Name: efficient transfection of in vitro transcribed mrna in cultured cells using peptide-poloxamine nanoparticles
Uploaded: 2022-08-17T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Transfection of In vitro Transcribed mRNA in Cultured Cells Using Peptide-Poloxamine Nanoparticles at JoVE.com

Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (NSFC, грант No 82041045 и 82173764), крупным проектом «Исследование системы технологий патогенеза и профилактики эпидемий» (2021YFC2302500) Министерства науки и технологий Китая, проектом «Чунцинские таланты: исключительные молодые таланты» (CQYC202005027) и Фондом естественных наук Чунцина (cstc2021jcyj-msxmX0136). Авторы благодарны доктору Сяоянь Дину за измерение гидродинамического диаметра (нм) и индекса полидисперсности (PDI).

1. Транскрипция in vitro химически модифицированной мРНК
ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо использовать безнуклеазные трубки, реагенты, стеклянную посуду, наконечники пипеток и т. Д., Потому что РНКазы повсеместно распространены в окружающей среде, такой как лабораторные ...

<ol>
	<li>Nature milestones in vaccines. Springer Nature Available from: <a target="_blank" href="https://www.nature.com/collections/hcajdiajij">https://www.nature.com/collections/hcajdiajij</a> (2020)</li><li>Barbier, A. J., Jiang, A. Y., Zhang, P., Wooster, R., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+progress+of+mRNA+vaccines+and+immunotherapies.">The clinical progress of mRNA vaccines and immunotherapies.</a> Nature Biotechnology. 40 (6), 840-854 (2022).</li><li>Mulligan, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+I/II+study+of+COVID-19+RNA+vaccine+BNT162b1+in+adults.">Phase I/II study of COVID-19 RNA vaccine BNT162b1 in adults.</a> Nature. 586 (7830), 589-593 (2020).</li><li>Tang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotechnologies+in+delivery+of+DNA+and+mRNA+vaccines+to+the+nasal+and+pulmonary+mucosa.">Nanotechnologies in delivery of DNA and mRNA vaccines to the nasal and pulmonary mucosa.</a> Nanomaterials. 12 (2), 226 (2022).</li><li>Freyn, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multi-targeting,+nucleoside-modified+mRNA+influenza+virus+vaccine+provides+broad+protection+in+mice.">A multi-targeting, nucleoside-modified mRNA influenza virus vaccine provides broad protection in mice.</a> Molecular Therapy. 28 (7), 1569-1584 (2020).</li><li>Wu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variant+SARS-CoV-2+mRNA+vaccines+confer+broad+neutralization+as+primary+or+booster+series+in+mice.">Variant SARS-CoV-2 mRNA vaccines confer broad neutralization as primary or booster series in mice.</a> Vaccine. 39 (51), 7394-7400 (2021).</li><li>Chaudhary, N., Weissman, D., Whitehead, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+vaccines+for+infectious+diseases:+Principles,+delivery+and+clinical+translation.">mRNA vaccines for infectious diseases: Principles, delivery and clinical translation.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 20, 817-838 (2021).</li><li>Kormann, M. S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+therapeutic+proteins+after+delivery+of+chemically+modified+mRNA+in+mice.">Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice.</a> Nature Biotechnology. 29 (2), 154-157 (2011).</li><li>Tavernier, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+as+gene+therapeutic:+How+to+control+protein+expression.">mRNA as gene therapeutic: How to control protein expression.</a> Journal of Controlled Release. 150 (3), 238-247 (2011).</li><li>Walsh, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+immunogenicity+of+two+RNA-based+Covid-19+vaccine+candidates.">Safety and immunogenicity of two RNA-based Covid-19 vaccine candidates.</a> The New England Journal of Medicine. 383 (25), 2439-2450 (2020).</li><li>Baden, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+safety+of+the+mRNA-1273+SARS-CoV-2+vaccine.">Efficacy and safety of the mRNA-1273 SARS-CoV-2 vaccine.</a> The New England Journal of Medicine. 384 (5), 403-416 (2021).</li><li>Guan, S., Rosenecker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotechnologies+in+delivery+of+mRNA+therapeutics+using+nonviral+vector-based+delivery+systems.">Nanotechnologies in delivery of mRNA therapeutics using nonviral vector-based delivery systems.</a> Gene Therapy. 24 (3), 133-143 (2017).</li><li>Sharova, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Database+for+mRNA+half-life+of+19+977+genes+obtained+by+DNA+microarray+analysis+of+pluripotent+and+differentiating+mouse+embryonic+stem+cells.">Database for mRNA half-life of 19 977 genes obtained by DNA microarray analysis of pluripotent and differentiating mouse embryonic stem cells.</a> DNA Research. 16 (1), 45-58 (2009).</li><li>Houseley, J., Tollervey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+many+pathways+of+RNA+degradation.">The many pathways of RNA degradation.</a> Cell. 136 (4), 763-776 (2009).</li><li>Kowalski, P. S., Rudra, A., Miao, L., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivering+the+messenger:+Advances+in+technologies+for+therapeutic+mRNA+delivery.">Delivering the messenger: Advances in technologies for therapeutic mRNA delivery.