Name: efficient transfection of in vitro transcribed mrna in cultured cells using peptide-poloxamine nanoparticles
Uploaded: 2022-08-17T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Transfection of In vitro Transcribed mRNA in Cultured Cells Using Peptide-Poloxamine Nanoparticles at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (NSFC, Grant No. 82041045 og 82173764), hovedprosjektet i Study on Pathogenesis and Epidemic Prevention Technology System (2021YFC2302500) av departementet for vitenskap og teknologi i Kina, Chongqing Talents: Exceptional Young Talents Project (CQYC202005027), og Natural Science Foundation of Chongqing (cstc2021jcyj-msxmX0136). Forfatterne er takknemlige for Dr. Xiaoyan Ding for å måle hydrodynamisk diameter (nm) og polydispersitetsindeks (PDI).

1. In vitro transkripsjon av kjemisk modifisert mRNA
MERK: Det kreves å bruke nukleasfrie rør, reagenser, glassvarer, pipettespisser, etc., fordi RNaser er allestedsnærværende i miljøet, for eksempel laboratorieløsninger, instrumentflater, hår, hud, støv, etc. Rengjør benkflatene og pipettene grundig før bruk, og bruk hansker for å unngå RNase-forurensning.
<ol><li>Utfør linearisering av DNA-malen.<ol><li>Syntetiser den åpne leserammen (ORF) av Metridi...

