Name: efficient transfection of in vitro transcribed mrna in cultured cells using peptide-poloxamine nanoparticles
Uploaded: 2022-08-17T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Transfection of In vitro Transcribed mRNA in Cultured Cells Using Peptide-Poloxamine Nanoparticles at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (NSFC, Subvención No. 82041045 y 82173764), el principal proyecto de Estudio sobre el Sistema de Tecnología de Patogénesis y Prevención de Epidemias (2021YFC2302500) por el Ministerio de Ciencia y Tecnología de China, el Proyecto Chongqing Talents: Exceptional Young Talents (CQYC202005027) y la Fundación de Ciencias Naturales de Chongqing (cstc2021jcyj-msxmX0136). Los autores agradecen al Dr. Xiaoyan Ding por medir el diámetro hidrodinámico (nm) y el índice de polidispersidad (PDI).

1. Transcripción in vitro de ARNm modificado químicamente
NOTA: Se requiere el uso de tubos libres de nucleasa, reactivos, cristalería, puntas de pipeta, etc., porque las RNasas son omnipresentes en el medio ambiente, como soluciones de laboratorio, superficies de instrumentos, cabello, piel, polvo, etc. Limpie bien las superficies y pipetas del banco antes de usarlas, y use guantes para evitar la contaminación por RNasa.
<ol><li>Realizar la linealización de la...

<ol>
	<li>Nature milestones in vaccines. Springer Nature Available from: <a target="_blank" href="https://www.nature.com/collections/hcajdiajij">https://www.nature.com/collections/hcajdiajij</a> (2020)</li><li>Barbier, A. J., Jiang, A. Y., Zhang, P., Wooster, R., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+progress+of+mRNA+vaccines+and+immunotherapies.">The clinical progress of mRNA vaccines and immunotherapies.</a> Nature Biotechnology. 40 (6), 840-854 (2022).</li><li>Mulligan, M. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+immunogenicity+of+two+RNA-based+Covid-19+vaccine+candidates.">Safety and immunogenicity of two RNA-based Covid-19 vaccine candidates.</a> The New England Journal of Medicine. 383 (25), 2439-2450 (2020).</li><li>Baden, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+safety+of+the+mRNA-1273+SARS-CoV-2+vaccine.">Efficacy and safety of the mRNA-1273 SARS-CoV-2 vaccine.</a> The New England Journal of Medicine. 384 (5), 403-416 (2021).</li><li>Guan, S., Rosenecker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotechnologies+in+delivery+of+mRNA+therapeutics+using+nonviral+vector-based+delivery+systems.">Nanotechnologies in delivery of mRNA therapeutics using nonviral vector-based delivery systems.</a> Gene Therapy. 24 (3), 133-143 (2017).</li><li>Sharova, L. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+formulation+of+nanoparticles+for+biomedical+applications.">Microfluidic formulation of nanoparticles for biomedical applications.</a> Biomaterials. 274, 120826 (2021).</li><li>Han, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+confined+impingement+jets+mixer+for+flash+nanoprecipitation.">A simple confined impingement jets mixer for flash nanoprecipitation.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 101 (10), 4018-4023 (2012).</li></ol>

El protocolo descrito aquí no solo permite la producción rentable y rápida de formulaciones de vacunas de ARNm IVT con propiedades definidas, sino que también ofrece la posibilidad de personalizar la formulación de PP-sNp de acuerdo con fines terapéuticos específicos, como la terapia génica. Con el fin de garantizar la generación exitosa de ARNm / PP-sNp IVT, se sugiere prestar especial atención a algunos pasos críticos. Cuando trabaje con ARNm, recuerde siempre que las condiciones libres de RNasa deben manten...