</a> Molecular Therapy. 27 (4), 710-728 (2019).</li><li>Sahin, U., Karik&#243;, K., T&#252;reci, &. #. 2. 1. 4. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MRNA-based+therapeutics-developing+a+new+class+of+drugs.">MRNA-based therapeutics-developing a new class of drugs.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 13, 359-380 (2014).</li><li>Hajj, K. A., Whitehead, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+translation:+Non-viral+materials+for+therapeutic+mRNA+delivery.">Tools for translation: Non-viral materials for therapeutic mRNA delivery.</a> Nature Reviews Materials. 2, 17056 (2017).</li><li>Deering, R. P., Kommareddy, S., Ulmer, J. B., Brito, L. A., Geall, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+acid+vaccines:+Prospects+for+non-viral+delivery+of+mRNA+vaccines.">Nucleic acid vaccines: Prospects for non-viral delivery of mRNA vaccines.</a> Expert Opinion on Drug Delivery. 11 (6), 885-899 (2014).</li><li>Wadhwa, A., Aljabbari, A., Lokras, A., Foged, C., Thakur, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opportunities+and+challenges+in+the+delivery+of+mRNA-based+vaccines.">Opportunities and challenges in the delivery of mRNA-based vaccines.</a> Pharmaceutics. 12 (2), 102 (2020).</li><li>Hou, X., Zaks, T., Langer, R., Dong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+nanoparticles+for+mRNA+delivery.">Lipid nanoparticles for mRNA delivery.</a> Nature Reviews Materials. 6 (12), 1078-1094 (2021).</li><li>Sahin, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COVID-19+vaccine+BNT162b1+elicits+human+antibody+and+T(H)1+T+cell+responses.">COVID-19 vaccine BNT162b1 elicits human antibody and T(H)1 T cell responses.</a> Nature. 586 (7830), 594-599 (2020).</li><li>Azzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+immune+response+in+BNT162b2+COVID-19+vaccine+recipients.">Mucosal immune response in BNT162b2 COVID-19 vaccine recipients.</a> EBioMedicine. 75, 103788 (2022).</li><li>Guan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+peptide-poloxamine+nanoparticles+enable+in+vitro+and+in+vivo+genome+restoration+for+cystic+fibrosis.">Self-assembled peptide-poloxamine nanoparticles enable in vitro and in vivo genome restoration for cystic fibrosis.</a> Nature Nanotechnology. 14 (3), 287-297 (2019).</li><li>Pitard, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negatively+charged+self-assembling+DNA/poloxamine+nanospheres+for+in+vivo+gene+transfer.">Negatively charged self-assembling DNA/poloxamine nanospheres for in vivo gene transfer.</a> Nucleic Acids Research. 32 (20), 159 (2004).</li><li>Hiroi, T., Shibayama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+particle+size+distribution+in+turbid+solutions+by+dynamic+light+scattering+microscopy.">Measurement of particle size distribution in turbid solutions by dynamic light scattering microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), e54885 (2017).</li><li>Hassett, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+lipid+nanoparticle+size+on+mRNA+vaccine+immunogenicity.">Impact of lipid nanoparticle size on mRNA vaccine immunogenicity.</a> Journal of Controlled Release. 335, 237-246 (2021).</li><li>Suk, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+penetration+of+fresh+undiluted+sputum+expectorated+by+cystic+fibrosis+patients+by+non-adhesive+polymer+nanoparticles.">The penetration of fresh undiluted sputum expectorated by cystic fibrosis patients by non-adhesive polymer nanoparticles.</a> Biomaterials. 30 (13), 2591-2597 (2009).</li><li>Kim, N., Duncan, G. A., Hanes, J., Suk, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barriers+to+inhaled+gene+therapy+of+obstructive+lung+diseases:+A+review.">Barriers to inhaled gene therapy of obstructive lung diseases: A review.</a> Journal of Controlled Release. 240, 465-488 (2016).</li><li>Liu, Z., Fontana, F., Python, A., Hirvonen, J. T., Santos, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+production+of+particles:+Mechanism,+methodology,+and+applications.">Microfluidics for production of particles: Mechanism, methodology, and applications.</a> Small. 16 (9), 1904673 (2020).</li><li>Guan, S., Darmst&#228;dter, M., Xu, C., Rosenecker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+investigations+on+optimizing+and+nebulization+of+IVT-mRNA+formulations+for+potential+pulmonary-based+alpha-1-antitrypsin+deficiency+treatment.">In vitro investigations on optimizing and nebulization of IVT-mRNA formulations for potential pulmonary-based alpha-1-antitrypsin deficiency treatment.</a> Pharmaceutics. 13 (8), 1281 (2021).</li><li>Shepherd, S. J., Issadore, D., Mitchell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+formulation+of+nanoparticles+for+biomedical+applications.">Microfluidic formulation of nanoparticles for biomedical applications.</a> Biomaterials. 274, 120826 (2021).</li><li>Han, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+confined+impingement+jets+mixer+for+flash+nanoprecipitation.">A simple confined impingement jets mixer for flash nanoprecipitation.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 101 (10), 4018-4023 (2012).</li></ol>

