Name: efficient transfection of in vitro transcribed mrna in cultured cells using peptide-poloxamine nanoparticles
Uploaded: 2022-08-17T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Transfection of In vitro Transcribed mRNA in Cultured Cells Using Peptide-Poloxamine Nanoparticles at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pela National Natural Science Foundation of China (NSFC, Grant No. 82041045 e 82173764), o principal projeto de Estudo sobre Patogênese e Sistema de Tecnologia de Prevenção de Epidemias (2021YFC2302500) do Ministério da Ciência e Tecnologia da China, o Projeto De Talentos Jovens Excepcionais (CQYC202005027) e a Fundação de Ciência Natural de Chongqing (cstc2021jcyj-msxmX0136). Os autores são gratos ao Dr. Xiaoyan Ding por medir o diâmetro hidrodinâmico (nm) e índice de polidispersidade (PDI).

1. Transcrição in vitro de mRNA quimicamente modificado
NOTA: É necessário usar tubos sem nuclease, reagentes, vidros, pontas de pipeta, etc., porque as RNases são onipresentes no ambiente, como soluções de laboratório, superfícies de instrumentos, cabelo, pele, poeira, etc. Limpe as superfícies do banco e as pipetas completamente antes do uso, e use luvas para evitar a contaminação rnase.
<ol><li>Realize a linearização do modelo de DNA.<ol><li>Sinteti...