La vacunación ha sido anunciada como una de las intervenciones médicas más eficientes para reducir la morbilidad y mortalidad causadas por enfermedades infecciosas1. La importancia de las vacunas se ha demostrado desde el brote de la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19). A diferencia del concepto tradicional de inyectar patógenos inactivados o vivos atenuados, los enfoques de vacunas de última generación, como las vacunas basadas en ácidos nucleicos, se concentran en preservar las propiedades inmunoestimulantes de los patógenos objetivo al tiempo que evitan los posibles problemas de seguridad asociados con el virus microbiano completo convencional o en las vacunas basadas en bacterias. Tanto las vacunas basadas en ADN como en ARN (es decir, ARN mensajero transcrito in vitro, ARNm IVT) exhiben potencial profiláctico a terapéutico contra una variedad de enfermedades, incluidas las enfermedades infecciosas y los cánceres 2,3. En principio, el potencial de las vacunas basadas en ácidos nucleicos se relaciona con su producción, eficacia y seguridad4. Estas vacunas se pueden fabricar de manera libre de células para permitir una producción rentable, escalable y rápida.
Una sola vacuna basada en ácidos nucleicos puede codificar múltiples antígenos, permitiendo el objetivo de numerosas variantes virales o bacterias con un número reducido de inoculaciones y fortaleciendo la respuesta inmune contra patógenos resilientes 5,6. Además, las vacunas basadas en ácidos nucleicos podrían imitar el proceso de invasión natural de la infección bacteriana o de virus, trayendo respuestas inmunes mediadas por células B y células T. A diferencia de algunas vacunas basadas en virus o en ADN, las vacunas basadas en ARNm IVT ofrecen una gran ventaja en términos de seguridad. Pueden expresar rápidamente el antígeno deseado en el citosol y no están integrados en el genoma del huésped, evitando las preocupaciones sobre la mutagénesis de inserción7. El ARNm de IVT se degrada automáticamente después de una traducción exitosa, por lo que su cinética de expresión de proteínas se puede controlar fácilmente 8,9. Catalizados por la pandemia del coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV-2), los esfuerzos de empresas / instituciones de todo el mundo han permitido el lanzamiento al mercado de muchos tipos de vacunas. La tecnología de vacunas basada en ARNm IVT muestra un gran potencial y, por primera vez, ha demostrado su éxito previamente anticipado, debido a su diseño rápido y capacidad flexible para adaptarse a cualquier antígeno objetivo en varios meses. El éxito de las vacunas de ARNm IVT contra COVID-19 en aplicaciones clínicas no solo abrió una nueva era de investigación y desarrollo de vacunas de ARNm IVT, sino que también acumuló una valiosa experiencia para el rápido desarrollo de vacunas efectivas para tratar brotes de enfermedades infecciosas10,11.
A pesar del potencial prometedor de las vacunas de ARNm IVT, la entrega intracelular eficiente de ARNm IVT al sitio de acción (es decir, citoplasma) continúa planteando un obstáculo importante12, especialmente para aquellos administrados a través de las vías respiratorias4. El ARNm de IVT es inherentemente una molécula inestable con una vida media extremadamente corta (~ 7 h)13, lo que hace que el ARNm de IVT sea altamente propenso a la degradación por la ubicua RNasa14. Los linfocitos del sistema inmune innato tienden a engullir el ARNm IVT reconocido en casos de aplicación in vivo . Además, la alta densidad de carga negativa y el gran peso molecular (1 x 104-1 x 106 Da) del ARNm de IVT perjudican su permeación efectiva a través de la bicapa lipídica aniónica de las membranas celulares15. Por lo tanto, se requiere un sistema de administración con ciertos materiales biofuncionales para inhibir la degradación de las moléculas de ARNm de IVT y facilitar la absorción celular16.
Aparte de algunos casos excepcionales en los que el ARNm de la IVT desnuda fue utilizado directamente para investigaciones in vivo, se utilizan varios sistemas de administración para llevar el ARNm de la IVT al sitio terapéutico de acción17,18. Estudios previos han revelado que sólo unos pocos ARNm IVT son detectados en el citosol sin la ayuda de un sistema de administración19. Se han desarrollado numerosas estrategias para mejorar la entrega de ARN con esfuerzos continuos en el campo, que van desde la condensación de protamina hasta la encapsulación lipídica20. Las nanopartículas lipídicas (PNL) son las más avanzadas clínicamente entre los vehículos de administración de ARNm, como lo demuestra el hecho de que todas las vacunas COVID-19 de ARNm aprobadas para uso clínico emplean sistemas de administración basados en PNL21. Sin embargo, los LNP no pueden mediar la transfección efectiva del ARNm cuando las formulaciones se administran por vía respiratoria22, lo que limita notablemente la aplicación de estas formulaciones para inducir respuestas inmunes de la mucosa o abordar enfermedades relacionadas con la pulmón, como la fibrosis quística o la deficiencia de α1-antitripsina. Por lo tanto, se requiere desarrollar un nuevo sistema de administración para facilitar la administración y transfección eficientes del ARNm de IVT en células relacionadas con las vías respiratorias para resolver esta necesidad no satisfecha.
Se ha confirmado que el sistema de entrega de nanopartículas autoensambladas de péptido-poloxamina (PP-sNp) puede mediar la transfección eficiente de ácidos nucleicos en el tracto respiratorio de ratones23. El PP-sNp adopta un enfoque de diseño modular multifuncional, que puede integrar diferentes módulos funcionales en las nanopartículas para una rápida detección y optimización23. Los péptidos sintéticos y los copolímeros de bloque anfifílico eléctricamente neutros (poloxamina) dentro del PP-sNp pueden interactuar espontáneamente con el ARNm de IVT para generar nanopartículas distribuidas uniformemente con una estructura compacta y superficie lisa23. PP-sNp puede mejorar el efecto de transfección génica de las moléculas de ARNm de IVT en células cultivadas y el tracto respiratorio de ratones23. El presente estudio describe un protocolo para generar PP-sNp que contiene ARNm IVT que codifica Metridia luciferasa (MetLuc-mRNA) (Figura 1). En este protocolo se utiliza una mezcla controlada y rápida a través de un dispositivo de mezcla microfluídica, que emplea el diseño de mezcla escalonada en espiga. El procedimiento es fácil de ejecutar y permite la generación de PP-sNp con tamaños más uniformes. El objetivo general de la producción de PP-sNp utilizando el mezclador microfluídico es crear PP-sNp para la complejación de ARNm de una manera bien controlada, permitiendo así una transfección celular eficiente y reproducible in vitro. El presente protocolo describe la preparación, ensamblaje y caracterización de PP-sNp que contiene MetLuc-mRNA.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BamHI</td>
			<td>Takara</td>
			<td>1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cap 1 capping system</td>
			<td>Jinan</td>
			<td>M082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dendritic cell-line</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SCC142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA sequence</td>
			<td>Genescript</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human bronchial epithelial cells</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SCC150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KpnI</td>
			<td>Takara</td>
			<td>1068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LP</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium chloride</td>
			<td>APEXBio</td>
			<td>B6083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malvern Zetasizer Nano ZS90</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>NB007605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic chip</td>
			<td>ZHONGXINQIHENG</td>
			<td>Standard PDMS chip</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate readers</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Varioskan lux</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>ND-ONE-W (A30221)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudouridine</td>
			<td>APE&#215;Bio</td>
			<td>B7972</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quanti-Luc</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>Rep-qlc2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RiboRuler High Range RNA Ladder</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>SM1821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free conical tube</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BS-100-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium 1640</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C11875500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Chemyx</td>
			<td>Fusion 101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 transcription Kit</td>
			<td>Jinan</td>
			<td>E131</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient transfection of in vitro transcribed mrna in cultured cells using peptide-poloxamine nanoparticles