Протокол, описанный здесь, не только позволяет экономически эффективно и быстро производить составы вакцины мРНК IVT с определенными свойствами, но также предлагает возможность настройки состава PP-sNp в соответствии с конкретными терапевтическими целями, такими как генная терапия. Чтоб?...

Вакцинация была объявлена одним из наиболее эффективных медицинских вмешательств для снижения заболеваемости и смертности, вызванных инфекционнымизаболеваниями1. Важность вакцин была продемонстрирована со времен вспышки коронавирусной болезни 2019 года (COVID-19). В отличие от традиционной концепции инъекции инактивированных или ослабленных живыми патогенов, современные подходы к вакцинам, такие как вакцины на основе нуклеиновых кислот, концентрируются на сохранении иммуностимулирующих свойств патогенов-мишеней, избегая при этом потенциальных проблем безопасности, связанных с обычным цельным микробным вирусом или в вакцинах на основе бактерий. Вакцины на основе ДНК и РНК (т.е. транскрибированной матричной РНК in vitro, мРНК IVT) демонстрируют профилактический терапевтический потенциал против различных заболеваний, включая инфекционные заболевания и рак 2,3. В принципе, потенциал вакцин на основе нуклеиновых кислот связан с их производством, эффективностью и безопасностью4. Эти вакцины могут быть изготовлены бесклеточным способом, чтобы обеспечить экономически эффективное, масштабируемое и быстрое производство.
Одна вакцина на основе нуклеиновых кислот может кодировать несколько антигенов, что позволяет нацеливаться на многочисленные вирусные варианты или бактерии с уменьшенным количеством прививок и усиливать иммунный ответ против устойчивых патогенов 5,6. Кроме того, вакцины на основе нуклеиновых кислот могут имитировать естественный процесс инвазии вирусной или бактериальной инфекции, вызывая иммунные реакции, опосредованные как В-клетками, так и Т-клетками. В отличие от некоторых вакцин на основе вирусов или ДНК, вакцины на основе мРНК IVT предлагают огромное преимущество с точки зрения безопасности. Они могут быстро экспрессировать желаемый антиген в цитозоле и не интегрированы в геном хозяина, устраняя опасения по поводу вставочного мутагенеза7. IVT-мРНК автоматически разлагается после успешной трансляции, поэтому кинетику экспрессии белка можно легко контролировать 8,9. Катализируемые пандемией коронавируса тяжелого острого респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2), усилия компаний / учреждений по всему миру позволили выпустить на рынок многие типы вакцин. Технология вакцин на основе мРНК IVT демонстрирует большой потенциал и впервые продемонстрировала свой ранее ожидаемый успех благодаря своей быстрой конструкции и гибкой способности адаптироваться к любым целевым антигенам в течение нескольких месяцев. Успех мРНК-вакцин IVT против COVID-19 в клиническом применении не только открыл новую эру исследований и разработок мРНК-вакцины IVT, но и накопил ценный опыт для быстрой разработки эффективных вакцин для борьбы со вспышками инфекционных заболеваний10,11.
Несмотря на многообещающий потенциал мРНК-вакцин IVT, эффективная внутриклеточная доставка мРНК IVT к месту действия (т.е. цитоплазме) продолжает представлять собой серьезное препятствие12, особенно для тех, которые вводятся через дыхательные пути4. МРНК IVT по своей природе является нестабильной молекулой с чрезвычайно коротким периодом полураспада (~ 7 ч)13, что делает мРНК IVT очень склонной к деградации вездесущейРНКазой 14. Лимфоциты врожденной иммунной системы имеют тенденцию поглощать признанную мРНК IVT в случаях применения in vivo . Кроме того, высокая отрицательная плотность заряда и большая молекулярная масса (1x 10 4-1 x 106 Da) мРНК IVT ухудшают ее эффективное проникновение через анионный липидный бислой клеточных мембран15. Поэтому система доставки с определенными биофункциональными материалами необходима для ингибирования деградации молекул мРНК IVT и облегчения клеточного поглощения16.