<ol>
	<li>Nature milestones in vaccines. Springer Nature Available from: <a target="_blank" href="https://www.nature.com/collections/hcajdiajij">https://www.nature.com/collections/hcajdiajij</a> (2020)</li><li>Barbier, A. J., Jiang, A. Y., Zhang, P., Wooster, R., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+progress+of+mRNA+vaccines+and+immunotherapies.">The clinical progress of mRNA vaccines and immunotherapies.</a> Nature Biotechnology. 40 (6), 840-854 (2022).</li><li>Mulligan, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+I/II+study+of+COVID-19+RNA+vaccine+BNT162b1+in+adults.">Phase I/II study of COVID-19 RNA vaccine BNT162b1 in adults.</a> Nature. 586 (7830), 589-593 (2020).</li><li>Tang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotechnologies+in+delivery+of+DNA+and+mRNA+vaccines+to+the+nasal+and+pulmonary+mucosa.">Nanotechnologies in delivery of DNA and mRNA vaccines to the nasal and pulmonary mucosa.</a> Nanomaterials. 12 (2), 226 (2022).</li><li>Freyn, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multi-targeting,+nucleoside-modified+mRNA+influenza+virus+vaccine+provides+broad+protection+in+mice.">A multi-targeting, nucleoside-modified mRNA influenza virus vaccine provides broad protection in mice.</a> Molecular Therapy. 28 (7), 1569-1584 (2020).</li><li>Wu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variant+SARS-CoV-2+mRNA+vaccines+confer+broad+neutralization+as+primary+or+booster+series+in+mice.">Variant SARS-CoV-2 mRNA vaccines confer broad neutralization as primary or booster series in mice.</a> Vaccine. 39 (51), 7394-7400 (2021).</li><li>Chaudhary, N., Weissman, D., Whitehead, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+vaccines+for+infectious+diseases:+Principles,+delivery+and+clinical+translation.">mRNA vaccines for infectious diseases: Principles, delivery and clinical translation.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 20, 817-838 (2021).</li><li>Kormann, M. S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+therapeutic+proteins+after+delivery+of+chemically+modified+mRNA+in+mice.">Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice.</a> Nature Biotechnology. 29 (2), 154-157 (2011).</li><li>Tavernier, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+as+gene+therapeutic:+How+to+control+protein+expression.">mRNA as gene therapeutic: How to control protein expression.</a> Journal of Controlled Release. 150 (3), 238-247 (2011).</li><li>Walsh, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+immunogenicity+of+two+RNA-based+Covid-19+vaccine+candidates.">Safety and immunogenicity of two RNA-based Covid-19 vaccine candidates.</a> The New England Journal of Medicine. 383 (25), 2439-2450 (2020).</li><li>Baden, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+safety+of+the+mRNA-1273+SARS-CoV-2+vaccine.">Efficacy and safety of the mRNA-1273 SARS-CoV-2 vaccine.</a> The New England Journal of Medicine. 384 (5), 403-416 (2021).</li><li>Guan, S., Rosenecker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotechnologies+in+delivery+of+mRNA+therapeutics+using+nonviral+vector-based+delivery+systems.">Nanotechnologies in delivery of mRNA therapeutics using nonviral vector-based delivery systems.</a> Gene Therapy. 24 (3), 133-143 (2017).</li><li>Sharova, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Database+for+mRNA+half-life+of+19+977+genes+obtained+by+DNA+microarray+analysis+of+pluripotent+and+differentiating+mouse+embryonic+stem+cells.">Database for mRNA half-life of 19 977 genes obtained by DNA microarray analysis of pluripotent and differentiating mouse embryonic stem cells.</a> DNA Research. 16 (1), 45-58 (2009).</li><li>Houseley, J., Tollervey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+many+pathways+of+RNA+degradation.">The many pathways of RNA degradation.</a> Cell. 136 (4), 763-776 (2009).</li><li>Kowalski, P. S., Rudra, A., Miao, L., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivering+the+messenger:+Advances+in+technologies+for+therapeutic+mRNA+delivery.">Delivering the messenger: Advances in technologies for therapeutic mRNA delivery.</a> Molecular Therapy. 27 (4), 710-728 (2019).</li><li>Sahin, U., Karik&#243;, K., T&#252;reci, &. #. 2. 1. 4. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MRNA-based+therapeutics-developing+a+new+class+of+drugs.">MRNA-based therapeutics-developing a new class of drugs.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 13, 359-380 (2014).</li><li>Hajj, K. A., Whitehead, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+translation:+Non-viral+materials+for+therapeutic+mRNA+delivery.">Tools for translation: Non-viral materials for therapeutic mRNA delivery.