<ol>
	<li>Nature milestones in vaccines. Springer Nature Available from: <a target="_blank" href="https://www.nature.com/collections/hcajdiajij">https://www.nature.com/collections/hcajdiajij</a> (2020)</li><li>Barbier, A. J., Jiang, A. Y., Zhang, P., Wooster, R., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+progress+of+mRNA+vaccines+and+immunotherapies.">The clinical progress of mRNA vaccines and immunotherapies.</a> Nature Biotechnology. 40 (6), 840-854 (2022).</li><li>Mulligan, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+I/II+study+of+COVID-19+RNA+vaccine+BNT162b1+in+adults.">Phase I/II study of COVID-19 RNA vaccine BNT162b1 in adults.</a> Nature. 586 (7830), 589-593 (2020).</li><li>Tang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotechnologies+in+delivery+of+DNA+and+mRNA+vaccines+to+the+nasal+and+pulmonary+mucosa.">Nanotechnologies in delivery of DNA and mRNA vaccines to the nasal and pulmonary mucosa.</a> Nanomaterials. 12 (2), 226 (2022).</li><li>Freyn, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multi-targeting,+nucleoside-modified+mRNA+influenza+virus+vaccine+provides+broad+protection+in+mice.">A multi-targeting, nucleoside-modified mRNA influenza virus vaccine provides broad protection in mice.</a> Molecular Therapy. 28 (7), 1569-1584 (2020).</li><li>Wu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variant+SARS-CoV-2+mRNA+vaccines+confer+broad+neutralization+as+primary+or+booster+series+in+mice.">Variant SARS-CoV-2 mRNA vaccines confer broad neutralization as primary or booster series in mice.</a> Vaccine. 39 (51), 7394-7400 (2021).</li><li>Chaudhary, N., Weissman, D., Whitehead, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+vaccines+for+infectious+diseases:+Principles,+delivery+and+clinical+translation.">mRNA vaccines for infectious diseases: Principles, delivery and clinical translation.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 20, 817-838 (2021).</li><li>Kormann, M. S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+therapeutic+proteins+after+delivery+of+chemically+modified+mRNA+in+mice.">Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice.</a> Nature Biotechnology. 29 (2), 154-157 (2011).</li><li>Tavernier, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+as+gene+therapeutic:+How+to+control+protein+expression.">mRNA as gene therapeutic: How to control protein expression.</a> Journal of Controlled Release. 150 (3), 238-247 (2011).</li><li>Walsh, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+immunogenicity+of+two+RNA-based+Covid-19+vaccine+candidates.">Safety and immunogenicity of two RNA-based Covid-19 vaccine candidates.</a> The New England Journal of Medicine. 383 (25), 2439-2450 (2020).</li><li>Baden, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+safety+of+the+mRNA-1273+SARS-CoV-2+vaccine.">Efficacy and safety of the mRNA-1273 SARS-CoV-2 vaccine.</a> The New England Journal of Medicine. 384 (5), 403-416 (2021).</li><li>Guan, S., Rosenecker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotechnologies+in+delivery+of+mRNA+therapeutics+using+nonviral+vector-based+delivery+systems.">Nanotechnologies in delivery of mRNA therapeutics using nonviral vector-based delivery systems.</a> Gene Therapy. 24 (3), 133-143 (2017).</li><li>Sharova, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Database+for+mRNA+half-life+of+19+977+genes+obtained+by+DNA+microarray+analysis+of+pluripotent+and+differentiating+mouse+embryonic+stem+cells.">Database for mRNA half-life of 19 977 genes obtained by DNA microarray analysis of pluripotent and differentiating mouse embryonic stem cells.</a> DNA Research. 16 (1), 45-58 (2009).</li><li>Houseley, J., Tollervey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+many+pathways+of+RNA+degradation.">The many pathways of RNA degradation.</a> Cell. 136 (4), 763-776 (2009).</li><li>Kowalski, P. S., Rudra, A., Miao, L., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivering+the+messenger:+Advances+in+technologies+for+therapeutic+mRNA+delivery.">Delivering the messenger: Advances in technologies for therapeutic mRNA delivery.</a> Molecular Therapy. 27 (4), 710-728 (2019).</li><li>Sahin, U., Karik&#243;, K., T&#252;reci, &. #. 2. 1. 4. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MRNA-based+therapeutics-developing+a+new+class+of+drugs.">MRNA-based therapeutics-developing a new class of drugs.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 13, 359-380 (2014).</li><li>Hajj, K. A., Whitehead, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+translation:+Non-viral+materials+for+therapeutic+mRNA+delivery.">Tools for translation: Non-viral materials for therapeutic mRNA delivery.