За исключением нескольких исключительных случаев, когда голая мРНК IVT непосредственно использовалась для исследований in vivo, различные системы доставки используются для переноса мРНК IVT к терапевтическому участку действия17,18. Предыдущие исследования показали, что только несколько мРНК IVT обнаруживаются в цитозоле без помощи системы доставки19. Были разработаны многочисленные стратегии для улучшения доставки РНК с непрерывными усилиями в этой области, начиная от конденсации протамина до инкапсуляции липидов20. Липидные наночастицы (LNP) являются наиболее клинически продвинутыми среди средств доставки мРНК, о чем свидетельствует тот факт, что все одобренные вакцины мРНК COVID-19 для клинического использования используют системы доставки на основе LNP21. Однако LNP не могут опосредовать эффективную трансфекцию мРНК, когда препараты доставляются дыхательным путем22, что удивительно ограничивает применение этих составов в индуцировании иммунных реакций слизистой оболочки или решении заболеваний, связанных с легочной, таких как муковисцидоз или дефицит α1-антитрипсина. Поэтому для решения этой неудовлетворенной потребности требуется разработка новой системы доставки для облегчения эффективной доставки и трансфекции мРНК IVT в клетках, связанных с дыхательными путями.
Подтверждено, что система доставки пептид-полоксаминовых самособранных наночастиц (PP-sNp) может опосредуть эффективную трансфекцию нуклеиновых кислот в дыхательных путях мышей23. PP-sNp использует многофункциональный модульный подход к проектированию, который может интегрировать различные функциональные модули в наночастицы для быстрого скрининга и оптимизации23. Синтетические пептиды и электрически нейтральные амфифильные блок-сополимеры (полоксамин) в PP-sNp могут спонтанно взаимодействовать с мРНК IVT с образованием равномерно распределенных наночастиц с компактной структурой и гладкой поверхностью23. PP-sNp может улучшить эффект трансфекции генов молекул мРНК IVT в культивируемых клетках и дыхательных путях мышей23. В настоящем исследовании описан протокол генерации PP-sNp, содержащий мРНК IVT, который кодирует metridia luciferase (MetLuc-mRNA) (рисунок 1). В этом протоколе используется контролируемое и быстрое смешивание с помощью микрофлюидного смесительного устройства, которое использует конструкцию смешивания елочки в шахматном порядке. Процедура проста в выполнении и позволяет генерировать PP-sNp с более однородными размерами. Общей целью производства PP-sNp с использованием микрофлюидного миксера является создание PP-sNp для комплексообразования мРНК хорошо контролируемым образом, что позволяет эффективно и воспроизводимо трансфекцию клеток in vitro. Настоящий протокол описывает получение, сборку и характеристику PP-sNp, содержащего MetLuc-мРНК.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BamHI</td>
			<td>Takara</td>
			<td>1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cap 1 capping system</td>
			<td>Jinan</td>
			<td>M082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dendritic cell-line</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SCC142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA sequence</td>
			<td>Genescript</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human bronchial epithelial cells</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SCC150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KpnI</td>
			<td>Takara</td>
			<td>1068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LP</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium chloride</td>
			<td>APEXBio</td>
			<td>B6083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malvern Zetasizer Nano ZS90</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>NB007605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic chip</td>
			<td>ZHONGXINQIHENG</td>
			<td>Standard PDMS chip</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate readers</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Varioskan lux</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>ND-ONE-W (A30221)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudouridine</td>
			<td>APE&#215;Bio</td>
			<td>B7972</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quanti-Luc</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>Rep-qlc2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RiboRuler High Range RNA Ladder</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>SM1821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free conical tube</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BS-100-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium 1640</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C11875500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Chemyx</td>
			<td>Fusion 101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 transcription Kit</td>
			<td>Jinan</td>
			<td>E131</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient transfection of in vitro transcribed mrna in cultured cells using peptide-poloxamine nanoparticles