Las vacunas de ARN mensajero transcritas in vitro (ARNm) han mostrado un enorme potencial en la lucha contra la pandemia de la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19). Los sistemas de administración eficientes y seguros deben incluirse en las vacunas de ARNm debido a las frágiles propiedades del ARNm. Un sistema de administración de genes de nanopartículas de péptido-poloxamina autoensamblado (PP-sNp) está diseñado específicamente para la administración pulmonar de ácidos nucleicos y muestra capacidades prometedoras para mediar la transfección exitosa de ARNm. Aquí, se describe un método mejorado para preparar PP-sNp para explicar cómo el PP-sNp encapsula el ARNm de Metridia luciferase (MetLuc) y transfecta con éxito las células cultivadas. El ARNm de MetLuc se obtiene mediante un proceso de transcripción in vitro a partir de una plantilla de ADN lineal. Un PP-sNp se produce mezclando péptido sintético / poloxamina con solución de ARNm utilizando un mezclador microfluídico, lo que permite el autoensamblaje de PP-sNp. La carga de PP-sNp se evalúa posteriormente midiendo el potencial zeta. Mientras tanto, la polidispersidad y el tamaño hidrodinámico de las nanopartículas de PP-sNp se miden utilizando dispersión dinámica de luz. Las nanopartículas de ARNm/PP-sNp se transfieren en células cultivadas, y los sobrenadantes del cultivo celular se analizan para determinar la actividad de la luciferasa. Los resultados representativos demuestran su capacidad de transfección in vitro. Este protocolo puede arrojar luz sobre el desarrollo de sistemas de administración de vacunas de ARNm de próxima generación.

El plásmido recombinante fue digerido para producir la plantilla de ADN linealizado (Figura 2A). Utilizando el protocolo descrito, el kit de transcripción in vitro T7 puede producir hasta 80-120 μg de ARNm MetLuc sin tapa por reacción de 20 μL y 50-60 μg de ARNm de MetLuc tapado por reacción de 100 μL. Cuando se analiza con electroforesis, el ARNm de MetLuc intacto con alta calidad debe mostrar una banda única y clara, como se muestra en la Figura 2B</s...