</a> Nature Reviews Materials. 2, 17056 (2017).</li><li>Deering, R. P., Kommareddy, S., Ulmer, J. B., Brito, L. A., Geall, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+acid+vaccines:+Prospects+for+non-viral+delivery+of+mRNA+vaccines.">Nucleic acid vaccines: Prospects for non-viral delivery of mRNA vaccines.</a> Expert Opinion on Drug Delivery. 11 (6), 885-899 (2014).</li><li>Wadhwa, A., Aljabbari, A., Lokras, A., Foged, C., Thakur, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opportunities+and+challenges+in+the+delivery+of+mRNA-based+vaccines.">Opportunities and challenges in the delivery of mRNA-based vaccines.</a> Pharmaceutics. 12 (2), 102 (2020).</li><li>Hou, X., Zaks, T., Langer, R., Dong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+nanoparticles+for+mRNA+delivery.">Lipid nanoparticles for mRNA delivery.</a> Nature Reviews Materials. 6 (12), 1078-1094 (2021).</li><li>Sahin, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COVID-19+vaccine+BNT162b1+elicits+human+antibody+and+T(H)1+T+cell+responses.">COVID-19 vaccine BNT162b1 elicits human antibody and T(H)1 T cell responses.</a> Nature. 586 (7830), 594-599 (2020).</li><li>Azzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+immune+response+in+BNT162b2+COVID-19+vaccine+recipients.">Mucosal immune response in BNT162b2 COVID-19 vaccine recipients.</a> EBioMedicine. 75, 103788 (2022).</li><li>Guan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+peptide-poloxamine+nanoparticles+enable+in+vitro+and+in+vivo+genome+restoration+for+cystic+fibrosis.">Self-assembled peptide-poloxamine nanoparticles enable in vitro and in vivo genome restoration for cystic fibrosis.</a> Nature Nanotechnology. 14 (3), 287-297 (2019).</li><li>Pitard, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negatively+charged+self-assembling+DNA/poloxamine+nanospheres+for+in+vivo+gene+transfer.">Negatively charged self-assembling DNA/poloxamine nanospheres for in vivo gene transfer.</a> Nucleic Acids Research. 32 (20), 159 (2004).</li><li>Hiroi, T., Shibayama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+particle+size+distribution+in+turbid+solutions+by+dynamic+light+scattering+microscopy.">Measurement of particle size distribution in turbid solutions by dynamic light scattering microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), e54885 (2017).</li><li>Hassett, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+lipid+nanoparticle+size+on+mRNA+vaccine+immunogenicity.">Impact of lipid nanoparticle size on mRNA vaccine immunogenicity.</a> Journal of Controlled Release. 335, 237-246 (2021).</li><li>Suk, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+penetration+of+fresh+undiluted+sputum+expectorated+by+cystic+fibrosis+patients+by+non-adhesive+polymer+nanoparticles.">The penetration of fresh undiluted sputum expectorated by cystic fibrosis patients by non-adhesive polymer nanoparticles.</a> Biomaterials. 30 (13), 2591-2597 (2009).</li><li>Kim, N., Duncan, G. A., Hanes, J., Suk, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barriers+to+inhaled+gene+therapy+of+obstructive+lung+diseases:+A+review.">Barriers to inhaled gene therapy of obstructive lung diseases: A review.</a> Journal of Controlled Release. 240, 465-488 (2016).</li><li>Liu, Z., Fontana, F., Python, A., Hirvonen, J. T., Santos, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+production+of+particles:+Mechanism,+methodology,+and+applications.">Microfluidics for production of particles: Mechanism, methodology, and applications.</a> Small. 16 (9), 1904673 (2020).</li><li>Guan, S., Darmst&#228;dter, M., Xu, C., Rosenecker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+investigations+on+optimizing+and+nebulization+of+IVT-mRNA+formulations+for+potential+pulmonary-based+alpha-1-antitrypsin+deficiency+treatment.">In vitro investigations on optimizing and nebulization of IVT-mRNA formulations for potential pulmonary-based alpha-1-antitrypsin deficiency treatment.</a> Pharmaceutics. 13 (8), 1281 (2021).</li><li>Shepherd, S. J., Issadore, D., Mitchell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+formulation+of+nanoparticles+for+biomedical+applications.">Microfluidic formulation of nanoparticles for biomedical applications.</a> Biomaterials. 274, 120826 (2021).</li><li>Han, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+confined+impingement+jets+mixer+for+flash+nanoprecipitation.">A simple confined impingement jets mixer for flash nanoprecipitation.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 101 (10), 4018-4023 (2012).</li></ol>