Транскрибированные вакцины in vitro с матричной РНК (мРНК) продемонстрировали огромный потенциал в борьбе с пандемией коронавирусной болезни 2019 года (COVID-19). Эффективные и безопасные системы доставки должны быть включены в мРНК-вакцины из-за хрупких свойств мРНК. Самособранная система доставки генов пептидно-полоксаминовых наночастиц (PP-sNp) специально разработана для легочной доставки нуклеиновых кислот и демонстрирует многообещающие возможности в опосредовании успешной трансфекции мРНК. Здесь описан улучшенный метод получения PP-sNp, чтобы подробно рассказать о том, как PP-sNp инкапсулирует мРНК Metridia luciferase (MetLuc) и успешно трансфектирует культивируемые клетки. MetLuc-mRNA получают процессом транскрипции in vitro из линейного шаблона ДНК. PP-sNp получают путем смешивания синтетического пептида/ полокамина с раствором мРНК с использованием микрофлюидного миксера, что позволяет самостоятельно собирать PP-sNp. Заряд PP-sNp впоследствии оценивается путем измерения дзета-потенциала. Между тем, полидисперсность и гидродинамический размер наночастиц PP-sNp измеряют с помощью динамического рассеяния света. Наночастицы мРНК/PP-sNp трансфектируются в культивируемые клетки, а супернатанты из клеточной культуры анализируются на активность люциферазы. Репрезентативные результаты демонстрируют их способность к трансфекции in vitro. Этот протокол может пролить свет на разработку систем доставки мРНК-вакцин следующего поколения.

Рекомбинантную плазмиду переваривали с образованием линеаризованного шаблона ДНК (рисунок 2А). Используя описанный протокол, набор транскрипции T7 in vitro может производить до 80-120 мкг неограниченной MetLuc-мРНК на реакцию 20 мкл и 50-60 мкг закрытой MetLuc-мРНК на реакцию 100 мкл...

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Transfection of In vitro Transcribed mRNA in Cultured Cells Using Peptide-Poloxamine Nanoparticles at JoVE.com

Efficient Transfection of In vitro Transcribed mRNA in Cultured Cells Using Peptide-Poloxamine Nanoparticles

Самособранная пептидно-полоксаминовая наночастица (PP-sNp) разработана с использованием микрофлюидного смесительного устройства для инкапсулирования и доставки in vitro транскрибированной матричной РНК. Описанная мРНК/PP-sNp может эффективно трансфектировать культивируемые клетки in vitro.

Эффективная трансфекция транскрибированной мРНК in vitro в культивируемых клетках с использованием наночастиц пептид-полоксамин

In vitro transcribed messenger RNA (mRNA) vaccines have displayed enormous potential in fighting against the coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic. ...