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Efficient Transfection of In vitro Transcribed mRNA in Cultured Cells Using Peptide-Poloxamine Nanoparticles

Se desarrolla una nanopartícula de péptido-poloxamina autoensamblada (PP-sNp) utilizando un dispositivo de mezcla microfluídica para encapsular y entregar ARN mensajero transcrito in vitro . El ARNm/PP-sNp descrito podría transfectar eficientemente células cultivadas in vitro.

Transfección eficiente del ARNm transcrito in vitro en células cultivadas utilizando nanopartículas de péptido-poloxamina

In vitro transcribed messenger RNA (mRNA) vaccines have displayed enormous potential in fighting against the coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic. ...

Las nanopartículas de péptido-poloxamina son uno de los posibles sistemas de administración de ARNm pulmonar. Nuestro protocolo fabrica las nanopartículas peptídico-poloxamina con mayor productividad y eficiencia, lo que facilita el desarrollo de la vacuna de ARNm de la mucosa. Los materiales requeridos por la técnica son de bajo costo y el protocolo se puede completar en poco tiempo.Las nanopartículas péptido-poloxamina tienen la capacidad de mediar la transfección eficiente del ARNm. Las nanopartículas de péptido-poloxamina exhibieron una transfección exitosa de ARNm en células epiteliales bronquiales humanas, lo que implica aplicaciones adicionales para las vacunas COVID-19 de la mucosa, el tratamiento de cánceres de pulmón y la terapia génica con fibrosis quística. Espero que el individuo tenga algún conocimiento básico en un campo relacionado y con el protocolo y muchas de las técnicas también, antes de que él o ella comience a realizar los experimentos.Después de sintetizar el marco de lectura abierto de la Metridia luciferasa y clonarlo en el vector pUC57, prepare una plantilla de ADN linealizada usando BamHI y KpnI a 37 grados centígrados durante una hora. Preparar una reacción de volumen de 20 microlitros para la síntesis de ARNm utilizando un kit de transcripción T7 y pseudouridina como se describe en el manuscrito. Mezclar bien los componentes e incubar a 37 grados centígrados durante tres horas.Luego, retire la estructura secundaria de 50 microgramos de ARNm IVT sin tapa calentándolo a 65 grados centígrados durante 10 minutos. Utilice el sistema de taponado Cap 1 para el tapado de ARNm IVT y prepare Cap 1 modificando la estructura del capuchón de 7-metilguanosina utilizando S-adenosilmetionina y 2'O-metiltransferasas a 37 grados centígrados durante 30 a 60 minutos. Mida la concentración de ARNm de IVT tapado con un espectrofotómetro UV-visible.Usando un marcador de ARN, analice el tamaño molecular del ARNm de IVT tapado en un gel de agarosa desnaturalizante de formaldehído al 1% que contiene 18% de formaldehído. Prepare 10 miligramos por mililitro de solución madre de poloxamina 704 solubilizando el T704 en agua libre de nucleasas. Prepare 2 miligramos por mililitro de solución madre del péptido solubilizando el péptido en agua libre de nucleasa.Guarde la solución preparada a 4 grados centígrados. Descongele el ARNm IVT en hielo. Antes de abrir el tubo, centrifugar el tubo a 300 veces G durante tres segundos a temperatura ambiente y diluir la solución de ARNm IVT con agua libre de nucleasa.Prepare T704 y la solución de mezcla de péptidos sintéticos diluyendo la solución de T704 a ocho microgramos por concentración de microlitro, y la solución de péptidos sintéticos a 0.555 microgramos por concentración de microlitro, con agua libre de nucleasa, respectivamente. Incubar la solución mezclada durante 15 minutos a temperatura ambiente antes de seguir usándola. Extraiga la solución de ARNm IVT en una jeringa de un mililitro, evitando espacios de aire o burbujas en la punta de la jeringa.Cargue la jeringa en un lado del cartucho junto al bloque giratorio. Luego, llene una jeringa de un mililitro con T704 y solución de mezcla de péptidos sintéticos, y elimine cualquier burbuja o espacio de aire en la punta de la jeringa. Coloque la jeringa en la otra entrada de la bomba y ajuste la bomba con un caudal total de 4 a 10 mililitros por minuto.Coloque un tubo cónico libre de RNasa de diez mililitros para recolectar la solución mixta de ARNm/PP-sNp IVT al final de la trayectoria de flujo del dispositivo de mezcla. Haga funcionar la bomba para iniciar la mezcla, asegurándose de que los parámetros se ingresen correctamente. Después de hacer funcionar la bomba durante seis segundos, recoja la muestra de ARNm/PP-sNp de la TRI del tubo cónico.Placas de células epiteliales bronquiales humanas y una línea celular dendrítica en placas de 96 pocillos 24 horas antes de la transfección. Cultivar las células en