Name: efficient transfection of in vitro transcribed mrna in cultured cells using peptide-poloxamine nanoparticles
Uploaded: 2022-08-17T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Transfection of In vitro Transcribed mRNA in Cultured Cells Using Peptide-Poloxamine Nanoparticles at JoVE.com

Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China (NSFC, Grant No. 82041045 och 82173764), det stora projektet Study on Pathogenesis and Epidemic Prevention Technology System (2021YFC2302500) av Kinas ministerium för vetenskap och teknik, Chongqing Talents: Exceptional Young Talents Project (CQYC202005027) och Natural Science Foundation of Chongqing (cstc2021jcyj-msxmX0136). Författarna är tacksamma mot Dr. Xiaoyan Ding för att ha mätt den hydrodynamiska diametern (nm) och polydispersitetsindexet (PDI).

1. In vitro-transkription av kemiskt modifierat mRNA
OBS: Det är nödvändigt att använda nukleasfria rör, reagenser, glasvaror, pipettspetsar etc., eftersom RNaser är allestädes närvarande i miljön, såsom laboratorielösningar, instrumentytor, hår, hud, damm etc. Rengör bänkytorna och pipetterna noggrant före användning och använd handskar för att undvika RNas-kontaminering.
<ol><li>Utför linjärisering av DNA-mallen.<ol><li>Syntetisera den öppna l...