Пептидно-полоксаминовые наночастицы являются одной из потенциальных легочных систем доставки мРНК. Наш протокол делает пептидно-полоксаминовые наночастицы с более высокой производительностью и эффективностью, что облегчает разработку мРНК-вакцины слизистой оболочки. Материалы, требуемые техникой, являются недорогими, а протокол может быть завершен в короткие сроки.Пептидно-полоксаминовые наночастицы обладают способностью опосредуть эффективную трансфекцию мРНК. Пептидно-полоксаминовые наночастицы продемонстрировали успешную трансфекцию мРНК в эпителиальных клетках бронхов человека, что предполагает дополнительное применение вакцин против COVID-19 слизистой оболочки, лечение рака легких и генную терапию муковисцидоза. Я ожидаю, что человек будет иметь некоторые базовые знания в смежной области, а также с протоколом и многими методами, прежде чем он или она начнет проводить эксперименты.После синтеза открытой рамки считывания люциферазы Metridia и клонирования ее в вектор pUC57, подготовьте линеаризованный шаблон ДНК с использованием BamHI и KpnI при 37 градусах Цельсия в течение одного часа. Подготовьте реакцию объемом 20 микролитров для синтеза мРНК с использованием набора транскрипции Т7 и псевдоуридина, как описано в рукописи. Тщательно перемешайте компоненты и инкубируйте при 37 градусах Цельсия в течение трех часов.Затем удаляют вторичную структуру 50 мкг мРНК IVT без колпачка, нагревая ее при 65 градусах Цельсия в течение 10 минут. Используйте систему укупорки Cap 1 для укупорки мРНК IVT и приготовьте cap 1 путем изменения структуры колпачка 7-метилгуанозина с использованием S-аденозилметионина и 2'O-метилтрансфераз при 37 градусах Цельсия в течение 30-60 минут. Измерьте концентрацию закрытой мРНК IVT с помощью УФ-видимого спектрофотометра.Используя маркер РНК, проанализируйте молекулярный размер закрытой мРНК IVT в 1% формальдегидно-денатурирующем агарозном геле, содержащем 18% формальдегида. Приготовьте 10 миллиграммов на миллилитр запасного раствора полоксомина 704 путем солюбилизации T704 в воде без нуклеазы. Готовят по 2 миллиграмма на миллилитр запасного раствора пептида путем солюбилизации пептида в воде, свободной от нуклеаз.Хранить приготовленный раствор при 4 градусах Цельсия. Разморозьте мРНК IVT на льду. Перед открытием трубки центрифугируют трубку в 300 раз G в течение трех секунд при комнатной температуре и разбавляют раствор мРНК IVT водой без нуклеаз.Готовят T704 и синтетический пептидный смешанный раствор, разбавляя раствор T704 до восьми микрограммов на микролитр концентрации, а синтетический пептидный раствор до 0,555 мкг на микролитр концентрации, водой без нуклеазы, соответственно. Инкубировать смешанный раствор в течение 15 минут при комнатной температуре перед дальнейшим использованием. Втяните раствор мРНК IVT в шприц длиной в один миллилитр, избегая воздушных зазоров или пузырьков в кончике шприца.Загрузите шприц в одну сторону картриджа рядом с вращающимся блоком. Затем заполните одномиллилитровой шприц раствором T704 и синтетической пептидной смеси и удалите все пузырьки или воздушные зазоры на кончике шприца. Поместите шприц в другое входное отверстие насоса и установите насос с общей скоростью потока от 4 до 10 миллилитров в минуту.Поместите десятимиллилитровую коническую трубку без РНКазы для сбора смешанного раствора мРНК/PP-sNp IVT в конце пути потока смесительного устройства. Запустите насос, чтобы начать смешивание, убедившись, что параметры введены правильно. После запуска насоса в течение шести секунд соберите образец мРНК/PP-sNp IVT из конической трубки.Пластинчатость эпителиальных клеток бронхов человека и дендритная клеточная линия в 96-луночных пластинах за 24 часа до трансфекции. Выращивайте клетки в культуральной среде, дополненной 10% термоинактивированной фетальной бычьей сывороткой и 1% пенициллиновым стрептомицином. После удаления питательной среды промыть покрытые клетки по 0,2 миллилитра на лунку PBS.