</a> Nature Reviews Materials. 2, 17056 (2017).</li><li>Deering, R. P., Kommareddy, S., Ulmer, J. B., Brito, L. A., Geall, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+acid+vaccines:+Prospects+for+non-viral+delivery+of+mRNA+vaccines.">Nucleic acid vaccines: Prospects for non-viral delivery of mRNA vaccines.</a> Expert Opinion on Drug Delivery. 11 (6), 885-899 (2014).</li><li>Wadhwa, A., Aljabbari, A., Lokras, A., Foged, C., Thakur, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opportunities+and+challenges+in+the+delivery+of+mRNA-based+vaccines.">Opportunities and challenges in the delivery of mRNA-based vaccines.</a> Pharmaceutics. 12 (2), 102 (2020).</li><li>Hou, X., Zaks, T., Langer, R., Dong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+nanoparticles+for+mRNA+delivery.">Lipid nanoparticles for mRNA delivery.</a> Nature Reviews Materials. 6 (12), 1078-1094 (2021).</li><li>Sahin, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COVID-19+vaccine+BNT162b1+elicits+human+antibody+and+T(H)1+T+cell+responses.">COVID-19 vaccine BNT162b1 elicits human antibody and T(H)1 T cell responses.</a> Nature. 586 (7830), 594-599 (2020).</li><li>Azzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+immune+response+in+BNT162b2+COVID-19+vaccine+recipients.">Mucosal immune response in BNT162b2 COVID-19 vaccine recipients.</a> EBioMedicine. 75, 103788 (2022).</li><li>Guan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+peptide-poloxamine+nanoparticles+enable+in+vitro+and+in+vivo+genome+restoration+for+cystic+fibrosis.">Self-assembled peptide-poloxamine nanoparticles enable in vitro and in vivo genome restoration for cystic fibrosis.</a> Nature Nanotechnology. 14 (3), 287-297 (2019).</li><li>Pitard, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negatively+charged+self-assembling+DNA/poloxamine+nanospheres+for+in+vivo+gene+transfer.">Negatively charged self-assembling DNA/poloxamine nanospheres for in vivo gene transfer.</a> Nucleic Acids Research. 32 (20), 159 (2004).</li><li>Hiroi, T., Shibayama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+particle+size+distribution+in+turbid+solutions+by+dynamic+light+scattering+microscopy.">Measurement of particle size distribution in turbid solutions by dynamic light scattering microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), e54885 (2017).</li><li>Hassett, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+lipid+nanoparticle+size+on+mRNA+vaccine+immunogenicity.">Impact of lipid nanoparticle size on mRNA vaccine immunogenicity.</a> Journal of Controlled Release. 335, 237-246 (2021).</li><li>Suk, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+penetration+of+fresh+undiluted+sputum+expectorated+by+cystic+fibrosis+patients+by+non-adhesive+polymer+nanoparticles.">The penetration of fresh undiluted sputum expectorated by cystic fibrosis patients by non-adhesive polymer nanoparticles.</a> Biomaterials. 30 (13), 2591-2597 (2009).</li><li>Kim, N., Duncan, G. A., Hanes, J., Suk, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barriers+to+inhaled+gene+therapy+of+obstructive+lung+diseases:+A+review.">Barriers to inhaled gene therapy of obstructive lung diseases: A review.</a> Journal of Controlled Release. 240, 465-488 (2016).</li><li>Liu, Z., Fontana, F., Python, A., Hirvonen, J. T., Santos, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+production+of+particles:+Mechanism,+methodology,+and+applications.">Microfluidics for production of particles: Mechanism, methodology, and applications.</a> Small. 16 (9), 1904673 (2020).</li><li>Guan, S., Darmst&#228;dter, M., Xu, C., Rosenecker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+investigations+on+optimizing+and+nebulization+of+IVT-mRNA+formulations+for+potential+pulmonary-based+alpha-1-antitrypsin+deficiency+treatment.">In vitro investigations on optimizing and nebulization of IVT-mRNA formulations for potential pulmonary-based alpha-1-antitrypsin deficiency treatment.</a> Pharmaceutics. 13 (8), 1281 (2021).</li><li>Shepherd, S. J., Issadore, D., Mitchell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+formulation+of+nanoparticles+for+biomedical+applications.">Microfluidic formulation of nanoparticles for biomedical applications.</a> Biomaterials. 274, 120826 (2021).</li><li>Han, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+confined+impingement+jets+mixer+for+flash+nanoprecipitation.">A simple confined impingement jets mixer for flash nanoprecipitation.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 101 (10), 4018-4023 (2012).</li></ol>