<ol>
	<li>Nature milestones in vaccines. Springer Nature Available from: <a target="_blank" href="https://www.nature.com/collections/hcajdiajij">https://www.nature.com/collections/hcajdiajij</a> (2020)</li><li>Barbier, A. J., Jiang, A. Y., Zhang, P., Wooster, R., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+progress+of+mRNA+vaccines+and+immunotherapies.">The clinical progress of mRNA vaccines and immunotherapies.</a> Nature Biotechnology. 40 (6), 840-854 (2022).</li><li>Mulligan, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+I/II+study+of+COVID-19+RNA+vaccine+BNT162b1+in+adults.">Phase I/II study of COVID-19 RNA vaccine BNT162b1 in adults.</a> Nature. 586 (7830), 589-593 (2020).</li><li>Tang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotechnologies+in+delivery+of+DNA+and+mRNA+vaccines+to+the+nasal+and+pulmonary+mucosa.">Nanotechnologies in delivery of DNA and mRNA vaccines to the nasal and pulmonary mucosa.</a> Nanomaterials. 12 (2), 226 (2022).</li><li>Freyn, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multi-targeting,+nucleoside-modified+mRNA+influenza+virus+vaccine+provides+broad+protection+in+mice.">A multi-targeting, nucleoside-modified mRNA influenza virus vaccine provides broad protection in mice.</a> Molecular Therapy. 28 (7), 1569-1584 (2020).</li><li>Wu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variant+SARS-CoV-2+mRNA+vaccines+confer+broad+neutralization+as+primary+or+booster+series+in+mice.">Variant SARS-CoV-2 mRNA vaccines confer broad neutralization as primary or booster series in mice.</a> Vaccine. 39 (51), 7394-7400 (2021).</li><li>Chaudhary, N., Weissman, D., Whitehead, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+vaccines+for+infectious+diseases:+Principles,+delivery+and+clinical+translation.">mRNA vaccines for infectious diseases: Principles, delivery and clinical translation.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 20, 817-838 (2021).</li><li>Kormann, M. S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+therapeutic+proteins+after+delivery+of+chemically+modified+mRNA+in+mice.">Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice.</a> Nature Biotechnology. 29 (2), 154-157 (2011).</li><li>Tavernier, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+as+gene+therapeutic:+How+to+control+protein+expression.">mRNA as gene therapeutic: How to control protein expression.</a> Journal of Controlled Release. 150 (3), 238-247 (2011).</li><li>Walsh, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+immunogenicity+of+two+RNA-based+Covid-19+vaccine+candidates.">Safety and immunogenicity of two RNA-based Covid-19 vaccine candidates.</a> The New England Journal of Medicine. 383 (25), 2439-2450 (2020).</li><li>Baden, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+safety+of+the+mRNA-1273+SARS-CoV-2+vaccine.">Efficacy and safety of the mRNA-1273 SARS-CoV-2 vaccine.</a> The New England Journal of Medicine. 384 (5), 403-416 (2021).</li><li>Guan, S., Rosenecker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotechnologies+in+delivery+of+mRNA+therapeutics+using+nonviral+vector-based+delivery+systems.">Nanotechnologies in delivery of mRNA therapeutics using nonviral vector-based delivery systems.</a> Gene Therapy. 24 (3), 133-143 (2017).</li><li>Sharova, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Database+for+mRNA+half-life+of+19+977+genes+obtained+by+DNA+microarray+analysis+of+pluripotent+and+differentiating+mouse+embryonic+stem+cells.">Database for mRNA half-life of 19 977 genes obtained by DNA microarray analysis of pluripotent and differentiating mouse embryonic stem cells.</a> DNA Research. 16 (1), 45-58 (2009).</li><li>Houseley, J., Tollervey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+many+pathways+of+RNA+degradation.">The many pathways of RNA degradation.</a> Cell. 136 (4), 763-776 (2009).</li><li>Kowalski, P. S., Rudra, A., Miao, L., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivering+the+messenger:+Advances+in+technologies+for+therapeutic+mRNA+delivery.">Delivering the messenger: Advances in technologies for therapeutic mRNA delivery.</a> Molecular Therapy. 27 (4), 710-728 (2019).</li><li>Sahin, U., Karik&#243;, K., T&#252;reci, &. #. 2. 1. 4. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MRNA-based+therapeutics-developing+a+new+class+of+drugs.">MRNA-based therapeutics-developing a new class of drugs.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 13, 359-380 (2014).</li><li>Hajj, K. A., Whitehead, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+translation:+Non-viral+materials+for+therapeutic+mRNA+delivery.">Tools for translation: Non-viral materials for therapeutic mRNA delivery.