondo hanno permesso il rilascio sul mercato di molti tipi di vaccini. La tecnologia dei vaccini basati su mRNA IVT mostra un grande potenziale e, per la prima volta, ha dimostrato il successo precedentemente previsto, grazie alla sua rapida progettazione e alla capacità flessibile di adattarsi a qualsiasi antigene bersaglio entro diversi mesi. Il successo dei vaccini mRNA IVT contro COVID-19 nelle applicazioni cliniche non solo ha aperto una nuova era di ricerca e sviluppo del vaccino mRNA IVT, ma ha anche accumulato una preziosa esperienza per il rapido sviluppo di vaccini efficaci per affrontare epidemie di malattie infettive10,11.
Nonostante il potenziale promettente dei vaccini mRNA IVT, l'efficiente consegna intracellulare di mRNA IVT al sito d'azione (cioè citoplasma) continua a rappresentare un ostacolo importante12, specialmente per quelli somministrati attraverso le vie aeree4. L'mRNA IVT è intrinsecamente una molecola instabile con un'emivita estremamente breve (~7 h)13, che rende l'mRNA IVT altamente incline alla degradazione da parte dell'ubiquitaria RNasi14. I linfociti del sistema immunitario innato tendono a fagocitare l'mRNA IVT riconosciuto nei casi di applicazione in vivo . Inoltre, l'elevata densità di carica negativa e il grande peso molecolare (1 x 104-1 x 106 Da) dell'mRNA IVT compromettono la sua permeazione efficace attraverso il doppio strato lipidico anionico delle membrane cellulari15. Pertanto, è necessario un sistema di rilascio con determinati materiali biofunzionali per inibire la degradazione delle molecole di mRNA IVT e facilitare l'assorbimento cellulare16.
A parte alcuni casi eccezionali in cui l'mRNA IVT nudo è stato utilizzato direttamente per indagini in vivo, vari sistemi di rilascio sono utilizzati per trasportare l'mRNA IVT al sito terapeutico di azione17,18. Studi precedenti hanno rivelato che solo pochi mRNA IVT sono rilevati nel citosol senza l'assistenza di un sistema di consegna19. Sono state sviluppate numerose strategie per migliorare il rilascio dell'RNA con continui sforzi sul campo, che vanno dalla condensazione della protamina all'incapsulamento lipidico20. Le nanoparticelle lipidiche (LNP) sono le più clinicamente avanzate tra i veicoli di rilascio di mRNA, come dimostrato dal fatto che tutti i vaccini mRNA COVID-19 approvati per uso clinico impiegano sistemi di rilascio basati su LNP21. Tuttavia, le LNP non possono mediare un'efficace trasfezione di mRNA quando le formulazioni vengono somministrate attraverso la via respiratoria22, il che limita notevolmente l'applicazione di queste formulazioni nell'indurre risposte immunitarie della mucosa o nell'affrontare malattie polmonari come la fibrosi cistica o il deficit di α1-antitripsina. Pertanto, è necessario sviluppare un nuovo sistema di consegna per facilitare la consegna efficiente e la trasfezione dell'mRNA IVT nelle cellule correlate alle vie aeree per risolvere questo bisogno insoddisfatto.
È stato confermato che il sistema di rilascio di nanoparticelle autoassemblate peptide-poloxamina (PP-sNp) può mediare l'efficiente trasfezione degli acidi nucleici nel tratto respiratorio dei topi23. Il PP-sNp adotta un approccio di progettazione modulare multifunzionale, che può integrare diversi moduli funzionali nelle nanoparticelle per uno screening e un'ottimizzazione rapidi23. I peptidi sintetici e i copolimeri a blocchi anfifilici elettricamente neutri (poloxamina) all'interno del PP-sNp possono interagire spontaneamente con l'mRNA IVT per generare nanoparticelle uniformemente distribuite con una struttura compatta e una superficie liscia23. PP-sNp può migliorare l'effetto di trasfezione genica delle molecole di mRNA IVT nelle cellule in coltura e nel tratto respiratorio dei topi23. Il presente studio descrive un protocollo per la generazione di PP-sNp contenente mRNA IVT che codifica per Metridia luciferasi (MetLuc-mRNA) (Figura 1). In questo protocollo viene utilizzata una miscelazione controllata e rapida tramite un dispositivo di miscelazione microfluidica, che impiega il design di miscelazione a spina di pesce sfalsata. La procedura è facile da eseguire e consente la generazione di PP-sNp con dimensioni più uniformi. L'obiettivo generale della produzione di PP-sNp utilizzando il miscelatore microfluidico è quello di creare PP-sNp per la complessazione dell'mRNA in modo ben controllato, consentendo così una trasfezione cellulare efficiente e riproducibile in vitro. Il presente protocollo descrive la preparazione, l'assemblaggio e la caratterizzazione di PP-sNp contenente MetLuc-mRNA.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BamHI</td>
			<td>Takara</td>
			<td>1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cap 1 capping system</td>
			<td>Jinan</td>
			<td>M082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dendritic cell-line</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SCC142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA sequence</td>
			<td>Genescript</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human bronchial epithelial cells</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SCC150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KpnI</td>
			<td>Takara</td>
			<td>1068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LP</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium chloride</td>
			<td>APEXBio</td>
			<td>B6083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malvern Zetasizer Nano ZS90</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>NB007605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic chip</td>
			<td>ZHONGXINQIHENG</td>
			<td>Standard PDMS chip</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate readers</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Varioskan lux</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>ND-ONE-W (A30221)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudouridine</td>
			<td>APE&#215;Bio</td>
			<td>B7972</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quanti-Luc</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>Rep-qlc2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RiboRuler High Range RNA Ladder</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>SM1821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free conical tube</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BS-100-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium 1640</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C11875500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Chemyx</td>
			<td>Fusion 101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 transcription Kit</td>
			<td>Jinan</td>
			<td>E131</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient transfection of in vitro transcribed mrna in cultured cells using peptide-poloxamine nanoparticles