Protokollen beskrevet her tillater ikke bare kostnadseffektiv og rask produksjon av IVT mRNA-vaksineformuleringer med definerte egenskaper, men det gir også muligheten til å tilpasse PP-sNP-formuleringen i henhold til spesifikke terapeutiske formål, for eksempel genterapi. For å sikre en vellykket generering av IVT mRNA/PP-sNp, foreslås det å være ekstra oppmerksom på noen kritiske trinn. Når du arbeider med mRNA, husk alltid at RNase-frie forhold bør opprettholdes gjennom hele prosessen fordi IVT mRNA er svær...

Vaksinasjon har blitt varslet som et av de mest effektive medisinske tiltakene for å redusere sykelighet og dødelighet forårsaket av smittsomme sykdommer1. Betydningen av vaksiner har blitt demonstrert siden utbruddet av koronavirussykdom 2019 (COVID-19). I motsetning til det tradisjonelle konseptet med å injisere inaktiverte eller levende svekkede patogener, konsentrerer toppmoderne vaksinetilnærminger, for eksempel nukleinsyrebaserte vaksiner, seg om å bevare de immunstimulerende egenskapene til målpatogenene, samtidig som man unngår de potensielle sikkerhetsproblemene forbundet med konvensjonelle helmikrobielle virus- eller i bakteriebaserte vaksiner. Både DNA- og RNA (dvs. in vitro-transkriberte messenger RNA, IVT mRNA)-baserte vaksiner utviser profylaktisk til terapeutisk potensial mot en rekke sykdommer, inkludert smittsomme sykdommer og kreft 2,3. I prinsippet er potensialet til nukleinsyrebaserte vaksiner relatert til produksjon, effekt og sikkerhet4. Disse vaksinene kan produseres på en cellefri måte for å muliggjøre kostnadseffektiv, skalerbar og rask produksjon.
En enkelt nukleinsyrebasert vaksine kan kode flere antigener, noe som muliggjør målet for mange virusvarianter eller bakterier med redusert antall inokulasjoner og styrker immunresponsen mot motstandsdyktige patogener 5,6. Dessuten kan nukleinsyrebaserte vaksiner etterligne den naturlige invasjonsprosessen av virus eller bakteriell infeksjon, og bringe både B-celle- og T-cellemedierte immunresponser. I motsetning til noen virus- eller i DNA-baserte vaksiner, gir IVT mRNA-baserte vaksiner en stor fordel når det gjelder sikkerhet. De kan raskt uttrykke det ønskede antigenet i cytosolen og er ikke integrert i vertsgenomet, og unngår bekymringer for innsettingsmutagenese7. IVT-mRNA nedbrytes automatisk etter vellykket oversettelse, slik at proteinuttrykkskinetikken lett kan kontrolleres 8,9. Katalysert av den alvorlige akutte respiratoriske syndromet coronavirus 2 (SARS-CoV-2) pandemi, har innsats fra bedrifter / institusjoner over hele verden muliggjort utgivelsen til markedet for mange typer vaksiner. IVT mRNA-basert vaksineteknologi viser stort potensial og har for første gang vist sin tidligere forventede suksess, på grunn av sin raske design og fleksible kapasitet til å tilpasse seg målantigener innen flere måneder. Suksessen til IVT mRNA-vaksiner mot COVID-19 i kliniske applikasjoner åpnet ikke bare en ny epoke med IVT mRNA-vaksineforskning og utvikling, men akkumulerte også verdifull erfaring for rask utvikling av effektive vaksiner for å håndtere utbrudd av smittsomme sykdommer10,11.
Til tross for det lovende potensialet til IVT mRNA-vaksiner, fortsetter effektiv intracellulær levering av IVT mRNA til virkningsstedet (dvs. cytoplasma) å utgjøre et stort hinder12, spesielt for de som administreres via luftveiene4. IVT mRNA er iboende et ustabilt molekyl med en ekstremt kort halveringstid (~ 7 t) 13, noe som gjør IVT mRNA svært utsatt for nedbrytning av den allestedsnærværende RNase14. Lymfocyttene i det medfødte immunsystemet har en tendens til å oppsluke det anerkjente IVT mRNA i tilfeller av in vivo-applikasjon . Videre svekker den høye negative ladningstettheten og den store molekylvekten (1 x 104-1 x 106 Da) av IVT mRNA dens effektive gjennomtrenging over det anioniske lipid-dobbeltlaget av cellulære membraner15. Derfor er det nødvendig med et leveringssystem med visse biofunksjonelle materialer for å hemme nedbrytningen av IVT mRNA-molekylene og lette cellulært opptak16.
Bortsett fra noen få unntakstilfeller der naken IVT mRNA ble direkte brukt til in vivo-undersøkelser, brukes forskjellige leveringssystemer for å bære IVT mRNA til det terapeutiske virkningsstedet17,18. Tidligere studier har vist at bare noen få IVT mRNA påvises i cytosol uten hjelp av et leveringssystem19. Det er utviklet mange strategier for å forbedre RNA-leveransen med kontinuerlig innsats i feltet, alt fra protaminkondensasjon til lipidinnkapsling20. Lipid nanopartikler (LNPs) er de mest klinisk avanserte blant mRNA-leveringskjøretøyene, som bevist av det faktum at alle godkjente mRNA COVID-19-vaksiner for klinisk bruk bruker LNP-baserte leveringssystemer21. LNPs kan imidlertid ikke formidle effektiv mRNA-transfeksjon når formuleringene leveres via respiratorisk rute22, noe som bemerkelsesverdig begrenser anvendelsen av disse formuleringene ved å indusere slimhinneimmunresponser eller adressere lungerelaterte sykdommer som cystisk fibrose eller α1-antitrypsinmangel. Derfor er det nødvendig å utvikle et nytt leveringssystem for å lette effektiv levering og transfeksjon av IVT mRNA i luftveisrelaterte celler for å løse dette udekkede behovet.
Det er bekreftet at peptid-poloxamin selvmontert nanopartikkel (PP-sNp) leveringssystem kan formidle effektiv transfeksjon av nukleinsyrer i luftveiene hos mus23. PP-sNp vedtar en multifunksjonell modulær designtilnærming, som kan integrere forskjellige funksjonelle moduler i nanopartikler for rask screening og optimalisering23. De syntetiske peptidene og elektrisk nøytrale amfifile blokk-kopolymerer (poloksamin) i PP-sNp kan spontant interagere med IVT mRNA for å generere jevnt fordelte nanopartikler med en kompakt struktur og glatt overflate23. PP-sNp kan forbedre gentransfeksjonseffekten av IVT mRNA-molekyler i dyrkede celler og luftveiene hos mus23. Denne studien beskriver en protokoll for generering av PP-sNp med IVT mRNA som koder for Metridia luciferase (MetLuc-mRNA) (figur 1). Kontrollert og rask blanding via en mikrofluidisk blandingsanordning, som benytter forskjøvet fiskebensblandingsdesign, benyttes i denne protokollen. Prosedyren er enkel å utføre og tillater generering av PP-sNp med mer ensartede størrelser. Det generelle målet med PP-sNp-produksjon ved hjelp av den mikrofluidiske blanderen er å lage PP-sNp for mRNA-kompleksdannelse på en godt kontrollert måte, og dermed muliggjøre effektiv og reproduserbar celletransfeksjon in vitro. Denne protokollen beskriver forberedelse, montering og karakterisering av PP-sNp som inneholder MetLuc-mRNA.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BamHI</td>
			<td>Takara</td>
			<td>1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cap 1 capping system</td>
			<td>Jinan</td>
			<td>M082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dendritic cell-line</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SCC142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA sequence</td>
			<td>Genescript</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human bronchial epithelial cells</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SCC150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KpnI</td>
			<td>Takara</td>
			<td>1068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LP</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium chloride</td>
			<td>APEXBio</td>
			<td>B6083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malvern Zetasizer Nano ZS90</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>NB007605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic chip</td>
			<td>ZHONGXINQIHENG</td>
			<td>Standard PDMS chip</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate readers</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Varioskan lux</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>ND-ONE-W (A30221)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudouridine</td>
			<td>APE&#215;Bio</td>
			<td>B7972</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quanti-Luc</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>Rep-qlc2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RiboRuler High Range RNA Ladder</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>SM1821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free conical tube</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BS-100-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium 1640</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C11875500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Chemyx</td>
			<td>Fusion 101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 transcription Kit</td>
			<td>Jinan</td>
			<td>E131</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient transfection of in vitro transcribed mrna in cultured cells using peptide-poloxamine nanoparticles