</a> Nature Reviews Materials. 2, 17056 (2017).</li><li>Deering, R. P., Kommareddy, S., Ulmer, J. B., Brito, L. A., Geall, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+acid+vaccines:+Prospects+for+non-viral+delivery+of+mRNA+vaccines.">Nucleic acid vaccines: Prospects for non-viral delivery of mRNA vaccines.</a> Expert Opinion on Drug Delivery. 11 (6), 885-899 (2014).</li><li>Wadhwa, A., Aljabbari, A., Lokras, A., Foged, C., Thakur, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opportunities+and+challenges+in+the+delivery+of+mRNA-based+vaccines.">Opportunities and challenges in the delivery of mRNA-based vaccines.</a> Pharmaceutics. 12 (2), 102 (2020).</li><li>Hou, X., Zaks, T., Langer, R., Dong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+nanoparticles+for+mRNA+delivery.">Lipid nanoparticles for mRNA delivery.</a> Nature Reviews Materials. 6 (12), 1078-1094 (2021).</li><li>Sahin, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COVID-19+vaccine+BNT162b1+elicits+human+antibody+and+T(H)1+T+cell+responses.">COVID-19 vaccine BNT162b1 elicits human antibody and T(H)1 T cell responses.</a> Nature. 586 (7830), 594-599 (2020).</li><li>Azzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+immune+response+in+BNT162b2+COVID-19+vaccine+recipients.">Mucosal immune response in BNT162b2 COVID-19 vaccine recipients.</a> EBioMedicine. 75, 103788 (2022).</li><li>Guan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+peptide-poloxamine+nanoparticles+enable+in+vitro+and+in+vivo+genome+restoration+for+cystic+fibrosis.">Self-assembled peptide-poloxamine nanoparticles enable in vitro and in vivo genome restoration for cystic fibrosis.</a> Nature Nanotechnology. 14 (3), 287-297 (2019).</li><li>Pitard, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negatively+charged+self-assembling+DNA/poloxamine+nanospheres+for+in+vivo+gene+transfer.">Negatively charged self-assembling DNA/poloxamine nanospheres for in vivo gene transfer.</a> Nucleic Acids Research. 32 (20), 159 (2004).</li><li>Hiroi, T., Shibayama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+particle+size+distribution+in+turbid+solutions+by+dynamic+light+scattering+microscopy.">Measurement of particle size distribution in turbid solutions by dynamic light scattering microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), e54885 (2017).</li><li>Hassett, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+lipid+nanoparticle+size+on+mRNA+vaccine+immunogenicity.">Impact of lipid nanoparticle size on mRNA vaccine immunogenicity.</a> Journal of Controlled Release. 335, 237-246 (2021).</li><li>Suk, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+penetration+of+fresh+undiluted+sputum+expectorated+by+cystic+fibrosis+patients+by+non-adhesive+polymer+nanoparticles.">The penetration of fresh undiluted sputum expectorated by cystic fibrosis patients by non-adhesive polymer nanoparticles.</a> Biomaterials. 30 (13), 2591-2597 (2009).</li><li>Kim, N., Duncan, G. A., Hanes, J., Suk, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barriers+to+inhaled+gene+therapy+of+obstructive+lung+diseases:+A+review.">Barriers to inhaled gene therapy of obstructive lung diseases: A review.</a> Journal of Controlled Release. 240, 465-488 (2016).</li><li>Liu, Z., Fontana, F., Python, A., Hirvonen, J. T., Santos, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+production+of+particles:+Mechanism,+methodology,+and+applications.">Microfluidics for production of particles: Mechanism, methodology, and applications.</a> Small. 16 (9), 1904673 (2020).</li><li>Guan, S., Darmst&#228;dter, M., Xu, C., Rosenecker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+investigations+on+optimizing+and+nebulization+of+IVT-mRNA+formulations+for+potential+pulmonary-based+alpha-1-antitrypsin+deficiency+treatment.">In vitro investigations on optimizing and nebulization of IVT-mRNA formulations for potential pulmonary-based alpha-1-antitrypsin deficiency treatment.</a> Pharmaceutics. 13 (8), 1281 (2021).</li><li>Shepherd, S. J., Issadore, D., Mitchell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+formulation+of+nanoparticles+for+biomedical+applications.">Microfluidic formulation of nanoparticles for biomedical applications.</a> Biomaterials. 274, 120826 (2021).</li><li>Han, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+confined+impingement+jets+mixer+for+flash+nanoprecipitation.">A simple confined impingement jets mixer for flash nanoprecipitation.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 101 (10), 4018-4023 (2012).</li></ol>