I vaccini a RNA messaggero trascritto in vitro (mRNA) hanno mostrato un enorme potenziale nella lotta contro la pandemia di coronavirus 2019 (COVID-19). Sistemi di somministrazione efficienti e sicuri devono essere inclusi nei vaccini mRNA a causa delle fragili proprietà dell'mRNA. Un sistema di rilascio genico autoassemblato di nanoparticelle peptide-poloxamina (PP-sNp) è specificamente progettato per la consegna polmonare di acidi nucleici e mostra capacità promettenti nel mediare la trasfezione di mRNA di successo. Qui, viene descritto un metodo migliorato per preparare PP-sNp per elaborare come il PP-sNp incapsula l'mRNA della Metridia luciferasi (MetLuc) e trasfetta con successo le cellule in coltura. L'mRNA MetLuc è ottenuto mediante un processo di trascrizione in vitro da un modello lineare di DNA. Un PP-sNp viene prodotto mescolando peptide sintetico / poloxamina con soluzione di mRNA utilizzando un miscelatore microfluidico, consentendo l'auto-assemblaggio di PP-sNp. La carica di PP-sNp viene successivamente valutata misurando il potenziale zeta. Nel frattempo, la polidispersità e la dimensione idrodinamica delle nanoparticelle di PP-sNp vengono misurate utilizzando la diffusione dinamica della luce. Le nanoparticelle di mRNA/PP-sNp vengono trasfettate in cellule in coltura e i surnatanti della coltura cellulare vengono analizzati per l'attività della luciferasi. I risultati rappresentativi dimostrano la loro capacità di trasfezione in vitro. Questo protocollo potrebbe far luce sullo sviluppo di sistemi di rilascio del vaccino mRNA di prossima generazione.

Il plasmide ricombinante è stato digerito per produrre il modello di DNA linearizzato (Figura 2A). Utilizzando il protocollo descritto, il kit di trascrizione in vitro T7 può produrre fino a 80-120 μg di MetLuc-mRNA senza cappuccio per reazione di 20 μL e 50-60 μg di MetLuc-mRNA limitato per 100 μL di reazione. Quando analizzato con elettroforesi, l'mRNA MetLuc intatto con alta qualità dovrebbe mostrare una banda singola e chiara, come mostrato in Figura ...