un medio de cultivo suplementado con suero fetal bovino inactivado por calor al 10% y estreptomicina al 1%. Después de retirar el medio de crecimiento, lave las células plateadas con 0,2 mililitros por PBS de pozo.Agregue 170 microlitros de medio de cultivo sin suero a cada pocillo que contenga los cultivos celulares en placas. Luego, agregue 30 microlitros de formulación IVT mRNA / PP-sNp que contenga 0.4 microgramos de ARNm de Metridia luciferase en cada pocillo. Incubar las células con la formulación IVT mRNA/PP-sNp en una atmósfera humidificada enriquecida con dióxido de carbono al 5% a 37 grados centígrados durante cuatro horas.Aspirar el medio de transfección y añadir 0,2 mililitros de medio de cultivo fresco suplementado con suero fetal bovino inactivado térmicamente al 10% y estreptomicina al 1%. Incubar las células transfectadas durante 24 horas como se demostró anteriormente y recoger los sobrenadantes que se detectarán en cada pocillo. Prepare una solución de ensayo fresca agregando PBS al sustrato de celenterazina.Mezcle bien la solución haciendo vórtice durante 10 segundos. Agregue 50 microlitros del sobrenadante recolectado a una placa de 96 pocillos. Configure el lector de microplacas con un tiempo de lectura de 1.000 milisegundos y agregue 30 microlitros de solución de celenterazina a cada pocillo manualmente o mediante inyección automatizada.Inmediatamente después de agregar la solución de celenterazina al sobrenadante, haga clic en Inicio para medir la señal de luminiscencia. El plásmido recombinante fue aislado y digerido para producir la plantilla de ADN lineal. La transcripción in vitro produjo ARNm de MetLuc tapado y tapado.Las células transfectadas con ARNm de Metridia luciferase / PP-sNp mostraron una expresión significativamente mayor de luciferasa en comparación con aquellas transfectadas con reactivo de transfección a base de lípidos disponible comercialmente, ARNm de Metridia luciferasa desnudo, PBS o péptidos sintéticos T7044, solución mixta en células epiteliales bronquiales humanas, 16 HBE y línea celular dendrítica DC2.4 Metridia luciferase mRNA / PP-sNp mostraron una mayor expresión de luciferasa que LP.lo que sugiere que el sistema de administración de PP-sNp es importante para protegiendo el ARNm de MetLuc contra la degradación y promoviendo la eficiencia de transfección del ARNm exógeno de la Metridia luciferasa. Asegúrese de que la estructura sintética del ARNm Met sin tapa se elimine con éxito. Calcule y descargue cuidadosamente el Met-mRNA T704 y el compuesto peptídico para preparar y compactar las nanopartículas de poloxamina.Se puede realizar microscopía electrónica de transmisión para observar la morfología de las nanopartículas de péptido-poloxamina. Esta técnica ayuda a los investigadores a desarrollar vacunas de ARNm de la mucosa y permitir la detección de alto rendimiento de formulaciones de terapia génica para todas las células relacionadas.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Efficient Transfection of In vitro Transcribed mRNA in Cultured Cells Using Peptide-Poloxamine Nanoparticles

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Transducción retroviral de receptores de células T en ratones las células T

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Investigación

Inmunología e Infección

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Inferencia genotípica del VIH-1 tropismo utilizando la población basada en la secuencia de V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

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Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

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Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Cuantitativo<em&gt; In vitro</em&gt; Ensayo para medir la adhesión de neutrófilos al Activado Primaria células endoteliales microvasculares humanas en condiciones estáticas

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

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El uso de proteínas fluorescentes para visualizar y cuantificar<em&gt; Chlamydia</em&gt; Vacuola dinámica de crecimiento en las células vivas

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

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Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

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Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

La transfección altamente eficiente de humanos THP-1 macrófagos por Nucleofection

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Derivación de células T<em&gt; In Vitro</em&gt; De células madre embrionarias de ratón

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