Protokollet som beskrivs här tillåter inte bara kostnadseffektiv och snabb produktion av IVT mRNA-vaccinformuleringar med definierade egenskaper, men det erbjuder också möjligheten att anpassa PP-sNp-formuleringen enligt specifika terapeutiska ändamål, såsom genterapi. För att säkerställa en framgångsrik generering av IVT mRNA / PP-sNp föreslås att man ägnar extra uppmärksamhet åt några kritiska steg. När du arbetar med mRNA, kom alltid ihåg att RNas-fria förhållanden bör bibehållas under hela proc...

Vaccination har förkunnats som en av de mest effektiva medicinska insatserna för att minska sjukligheten och dödligheten orsakad av infektionssjukdomar1. Vikten av vacciner har visats sedan utbrottet av coronavirussjukdom 2019 (COVID-19). I motsats till det traditionella konceptet att injicera inaktiverade eller levande försvagade patogener koncentreras toppmoderna vaccinmetoder, såsom nukleinsyrabaserade vacciner, på att bevara de immunstimulerande egenskaperna hos målpatogenerna samtidigt som man undviker de potentiella säkerhetsproblemen i samband med de konventionella helmikrobiella virus- eller bakteriebaserade vaccinerna. Både DNA- och RNA -baserade (dvs. in vitro transkriberat budbärar-RNA, IVT mRNA) -baserade vacciner uppvisar profylaktisk till terapeutisk potential mot en mängd olika sjukdomar, inklusive infektionssjukdomar och cancer 2,3. I princip är potentialen hos nukleinsyrabaserade vacciner relaterad till deras produktion, effekt och säkerhet4. Dessa vacciner kan tillverkas på ett cellfritt sätt för att möjliggöra kostnadseffektiv, skalbar och snabb produktion.
Ett enda nukleinsyrabaserat vaccin kan koda för flera antigener, vilket möjliggör målet för många virusvarianter eller bakterier med ett minskat antal inokuleringar och stärker immunsvaret mot fjädrande patogener 5,6. Dessutom kan nukleinsyrabaserade vacciner efterlikna den naturliga invasionsprocessen av virus- eller bakterieinfektion, vilket ger både B-cell- och T-cellmedierade immunsvar. Till skillnad från vissa virus- eller DNA-baserade vacciner erbjuder IVT mRNA-baserade vacciner en enorm fördel när det gäller säkerhet. De kan snabbt uttrycka det önskade antigenet i cytosolen och är inte integrerade i värdgenomet, vilket undanröjer oro för insertional mutagenes7. IVT-mRNA bryts ned automatiskt efter framgångsrik översättning, så dess proteinuttryckskinetik kan enkelt kontrolleras 8,9. Katalyserad av den allvarliga akuta respiratoriska syndromet coronavirus 2 (SARS-CoV-2) pandemi har ansträngningar från företag / institutioner över hela världen möjliggjort frisläppandet på marknaden av många typer av vacciner. IVT mRNA-baserad vaccinteknik visar stor potential och har för första gången visat sin tidigare förväntade framgång tack vare sin snabba design och flexibla förmåga att anpassa sig till alla målantigener inom flera månader. Framgången för IVT mRNA-vacciner mot COVID-19 i kliniska tillämpningar öppnade inte bara en ny era av forskning och utveckling av IVT mRNA-vaccin utan samlade också värdefull erfarenhet för snabb utveckling av effektiva vacciner för att hantera utbrott av infektionssjukdomar10,11.
Trots den lovande potentialen hos IVT mRNA -vacciner fortsätter den effektiva intracellulära leveransen av IVT mRNA till verkningsstället (dvs. cytoplasma) att utgöra ett stort hinder12, särskilt för dem som administreras via luftvägarna4. IVT mRNA är i sig en instabil molekyl med en extremt kort halveringstid (~ 7 h)13, vilket gör IVT mRNA mycket benäget för nedbrytning av det allestädes närvarande RNase14. Lymfocyterna i det medfödda immunsystemet tenderar att uppsluka det erkända IVT-mRNA vid applicering in vivo . Dessutom försämrar den höga negativa laddningstätheten och den stora molekylvikten (1 x 104-1 x 106 Da) av IVT mRNA dess effektiva genomträngning över det anjoniska lipid-dubbelskiktet av cellmembran15. Därför krävs ett leveranssystem med vissa biofunktionella material för att hämma nedbrytningen av IVT-mRNA-molekylerna och underlätta cellulärt upptag16.
Bortsett från några exceptionella fall där naken IVT-mRNA användes direkt för in vivo-undersökningar, används olika leveranssystem för att transportera IVT-mRNA till det terapeutiska verkningsstället17,18. Tidigare studier har visat att endast ett fåtal IVT-mRNA detekteras i cytosol utan hjälp av ett leveranssystem19. Många strategier har utvecklats för att förbättra RNA-leveransen med kontinuerliga ansträngningar inom området, allt från protaminkondensation till lipidinkapsling20. Lipidnanopartiklar (LNP) är de mest kliniskt avancerade bland mRNA-leveransfordonen, vilket bevisas av det faktum att alla godkända mRNA COVID-19-vacciner för klinisk användning använder LNP-baserade leveranssystem21. LNP kan emellertid inte förmedla effektiv mRNA-transfektion när formuleringarna levereras via andningsvägen22, vilket anmärkningsvärt begränsar tillämpningen av dessa formuleringar för att inducera slemhinneimmunsvar eller adressera lungrelaterade sjukdomar såsom cystisk fibros eller α1-antitrypsinbrist. Därför krävs det att utveckla ett nytt leveranssystem för att underlätta effektiv leverans och transfektion av IVT mRNA i luftvägsrelaterade celler för att lösa detta ouppfyllda behov.
Det har bekräftats att peptid-poloxamin självmonterad nanopartikel (PP-sNp) leveranssystem kan förmedla effektiv transfektion av nukleinsyror i luftvägarna hos möss23. PP-sNp antar en multifunktionell modulär designmetod, som kan integrera olika funktionella moduler i nanopartiklarna för snabb screening och optimering23. De syntetiska peptiderna och elektriskt neutrala amfifila blocksampolymererna (poloxamin) inom PP-sNp kan spontant interagera med IVT mRNA för att generera jämnt fördelade nanopartiklar med en kompakt struktur och slät yta23. PP-sNp kan förbättra gentransfektionseffekten av IVT mRNA-molekyler i odlade celler och luftvägarna hos möss23. Denna studie beskriver ett protokoll för att generera PP-sNp innehållande IVT mRNA som kodar metridia luciferas (MetLuc-mRNA) (figur 1). Kontrollerad och snabb blandning via en mikrofluidisk blandningsanordning, som använder den förskjutna sillbensblandningsdesignen, används i detta protokoll. Proceduren är enkel att utföra och möjliggör generering av PP-sNp med mer enhetliga storlekar. Det allmänna målet med PP-sNp-produktion med hjälp av mikrofluidikblandaren är att skapa PP-sNp för mRNA-komplexbildning på ett välkontrollerat sätt, vilket möjliggör effektiv och reproducerbar celltransfektion in vitro. Detta protokoll beskriver beredning, montering och karakterisering av PP-sNp innehållande MetLuc-mRNA.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BamHI</td>
			<td>Takara</td>
			<td>1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cap 1 capping system</td>
			<td>Jinan</td>
			<td>M082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dendritic cell-line</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SCC142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA sequence</td>
			<td>Genescript</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human bronchial epithelial cells</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SCC150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KpnI</td>
			<td>Takara</td>
			<td>1068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LP</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium chloride</td>
			<td>APEXBio</td>
			<td>B6083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malvern Zetasizer Nano ZS90</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>NB007605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic chip</td>
			<td>ZHONGXINQIHENG</td>
			<td>Standard PDMS chip</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate readers</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Varioskan lux</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>ND-ONE-W (A30221)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudouridine</td>
			<td>APE&#215;Bio</td>
			<td>B7972</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quanti-Luc</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>Rep-qlc2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RiboRuler High Range RNA Ladder</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>SM1821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free conical tube</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BS-100-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium 1640</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C11875500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Chemyx</td>
			<td>Fusion 101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 transcription Kit</td>
			<td>Jinan</td>
			<td>E131</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient transfection of in vitro transcribed mrna in cultured cells using peptide-poloxamine nanoparticles