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Efficient Transfection of In vitro Transcribed mRNA in Cultured Cells Using Peptide-Poloxamine Nanoparticles

Una nanoparticella peptide-poloxamina autoassemblata (PP-sNp) viene sviluppata utilizzando un dispositivo di miscelazione microfluidica per incapsulare e fornire RNA messaggero trascritto in vitro . L'mRNA/PP-sNp descritto potrebbe trasfettare efficacemente le cellule in coltura in vitro.

Trasfezione efficiente di mRNA trascritto in vitro in cellule in coltura utilizzando nanoparticelle peptide-poloxamina

In vitro transcribed messenger RNA (mRNA) vaccines have displayed enormous potential in fighting against the coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic. ...

Le nanoparticelle peptide-poloxamina sono uno dei potenziali sistemi di rilascio di mRNA polmonare. Il nostro protocollo rende le nanoparticelle peptide-poloxamina con maggiore produttività ed efficienza, che facilita lo sviluppo del vaccino mRNA della mucosa. I materiali richiesti dalla tecnica sono a basso costo e il protocollo può essere completato in breve tempo.Le nanoparticelle peptide-poloxamina hanno la capacità di mediare un'efficiente trasfezione dell'mRNA. Le nanoparticelle peptide-poloxamina hanno mostrato una trasfezione di mRNA di successo nelle cellule epiteliali bronchiali umane, che implica ulteriori applicazioni per i vaccini COVID-19 della mucosa, il trattamento dei tumori polmonari e la terapia genica della fibrosi cistica. Mi aspetto che l'individuo abbia alcune conoscenze di base in un campo correlato e con il protocollo e molte delle tecniche, prima di iniziare a eseguire gli esperimenti.Dopo aver sintetizzato il frame di lettura aperto di Metridia luciferasi e clonato nel vettore pUC57, preparare un modello di DNA linearizzato usando BamHI e KpnI a 37 gradi Celsius per un'ora. Preparare una reazione di 20 microlitri di volume per la sintesi dell'mRNA usando un kit di trascrizione T7 e pseudouridina come descritto nel manoscritto. Mescolare accuratamente i componenti e incubare a 37 gradi Celsius per tre ore.Quindi, rimuovere la struttura secondaria di 50 microgrammi di mRNA IVT senza cappuccio riscaldandolo a 65 gradi Celsius per 10 minuti. Utilizzare il sistema di tappatura Cap 1 per il capping dell'mRNA IVT e preparare Cap 1 modificando la struttura del cappuccio 7-metilguanosina utilizzando S-adenosilmetionina e 2'O-metiltransferasi a 37 gradi Celsius per 30-60 minuti. Misurare la concentrazione di mRNA IVT limitato con uno spettrofotometro UV-visibile.Utilizzando un marcatore di RNA, analizzare la dimensione molecolare dell'mRNA IVT rivestito in un gel di agarosio denaturante all'1% di formaldeide contenente il 18% di formaldeide. Preparare 10 milligrammi per millilitro di soluzione madre di poloxamina 704 solubilizzando il T704 in acqua priva di nucleasi. Preparare 2 milligrammi per millilitro di soluzione madre del peptide solubilizzando il peptide in acqua priva di nucleasi.Conservare la soluzione preparata a 4 gradi Celsius. Scongelare l'mRNA IVT sul ghiaccio. Prima di aprire il tubo, centrifugare il tubo a 300 volte G per tre secondi a temperatura ambiente e diluire la soluzione di mRNA IVT con acqua priva di nucleasi.Preparare T704 e la soluzione di miscela di peptidi sintetici diluendo la soluzione di T704 a otto microgrammi per concentrazione di microlitro e la soluzione peptidica sintetica a 0,555 microgrammi per concentrazione di microlitro, rispettivamente con acqua priva di nucleasi. Incubare la soluzione miscelata per 15 minuti a temperatura ambiente prima di un ulteriore utilizzo. Aspirare la soluzione di mRNA IVT in una siringa da un millilitro, evitando vuoti d'aria o bolle nella punta della siringa.Caricare la siringa in un lato della cartuccia accanto al blocco rotante. Quindi, riempire una siringa da un millilitro con T704 e soluzione