Добавьте 170 микролитров несывороточной питательной среды к каждой лунке, содержащей покрытые клеточные культуры. Затем добавьте 30 микролитров препарата IVT mRNA/PP-sNp, содержащего 0,4 мкг мРНК Metridia luciferase, в каждую лунку. Инкубируйте клетки с препаратом IVT mRNA/PP-sNp в увлажненной 5%-ной обогащенной углекислым газом атмосфере при температуре 37 градусов Цельсия в течение четырех часов.Аспирировать трансфекционную среду и добавить 0,2 миллилитра свежей питательной среды, дополненной 10% термоинактивированной фетальной бычьей сывороткой и 1% пенициллином стрептомицином. Инкубируйте трансфектированные клетки в течение 24 часов, как было продемонстрировано ранее, и соберите супернатанты, которые будут обнаружены из каждой скважины. Приготовьте свежий раствор для анализа, добавив PBS в субстрат коэлентеразина.Тщательно перемешайте раствор путем вихря в течение 10 секунд. Добавьте 50 микролитров собранного супернатанта в 96-луночную пластину. Настройте микропластинчатый считыватель со временем считывания 1000 миллисекунд и добавьте 30 микролитров раствора коэлентеразина в каждую скважину вручную или путем автоматической инъекции.Сразу после добавления раствора коэлентазина к супернатанту нажмите кнопку Пуск для измерения сигнала люминесценции. Рекомбинантную плазмиду выделяли и переваривали для получения линеаризованного шаблона ДНК. Транскрипция in vitro производила мРНК MetLuc с увеличенной и закрытой крышкой.Клетки, трансфектированные metridia luciferase mRNA/PP-sNp, показали значительно более высокую экспрессию люциферазы по сравнению с теми, кто трансфектирован коммерчески доступным реагентом трансфекции на основе липидов, голой мРНК Metridia люциферазы, PBS или синтетическими пептидами T7044, смешанным раствором в эпителиальных клетках бронхов человека, 16 HBE и дендритной клеточной линией DC2.4 Metridia luciferase mRNA/PP-sNp показала более высокую экспрессию люциферазы, чем LP. защита мРНК MetLuc от деградации и для повышения эффективности трансфекции экзогенной мРНК Metridia люциферазы. Пожалуйста, убедитесь, что синтетическая структура неограниченной Мет-мРНК успешно удалена. Тщательно рассчитайте и загрузите Met-mRNA T704 и пептидное соединение, чтобы подготовить и уплотнить наночастицы полоксомина.Просвечивающая электронная микроскопия может быть выполнена для наблюдения за морфологией пептидно-полоксаминовых наночастиц. Этот метод помогает исследователям разрабатывать мРНК-вакцины слизистой оболочки и обеспечивает высокопроизводительный скрининг составов генной терапии для всех связанных клеток.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Efficient Transfection of In vitro Transcribed mRNA in Cultured Cells Using Peptide-Poloxamine Nanoparticles

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Ретровирусные трансдукция Т-клеточных рецепторов в мышь Т-клеток

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Генотипическая вывода ВИЧ-1 тропизм Использование Популяционные Секвенирование V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Seven Steps to Stellate Cells

Семь шагов к звездчатых клеток

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

Оптимизированный протокол для эффективной трансфекции дендритных клеток без сотового Созревание

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Количественный<em&gt; В пробирке</em&gt; Анализе на определение адгезию нейтрофилов к активированным Первичные человеческие эндотелиальные клетки микрососудов в статических условиях

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Использование флуоресцентных белков для визуализации и количественной<em&gt; Хламидиоз</em&gt; Вакуоли Динамика роста в живых клетках

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Убийца Искусственный антигенпредставляющих клеток (KaAPC) для эффективного<em&gt; In Vitro</em&gt; Истощение человека антиген-специфических Т-клеток

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Высокоэффективная Трансфекцию человека THP-1 макрофагов по Nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Вывод Т-клеток<em&gt; In Vitro</em&gt; От эмбриональных стволовых клеток мыши

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...