In vitro-transkriberade budbärar-RNA -vacciner (mRNA) har visat enorm potential i kampen mot coronavirussjukdomen 2019 (COVID-19) pandemi. Effektiva och säkra leveranssystem måste inkluderas i mRNA -vaccinerna på grund av mRNA -egenskaperna. Ett självmonterat peptid-poloxaminnanopartikel (PP-sNp) genleveranssystem är speciellt utformat för lungleverans av nukleinsyror och visar lovande förmåga att förmedla framgångsrik mRNA-transfektion. Här beskrivs en förbättrad metod för att förbereda PP-sNp för att utveckla hur PP-sNp kapslar in Metridia luciferase (MetLuc) mRNA och framgångsrikt transfekter odlade celler. MetLuc-mRNA erhålls genom en in vitro-transkriptionsprocess från en linjär DNA-mall. En PP-sNp framställs genom att blanda syntetisk peptid/poloxamin med mRNA-lösning med användning av en mikrofluidisk mixer, vilket möjliggör självmontering av PP-sNp. Laddningen av PP-sNp utvärderas därefter genom att mäta zetapotentialen. Under tiden mäts polydispersiteten och den hydrodynamiska storleken på PP-sNp-nanopartiklar med hjälp av dynamisk ljusspridning. mRNA / PP-sNp-nanopartiklarna transfekteras till odlade celler, och supernatanter från cellkulturen analyseras för luciferasaktivitet. De representativa resultaten visar deras förmåga till in vitro-transfektion. Detta protokoll kan belysa utvecklingen av nästa generations mRNA-vaccinleveranssystem.

Den rekombinanta plasmiden smältes för att producera den linjäriserade DNA-mallen (figur 2A). Med hjälp av det beskrivna protokollet kan T7 in vitro-transkriptionssatsen producera upp till 80-120 μg obegränsad MetLuc-mRNA per 20 μL-reaktion och 50-60 μg täckt MetLuc-mRNA per 100 μL-reaktion. När det analyseras med elektrofores bör intakt MetLuc-mRNA med hög kvalitet visa ett enda och tydligt band, som visas i figur 2B. Föroreningar som inf...

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Transfection of In vitro Transcribed mRNA in Cultured Cells Using Peptide-Poloxamine Nanoparticles at JoVE.com

Efficient Transfection of In vitro Transcribed mRNA in Cultured Cells Using Peptide-Poloxamine Nanoparticles

En självmonterad peptid-poloxaminnanopartikel (PP-sNp) utvecklas med hjälp av en mikrofluidisk blandningsanordning för att kapsla in och leverera in vitro transkriberat budbärar-RNA. Det beskrivna mRNA / PP-sNp kan effektivt transfektera odlade celler in vitro.

Effektiv transfektion av in vitro-transkriberat mRNA i odlade celler med användning av peptid-poloxaminnanopartiklar

In vitro transcribed messenger RNA (mRNA) vaccines have displayed enormous potential in fighting against the coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic. ...