di miscela di peptidi sintetici e rimuovere eventuali bolle o vuoti d'aria sulla punta della siringa. Posizionare la siringa nell'altro ingresso della pompa e impostare la pompa con una portata totale da 4 a 10 millilitri al minuto.Posizionare un tubo conico privo di RNasi da dieci millilitri per raccogliere la soluzione mista di mRNA/PP-sNp IVT alla fine del percorso di flusso del dispositivo di miscelazione. Far funzionare la pompa per avviare la miscelazione, assicurandosi che i parametri siano inseriti correttamente. Dopo aver fatto funzionare la pompa per sei secondi, raccogliere il campione di mRNA/PP-sNp IVT dal tubo conico.Placcare le cellule epiteliali bronchiali umane e una linea cellulare dendritica in piastre a 96 pozzetti 24 ore prima della trasfezione. Coltivare le cellule in un terreno di coltura integrato con il 10% di siero fetale bovino inattivato dal calore e l'1% di streptomicina penicillina. Dopo aver rimosso il mezzo di crescita, lavare le celle placcate con 0,2 millilitri per pozzetto PBS.Aggiungere 170 microlitri di terreno di coltura senza siero a ciascun pozzetto contenente le colture cellulari placcate. Quindi, aggiungere 30 microlitri di formulazione di mRNA / PP-sNp IVT contenente 0,4 microgrammi di mRNA di Metridia luciferasi goccia saggiamente in ciascun pozzetto. Incubare le cellule con la formulazione IVT mRNA/PP-sNp in un'atmosfera umidificata arricchita di anidride carbonica al 5% a 37 gradi Celsius per quattro ore.Aspirare il mezzo di trasfezione e aggiungere 0,2 millilitri di terreno di coltura fresco integrato con il 10% di siero fetale bovino inattivato dal calore e l'1% di streptomicina penicillina. Incubare le cellule trasfettate per 24 ore come dimostrato in precedenza e raccogliere i surnatanti da rilevare da ciascun pozzetto. Preparare una nuova soluzione di dosaggio aggiungendo PBS al substrato della celenterazina.Mescolare accuratamente la soluzione vorticando per 10 secondi. Aggiungere 50 microlitri del surnatante raccolto a una piastra da 96 pozzetti. Impostare il lettore di micropiastre con un tempo di lettura di 1.000 millisecondi e aggiungere 30 microlitri di soluzione di celenterazina a ciascun pozzetto manualmente o mediante iniezione automatica.Immediatamente dopo aver aggiunto la soluzione di celenterazina al surnatante, fare clic su Start per misurare il segnale di luminescenza. Il plasmide ricombinante è stato isolato e digerito per produrre il modello di DNA linearizzato. La trascrizione in vitro ha prodotto mRNA MetLuc upcapped e capped.Le cellule trasfettate con mRNA/PP-sNp di Metridia luciferasi hanno mostrato un'espressione significativamente più elevata di luciferasi rispetto a quelle trasfettate con reagente di trasfezione a base lipidica disponibile in commercio, mRNA nudo di Metridia luciferasi, PBS o peptidi sintetici T7044, soluzione mista in cellule epiteliali bronchiali umane, 16 HBE e linea cellulare dendritica DC2.4 Metridia luciferasi mRNA/PP-sNp ha mostrato un'espressione di luciferasi più elevata rispetto a LP.suggerendo che il sistema di rilascio di PP-sNp è importante per proteggere l'mRNA MetLuc dalla degradazione e promuovere l'efficienza di trasfezione dell'mRNA esogeno della Metridia luciferasi. Assicurati che la struttura sintetica del Met-mRNA senza cappuccio sia stata rimossa con successo. Calcola e scarica attentamente il Met-mRNA T704 e il composto peptidico per preparare e compattare le nanoparticelle di poloxamina.La microscopia elettronica a trasmissione può essere eseguita per osservare la morfologia delle nanoparticelle peptide-poloxamina. Questa tecnica aiuta i ricercatori a sviluppare vaccini mRNA della mucosa e consentire lo screening ad alto rendimento delle formulazioni di terapia genica per ogni cellula correlata.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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