O protocolo aqui descrito não só permite a produção econômica e rápida de formulações de vacinas IVT mRNA com propriedades definidas, mas também oferece a possibilidade de personalizar a formulação pp-sNp de acordo com propósitos terapêuticos específicos, como a terapia genética. Para garantir a geração bem sucedida de IVT mRNA/PP-sNp, sugere-se prestar atenção extra a algumas etapas críticas. Ao trabalhar com mRNA, lembre-se sempre que as condições livres de RNase devem ser mantidas durante todo o ...

A vacinação tem sido anunciada como uma das intervenções médicas mais eficientes para a redução da morbidade e mortalidade causadas por doenças infecciosas1. A importância das vacinas vem sendo demonstrada desde o surto da doença coronavírus 2019 (COVID-19). Ao contrário do conceito tradicional de injetar patógenos inativados ou atenuados vivos, abordagens de vacinas de última geração, como vacinas à base de ácido nucleico, concentram-se na preservação das propriedades imuno-estimulantes dos patógenos alvo, evitando os potenciais problemas de segurança associados ao vírus microbiano convencional ou em vacinas baseadas em bactérias. Tanto o DNA quanto o RNA (ou seja, vacinas in vitro transcritas do mensageiro, IVT mRNA) exibem profilático ao potencial terapêutico contra uma variedade de doenças, incluindo doenças infecciosas e cânceres 2,3. Em princípio, o potencial das vacinas à base de ácido nucleico diz respeito à sua produção, eficácia e segurança4. Essas vacinas podem ser fabricadas de forma livre de células para permitir uma produção econômica, escalável e rápida.
Uma única vacina à base de ácido nucleico pode codificar vários antígenos, permitindo o alvo de inúmeras variantes virais ou bactérias com um número reduzido de inoculações e fortalecendo a resposta imune contra patógenos resistentes 5,6. Além disso, vacinas à base de ácido nucleico poderiam imitar o processo natural de invasão de vírus ou infecção bacteriana, trazendo respostas imunes mediadas por células B e T. Ao contrário de algumas vacinas baseadas em DNA, as vacinas baseadas em IC mRNA oferecem uma enorme vantagem em termos de segurança. Eles podem expressar rapidamente o antígeno desejado no citosol e não estão integrados ao genoma hospedeiro, evitando preocupações sobre mutagênese insercional7. O IVT-mRNA é automaticamente degradado após a tradução bem sucedida, de modo que sua cinética de expressão proteica pode ser facilmente controlada 8,9. Catalisados pela síndrome respiratória aguda grave coronavírus 2 (SARS-CoV-2), os esforços de empresas/instituições em todo o mundo permitiram a liberação para o mercado de muitos tipos de vacinas. A tecnologia de vacinas baseada em IG mRNA mostra grande potencial e, pela primeira vez, demonstrou seu sucesso anteriormente antecipado, devido ao seu rápido design e capacidade flexível de se adaptar a qualquer antígeno-alvo dentro de vários meses. O sucesso das vacinas IVT mRNA contra o COVID-19 em aplicações clínicas não só abriu uma nova era de pesquisa e desenvolvimento de vacinas IVT mRNA como também acumulou experiência valiosa para o rápido desenvolvimento de vacinas eficazes para lidar com surtos de doenças infecciosas10,11.
Apesar do potencial promissor das vacinas IVT mRNA, a eficiente entrega intracelular de IVT mRNA para o local de ação (ou seja, citoplasma) continua a representar um grande obstáculo12, especialmente para aqueles administrados via vias aéreas4. IVT mRNA é inerentemente uma molécula instável com uma meia-vida extremamente curta (~7 h)13, o que torna o IVT mRNA altamente propenso à degradação pelo onipresente RNase14. Os linfócitos do sistema imunológico inato tendem a engolir o reconhecido IVT mRNA em casos de aplicação in vivo . Além disso, a alta densidade de carga negativa e o grande peso molecular (1 x 104-1 x 106 Da) de IVT mRNA prejudicam sua efetiva permeação através da bicamada lipídica aniônica das membranas celulares15. Portanto, um sistema de entrega com certos materiais biofuncionais é necessário para inibir a degradação das moléculas de mRNA IVT e facilitar a absorção celular16.
Além de alguns casos excepcionais em que o MRNA IVT nu foi diretamente utilizado para investigações in vivo, vários sistemas de entrega são usados para transportar IVT mRNA para o local terapêutico da ação17,18. Estudos anteriores revelaram que apenas alguns mRNAs IVT são detectados em citosol sem a assistência de um sistema de entrega19. Inúmeras estratégias foram desenvolvidas para melhorar a entrega de RNA com esforços contínuos no campo, desde condensação de protamina até encapsulamento lipídicos20. As nanopartículas lipídicas (LNPs) são as mais clinicamente avançadas entre os veículos de entrega de mRNA, como comprovado pelo fato de que todas as vacinas aprovadas de mRNA COVID-19 para uso clínico empregam sistemas de entrega baseados em LNP21. No entanto, os LNPs não podem mediar a transfecção eficaz do mRNA quando as formulações são entregues através da rota respiratória22, o que limita notavelmente a aplicação dessas formulações na indução de respostas imunes mucosas ou no enfrentamento de doenças relacionadas com o pulmão, como fibrose cística ou deficiência de α1-antitripsina. Portanto, é necessário desenvolver um novo sistema de entrega para facilitar a entrega eficiente e transfecção de IVT mRNA em células relacionadas às vias aéreas para resolver essa necessidade não atendida.
Foi confirmado que o sistema de entrega de nanopartículas auto-montadas de peptídeo-poloxamina (PP-sNp) pode mediar a transfecção eficiente de ácidos nucleicos no trato respiratório dos camundongos23. O PP-sNp adota uma abordagem de design modular multifuncional, que pode integrar diferentes módulos funcionais nas nanopartículas para triagem rápida e otimização23. Os peptídeos sintéticos e copolímeros de blocos anfílicos eletricamente neutros (poloxamina) dentro do PP-sNp podem interagir espontaneamente com o IVT mRNA para gerar nanopartículas distribuídas uniformemente com uma estrutura compacta e superfície lisa23. PP-sNp pode melhorar o efeito de transfecção genética de moléculas de IVT mRNA em células cultivadas e o trato respiratório de camundongos23. O presente estudo descreve um protocolo para geração de PP-sNp contendo iGM que codifica a Luciferase Metridia (MetLuc-mRNA) (Figura 1). A mistura controlada e rápida através de um dispositivo de mistura microfluida, que emprega o design de mistura de herringbone escalonado, é utilizada neste protocolo. O procedimento é fácil de executar e permite a geração de PP-sNp com tamanhos mais uniformes. O objetivo geral da produção pp-sNp usando o misturador microfluido é criar PP-sNp para a complexação de mRNA de forma bem controlada, permitindo assim transfecção celular eficiente e reprodutível in vitro. O presente protocolo descreve a preparação, montagem e caracterização do PP-sNp contendo MetLuc-mRNA.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BamHI</td>
			<td>Takara</td>
			<td>1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cap 1 capping system</td>
			<td>Jinan</td>
			<td>M082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dendritic cell-line</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SCC142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA sequence</td>
			<td>Genescript</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human bronchial epithelial cells</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SCC150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KpnI</td>
			<td>Takara</td>
			<td>1068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LP</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium chloride</td>
			<td>APEXBio</td>
			<td>B6083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malvern Zetasizer Nano ZS90</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>NB007605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic chip</td>
			<td>ZHONGXINQIHENG</td>
			<td>Standard PDMS chip</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate readers</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Varioskan lux</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>ND-ONE-W (A30221)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudouridine</td>
			<td>APE&#215;Bio</td>
			<td>B7972</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quanti-Luc</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>Rep-qlc2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RiboRuler High Range RNA Ladder</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>SM1821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free conical tube</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BS-100-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium 1640</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C11875500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Chemyx</td>
			<td>Fusion 101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 transcription Kit</td>
			<td>Jinan</td>
			<td>E131</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient transfection of in vitro transcribed mrna in cultured cells using peptide-poloxamine nanoparticles