In vitro transkriberte messenger RNA (mRNA) vaksiner har vist enormt potensial i kampen mot koronavirussykdommen 2019 (COVID-19) pandemi. Effektive og sikre leveringssystemer må inkluderes i mRNA-vaksinene på grunn av de skjøre egenskapene til mRNA. Et selvmontert peptid-poloxamin nanopartikkel (PP-sNp) genleveringssystem er spesielt utviklet for lungelevering av nukleinsyrer og viser lovende evner til å formidle vellykket mRNA-transfeksjon. Her beskrives en forbedret metode for fremstilling av PP-sNp for å utdype hvordan PP-sNp innkapsler Metridia luciferase (MetLuc) mRNA og vellykket transfekterer dyrkede celler. MetLuc-mRNA oppnås ved en in vitro transkripsjonsprosess fra en lineær DNA-mal. En PP-sNp produseres ved å blande syntetisk peptid / poloxamin med mRNA-løsning ved hjelp av en mikrofluidisk mikser, noe som muliggjør selvmontering av PP-sNp. Ladningen av PP-sNp evalueres deretter ved å måle zetapotensialet. I mellomtiden måles polydispersiteten og den hydrodynamiske størrelsen på PP-sNp nanopartikler ved hjelp av dynamisk lysspredning. mRNA / PP-sNp nanopartikler overføres til dyrkede celler, og supernatanter fra cellekulturen analyseres for luciferaseaktivitet. De representative resultatene viser deres evne til in vitro transfeksjon. Denne protokollen kan kaste lys over utviklingen av neste generasjons mRNA-vaksineleveringssystemer.

Det rekombinante plasmidet ble fordøyd for å produsere den lineariserte DNA-malen (figur 2A). Ved hjelp av protokollen som er beskrevet, kan T7 in vitro transkripsjonssett produsere opptil 80-120 μg uavkortet MetLuc-mRNA per 20 μL reaksjon og 50-60 μg avkortet MetLuc-mRNA per 100 μL reaksjon. Når analysert med elektroforese, bør intakt MetLuc-mRNA med høy kvalitet vise et enkelt og klart bånd, som vist i figur 2B. Forurensninger introdusert i ...