As vacinas de RNA (mRNA) in vitro transcritas têm mostrado enorme potencial no combate à doença coronavírus 2019 (COVID-19). Sistemas de entrega eficientes e seguros devem ser incluídos nas vacinas mRNA devido às frágeis propriedades do mRNA. Um sistema de entrega de genes auto-montado peptídeo-poloxamina (PP-sNp) foi projetado especificamente para a entrega pulmonar de ácidos nucleicos e exibe capacidades promissoras na mediação da transfecção bem sucedida do mRNA. Aqui, um método aprimorado para preparar o PP-sNp é descrito para elaborar sobre como o PP-sNp encapsula o mRNA Metridia luciferase (MetLuc) e transfes com sucesso células cultivadas. MetLuc-mRNA é obtido por um processo de transcrição in vitro de um modelo de DNA linear. Um PP-sNp é produzido misturando peptídeo sintético/poloxamina com solução mRNA usando um misturador microfluido, permitindo a auto-montagem de PP-sNp. A carga de PP-sNp é posteriormente avaliada medindo o potencial zeta. Enquanto isso, a polidispersidade e o tamanho hidrodinâmico das nanopartículas PP-sNp são medidos usando dispersão dinâmica de luz. As nanopartículas mRNA/PP-sNp são transfectadas em células cultivadas, e os supernacantes da cultura celular são testados para a atividade da luciferase. Os resultados representativos demonstram sua capacidade de transfecção in vitro. Este protocolo pode lançar luz sobre o desenvolvimento de sistemas de entrega de vacinas mRNA de próxima geração.

O plasmídeo recombinante foi digerido para produzir o modelo de DNA linearizado (Figura 2A). Usando o protocolo descrito, o kit de transcrição in vitro T7 pode produzir até 80-120 μg de MetLuc-mRNA não tampado por reação de 20 μL e 50-60 μg de MetLuc-mRNA tampado por reação de 100 μL. Quando analisado com eletroforese, MetLuc-mRNA intacto com alta qualidade deve mostrar uma banda única e clara, como exibido na Figura 2B. Contaminantes intr...

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Transfection of In vitro Transcribed mRNA in Cultured Cells Using Peptide-Poloxamine Nanoparticles at JoVE.com

Efficient Transfection of In vitro Transcribed mRNA in Cultured Cells Using Peptide-Poloxamine Nanoparticles

Uma nanopartícula de peptídeo-poloxamina auto-montada (PP-sNp) é desenvolvida usando um dispositivo de mistura microfluida para encapsular e fornecer RNA de mensageiro transcrito in vitro . O mRNA/PP-sNp descrito poderia transfetar eficientemente células cultivadas in vitro.