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Transfection of In vitro Transcribed mRNA in Cultured Cells Using Peptide-Poloxamine Nanoparticles at JoVE.com

Efficient Transfection of In vitro Transcribed mRNA in Cultured Cells Using Peptide-Poloxamine Nanoparticles

En selvmontert peptid-poloxamin nanopartikkel (PP-sNp) er utviklet ved hjelp av en mikrofluidisk blandingsanordning for å innkapsle og levere in vitro transkribert messenger RNA. Det beskrevne mRNA/PP-sNp kunne effektivt transfektere dyrkede celler in vitro.

Effektiv transfeksjon av in vitro transkribert mRNA i dyrkede celler ved bruk av peptid-poloksamin nanopartikler

In vitro transcribed messenger RNA (mRNA) vaccines have displayed enormous potential in fighting against the coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic. ...

Peptid-poloxamin nanopartikler er et av de potensielle pulmonale mRNA-leveringssystemene. Vår protokoll gjør peptid-poloxamin nanopartikler med høyere produktivitet og effektivitet, noe som letter utviklingen av mucosal mRNA-vaksinen. Materialene som kreves av teknikken er rimelige, og protokollen kan fullføres på kort tid.Peptid-poloxamin nanopartikler har evnen til å formidle effektiv mRNA-transfeksjon. Peptid-poloxamin nanopartikler viste vellykket mRNA-transfeksjon i humane bronkialepitelceller, noe som impliserer ytterligere applikasjoner for mucosal COVID-19-vaksiner, behandling av lungekreft og cystisk fibrose genterapi. Jeg forventer at den enkelte har noen grunnleggende kunnskaper i et beslektet felt og med protokollen og mange av teknikkene også, før han eller hun begynner å utføre eksperimentene.Etter å ha syntetisert den åpne leserammen til Metridia luciferase og klonet den inn i pUC57-vektoren, lag en linearisert DNA-mal ved hjelp av BamHI og KpnI ved 37 grader Celsius i en time. Forbered en reaksjon på 20 mikroliter volum for mRNA-syntese ved bruk av et T7-transkripsjonssett og pseudouridin som beskrevet i manuskriptet. Bland komponentene grundig og inkuber ved 37 grader Celsius i tre timer.Fjern deretter den sekundære strukturen på 50 mikrogram uavkortet IVT mRNA ved å varme den opp til 65 grader Celsius i 10 minutter. Bruk Cap 1-kappesystemet for IVT mRNA-kappen, og tilbered Cap 1 ved å modifisere strukturen med 7-metylguanosinhette ved bruk av S-adenosylmetionin og 2'O-metyltransferaser ved 37 grader Celsius i 30 til 60 minutter. Mål konsentrasjonen av IVT mRNA med et UV-synlig spektrofotometer.Ved hjelp av en RNA-markør, analyser molekylstørrelsen på avkortet IVT mRNA i en 1% formaldehyd denaturerende agarosegel som inneholder 18% formaldehyd. Forbered 10 milligram per milliliter lagerløsning av poloksamin 704 ved å oppløse T704 i nukleasfritt vann. Forbered 2 milligram per milliliter stamløsning av peptidet ved å oppløse peptidet i nukleasefritt vann.Oppbevar den tilberedte løsningen ved 4 grader Celsius. Tine IVT mRNA på is. Før du åpner røret, sentrifuger røret ved 300 ganger G i tre sekunder ved romtemperatur, og fortynn IVT mRNA-løsningen med nukleasefritt vann.Forbered T704 og syntetisk peptidblandingsløsning ved å fortynne T704-løsningen til åtte mikrogram per mikroliter konsentrasjon, og syntetisk peptidløsning til henholdsvis 0,555 mikrogram per mikroliter konsentrasjon, med nukleasefritt vann. Inkuber den blandede løsningen i 15 minutter ved romtemperatur før videre bruk. Trekk IVT mRNA-oppløsningen inn i en milliliter sprøyte, unngå luftspalter eller bobler i sprøytespissen.Legg sprøyten i den ene siden av sylinderampullen ved siden av den roterende blokken. Fyll deretter en milliliter sprøyte med T704 og syntetisk peptidblandingsløsning, og fjern eventuelle bobler eller luftspalter på sprøytespissen. Plasser sprøyten i det andre innløpet til pumpen, og sett pumpen med en total strømningshastighet på 4 til 10 milliliter per minutt.Plasser et ti milliliter RNase-fritt konisk rør for å samle den blandede IVT mRNA / PP-sNp-løsningen på enden av strømningsbanen til blandingsanordningen. Kjør pumpen for å