Transfecção eficiente de mRNA transcrito in vitro em células cultivadas usando nanopartículas de peptídeo-poloxamina

In vitro transcribed messenger RNA (mRNA) vaccines have displayed enormous potential in fighting against the coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic. ...

Nanopartículas de peptídeo-poloxamina é um dos potenciais sistemas de entrega de mRNA pulmonar. Nosso protocolo faz com que as nanopartículas peptídeo-poloxamina com maior produtividade e eficiência, o que facilita o desenvolvimento da vacina mRNA mucosa. Os materiais exigidos pela técnica são de baixo custo, e o protocolo pode ser concluído em pouco tempo.As nanopartículas peptídeo-poloxamina têm a capacidade de mediar transfecção eficiente de mRNA. As nanopartículas de peptídeo-poloxamina apresentaram transfecção bem sucedida de mRNA em células epiteliais brônquias humanas, o que implica aplicações adicionais para vacinas COVID-19 mucosas, tratamento de cânceres de pulmão e terapia genética da fibrose cística. Espero que o indivíduo tenha algum conhecimento básico em um campo relacionado e com o protocolo e muitas das técnicas também, antes que ele ou ela comece a realizar os experimentos.Depois de sintetizar o quadro de leitura aberta da Luciferase Metridia e cloná-lo no vetor pUC57, prepare um modelo de DNA linearizado usando BamHI e KpnI a 37 graus Celsius por uma hora. Prepare uma reação de volume de 20 microliters para síntese de mRNA usando um kit de transcrição T7 e pseudouridina como descrito no manuscrito. Misture bem os componentes e incubar a 37 graus Celsius por três horas.Em seguida, remova a estrutura secundária de 50 microgramas de mRNA IVT não tampado aquecendo-a a 65 graus Celsius por 10 minutos. Use o sistema de tampa do Cap 1 para o capping de mRNA IVT e prepare o Cap 1 modificando a estrutura da tampa de 7 metilguanosina usando S-adenosylmethionine e 2'O-metiltransferases a 37 graus Celsius por 30 a 60 minutos. Meça a concentração de ivt mRNA tampado com um espectrofotômetro visível UV.Usando um marcador de RNA, analise o tamanho molecular do mRNA IVT tampado em um gel de agarose de 1%formaldeído contendo 18% de formaldeído. Prepare 10 miligramas por solução de estoque mililitro de poloxamina 704 solubilizando o T704 em água sem nuclease. Prepare 2 miligramas por solução de estoque mililitro do peptídeo solubilizando o peptídeo em água sem nuclease.Armazene a solução preparada a 4 graus Celsius. Descongele o IVT mRNA no gelo. Antes de abrir o tubo, centrifugar o tubo a 300 vezes G durante três segundos em temperatura ambiente e diluir a solução ivt mRNA com água sem nuclease.Prepare a solução de mistura de peptídeos T704 e sintético, diluindo a solução T704 para oito microgramas por concentração de microliter, e solução de peptídeo sintético para 0,555 microgramas por concentração de microliter, com água livre de nuclease, respectivamente. Incubar a solução mista por 15 minutos em temperatura ambiente antes de usar mais. Desenhe a solução ivt mRNA em uma seringa de um mililitro, evitando aberturas de ar ou bolhas na ponta da seringa.Carregue a seringa em um lado do cartucho ao lado do bloco rotativo. Em seguida, encha uma seringa de um mililitro com solução de mistura de peptídeos t704 e remova quaisquer bolhas ou lacunas de ar na ponta da seringa. Coloque a seringa na outra entrada da bomba e coloque a bomba com uma vazão total de 4 a 10 mililitros por minuto.Coloque um tubo cínico sem RNase de dez mililitros para coletar a solução misturada IVT mRNA/PP-sNp no final do caminho de fluxo do dispositivo de mistura. Execute a bomba para iniciar a mistura, garantindo que os parâmetros estejam inseridos corretamente. Depois de executar a bomba por seis segundos, colete a amostra IVT mRNA/PP-sNp do tubo cônico.Placa células epiteliais brônquicas humanas e uma linha de células dendríticas em placas de 96 poços 24 horas antes da transfecção. Cultivar as células em um meio de cultura suplementado com soro bovino fetal inativado 10% e estreptomicina de penicilina de 1%. Depois de remover o meio de crescimento, lave as células banhadas com 0,2 mililitros por pbs bem.Adicione 170 microliters de meio de cultura livre de soro a