starte blandingen, og sørg for at parametrene legges inn riktig. Etter å ha kjørt pumpen i seks sekunder, samle IVT mRNA / PP-sNp-prøven fra det koniske røret.Plate humane bronkialepitelceller og en dendritisk cellelinje i 96-brønnsplater 24 timer før transfeksjon. Dyrk cellene i et kulturmedium supplert med 10% varmeinaktivert fosterbovint serum og 1% penicillin streptomycin. Etter å ha fjernet vekstmediet, vask de belagte cellene med 0, 2 milliliter per brønn PBS.Tilsett 170 mikroliter serumfritt kulturmedium til hver brønn som inneholder de belagte cellekulturene. Deretter tilsettes 30 mikroliter IVT mRNA/PP-sNp formulering som inneholder 0,4 mikrogram Metridia luciferase mRNA dråpe klokt i hver brønn. Inkuber cellene med IVT mRNA / PP-sNp-formuleringen i en fuktet 5% karbondioksidberiket atmosfære ved 37 grader Celsius i fire timer.Aspirer transfeksjonsmediet og tilsett 0,2 ml friskt kulturmedium supplert med 10% varmeinaktivert føtalt bovint serum og 1% penicillin streptomycin. Inkuber de transfiserte cellene i 24 timer som vist tidligere, og samle supernatantene som skal oppdages fra hver brønn. Forbered en ny analyseløsning ved å tilsette PBS til coelenterazinsubstratet.Bland oppløsningen grundig ved vortexing i 10 sekunder. Tilsett 50 mikroliter av den oppsamlede supernatanten til en 96-brønns plate. Sett opp mikroplateleseren med en lesetid på 1.000 millisekunder og tilsett 30 mikroliter coelenterazinoppløsning til hver brønn manuelt eller ved automatisk injeksjon.Umiddelbart etter tilsetning av coelenterazinoppløsningen til supernatanten, klikker du på Start for å måle luminescenssignalet. Det rekombinante plasmidet ble isolert og fordøyd for å produsere den lineariserte DNA-malen. In vitro-transkripsjonen produserte oppkappet og avkortet MetLuc mRNA.Celler transfisert med Metridia luciferase mRNA / PP-sNp viste signifikant høyere ekspresjon av luciferase sammenlignet med de som ble transfisert med kommersielt tilgjengelig lipidbasert transfeksjonsreagens, naken Metridia luciferase mRNA, PBS eller T7044 syntetiske peptider, blandet løsning i humane bronkiale epitelceller, 16 HBE og dendritisk cellelinje DC2.4 Metridia luciferase mRNA / PP-sNp viste høyere luciferaseuttrykk enn LP.noe som tyder på at PP-sNp-leveringssystemet er viktig for beskytte MetLuc mRNA mot nedbrytning og for å fremme transfeksjonseffektiviteten til det eksogene Metridia luciferase mRNA. Forsikre deg om at den syntetiske strukturen til ikke-avkortet Met-mRNA er fjernet. Beregn og last ned Met-mRNA T704 og peptidforbindelsen nøye for å forberede og komprimere poloxamin nanopartiklene.Transmisjonselektronmikroskopi kan utføres for å observere morfologien til peptid-poloxamin nanopartikler. Denne teknikken hjelper forskere til å utvikle mucosal mRNA-vaksiner og muliggjøre høy gjennomstrømningsscreening av genterapiformuleringer for alle relaterte celler.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Efficient Transfection of In vitro Transcribed mRNA in Cultured Cells Using Peptide-Poloxamine Nanoparticles

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Seven Steps to Stellate Cells

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Kvantitativ<em&gt; In vitro</em&gt; Analysen for å måle Neutrophil vedheft til Aktiverte primære humane mikrovaskulær endotelceller under statiske betingelser

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Bruke Fluorescent Proteiner å visualisere og kvantifisere<em&gt; Chlamydia</em&gt; Vakuole Vekst Dynamics i levende celler

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Kunstig antigenpresenterende celler (KaAPC) for effektiv<em&gt; In Vitro</em&gt; Nedbryting av humant antigen-spesifikke T-celler

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Svært effektiv Transfeksjon menneskerettighets THP-1 Makrofager av nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Avledning av T-celler<em&gt; In Vitro</em&gt; Fra Mouse Embryonic Stem Cells

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...