cada poço contendo as culturas celulares banhadas. Em seguida, adicione 30 microliters de formulação IVT mRNA/PP-sNp contendo 0,4 microgramas de Metridia luciferase mRNA drop wise em cada poço. Incubar as células com a formulação IVT mRNA/PP-sNp em uma atmosfera umidificada enriquecida com dióxido de carbono a 37 graus Celsius por quatro horas.Aspire o meio de transfecção e adicione 0,2 mililitros de cultura fresca complementada com soro bovino fetal inativado 10% e estreptomicina de penicilina de 1%. Incubar as células transfeinadas por 24 horas como demonstrado anteriormente e coletar os supernantes a serem detectados de cada poço. Prepare uma nova solução de ensaio adicionando PBS ao substrato de coelenterazina.Misture bem a solução com vórtice por 10 segundos. Adicione 50 microliters do supernatante coletado a uma placa de 96 poços. Configure o leitor de microplacões com um tempo de leitura de 1.000 milissegundos e adicione 30 microliters de solução de coelenterazina a cada poço manualmente ou por injeção automatizada.Imediatamente após adicionar a solução de coelenterazina ao supernatante, clique em Iniciar para medir o sinal de luminescência. O plasmídeo recombinante foi isolado e digerido para produzir o modelo de DNA linearizado. A transcrição in vitro produziu mRNA MetLuc upcaped e tampado.As células transfeccionadas com Metridia luciferase mRNA/PP-sNp apresentaram expressão significativamente maior de luciferase em comparação com aquelas transfecidas com reagente de transfecção à base de lipídios comercialmente disponível, lútridas luciferase mRNA, PBS ou peptídeos sintéticos T7044, solução mista em células epiteliais brônquias humanas, 16 HBE e linha celular dendrítica DC2.4 Metridia luciferase mRNA/PP-sNp mostrou expressão de luciferase maior do que LP.sugerindo que o sistema de entrega PP-sNp é importante para proteger o MetLuc mRNA contra a degradação e para promover a eficiência de transfecção da exógena Metridia luciferase mRNA. Certifique-se de que a estrutura sintética do Met-mRNA não tampado seja removida com sucesso. Calcule e baixe o composto Met-mRNA T704 e peptídeo cuidadosamente para preparar e compactar as nanopartículas de poloxamina.A microscopia eletrônica de transmissão pode ser realizada para observar a morfologia das nanopartículas peptídeo-poloxamina. Essa técnica ajuda os pesquisadores a desenvolver vacinas mucosas de mRNA e a permitir a triagem de alto rendimento de formulações de terapia genética para todas as células relacionadas.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Efficient Transfection of In vitro Transcribed mRNA in Cultured Cells Using Peptide-Poloxamine Nanoparticles

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Transdução retroviral de receptor de células T no rato células T

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Imunologia e Infecção

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Inferência genotípica do HIV-1 Tropismo Usando de base populacional de Seqüenciamento V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Seven Steps to Stellate Cells

Sete Passos para Stellate Células

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

Protocolo otimizado para transfecção eficiente de células dendríticas, sem maturação das células

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitativo<em&gt; In vitro</em&gt; Ensaio medir a adesão de neutrófilos ativados primárias células humanas endoteliais microvasculares em condições estáticas

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Usando proteínas fluorescentes para visualizar e Quantificar<em&gt; Chlamydia</em&gt; Vacúolo Crescimento Dynamics em células vivas

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Assassino Artificial células apresentadoras de antígenos (KaAPC) para a eficiente<em&gt; In Vitro</em&gt; Depleção de células T humanas antígeno específico da

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

A transfecção altamente eficiente de THP-1 por macrófagos humanos Nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Derivação de células T<em&gt; In Vitro</em&gt; De Mouse Células-Tronco Embrionárias

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...