Peptid-poloxamin nanopartiklar är ett av de potentiella lung-mRNA-leveranssystemen. Vårt protokoll gör peptid-poloxaminnanopartiklarna med högre produktivitet och effektivitet, vilket underlättar utvecklingen av mukosalt mRNA-vaccin. Materialen som krävs av tekniken är billiga och protokollet kan slutföras på kort tid.Peptid-poloxaminnanopartiklarna har förmågan att förmedla effektiv mRNA-transfektion. Peptid-poloxaminnanopartiklar uppvisade framgångsrik mRNA-transfektion i humana bronkialepitelceller, vilket innebär ytterligare applikationer för mukosala COVID-19-vacciner, behandling av lungcancer och cystisk fibrosgenterapi. Jag förväntar mig att individen har viss grundläggande kunskap inom ett relaterat område och med protokollet och många av teknikerna också, innan han eller hon börjar utföra experimenten.Efter att ha syntetiserat den öppna läsramen för Metridia luciferas och klonat den i pUC57-vektorn, förbered en linjäriserad DNA-mall med BamHI och KpnI vid 37 grader Celsius i en timme. Förbered en reaktion av 20-mikroliter volym för mRNA-syntes med användning av en T7-transkriptionssats och pseudouridin som beskrivs i manuskriptet. Blanda komponenterna noggrant och inkubera vid 37 grader Celsius i tre timmar.Ta sedan bort den sekundära strukturen på 50 mikrogram otäckt IVT mRNA genom att värma den vid 65 grader Celsius i 10 minuter. Använd Cap 1-kapslingssystemet för IVT-mRNA-kapslingen och förbered Cap 1 genom att modifiera 7-metylguanosin-lockstrukturen med S-adenosylmetionin och 2'O-metyltransferaser vid 37 grader Celsius i 30 till 60 minuter. Mät koncentrationen av kapslat IVT-mRNA med en UV-synlig spektrofotometer.Använd en RNA-markör för att analysera molekylstorleken på kapslad IVT-mRNA i en 1% formaldehyddenaturerande agarosgel innehållande 18% formaldehyd. Bered 10 milligram per milliliter stamlösning av poloxamin 704 genom att solubilisera T704 i nukleasfritt vatten. Bered 2 milligram per milliliter stamlösning av peptiden genom att solubilisera peptiden i nukleasfritt vatten.Förvara den beredda lösningen vid 4 grader Celsius. Tina IVT mRNA på is. Innan du öppnar röret, centrifugera röret vid 300 gånger G i tre sekunder vid rumstemperatur och späd IVT mRNA-lösningen med nukleasfritt vatten.Bered T704 och syntetisk peptidblandningslösning genom att späda T704-lösningen till åtta mikrogram per mikroliterkoncentration och syntetisk peptidlösning till 0,555 mikrogram per mikroliterkoncentration, med nukleasfritt vatten. Inkubera den blandade lösningen i 15 minuter vid rumstemperatur före vidare användning. Dra in IVT mRNA-lösningen i en en-milliliters spruta och undvik luftspalter eller bubblor i sprutspetsen.Ladda sprutan i ena sidan av patronen bredvid det roterande blocket. Fyll sedan en en-milliliter spruta med T704 och syntetisk peptidblandningslösning och ta bort eventuella bubblor eller luftspalter vid sprutspetsen. Placera sprutan i pumpens andra inlopp och ställ in pumpen med en total flödeshastighet på 4 till 10 ml per minut.Placera ett tio milliliter RNas-fritt koniskt rör för att samla upp den blandade IVT mRNA / PP-sNp-lösningen i slutet av blandningsanordningens flödesväg. Kör pumpen för att starta blandningen och se till att parametrarna matas in korrekt. Efter att ha kört pumpen i sex sekunder, samla IVT mRNA / PP-sNp-provet från det koniska röret.Platta humana bronkialepitelceller och en dendritisk cellinje i 96-brunnsplattor 24 timmar före transfektion. Odla cellerna i ett odlingsmedium kompletterat med 10% värmeinaktiverat fosterserum och 1% penicillinstreptomycin. Efter avlägsnande av tillväxtmediet, tvätta de pläterade cellerna med 0,2 ml per brunn PBS.Tillsätt 170 mikroliter serumfritt odlingsmedium till varje brunn som innehåller de pläterade cellkulturerna. Tillsätt sedan 30 mikroliter IVT mRNA / PP-sNp-formulering innehållande 0,4 mikrogram Metridia luciferas mRNA droppvis i varje brunn. Inkubera cellerna med IVT mRNA / PP-sNp-formuleringen i en fuktad 5% koldioxidberikad atmosfär vid 37 grader Celsius i fyra timmar.Aspirera transfektionsmediet och tillsätt 0,2 ml färskt odlingsmedium kompletterat med 10% värmeinaktiverat fosterserum och 1% penicillinstreptomycin. Inkubera de transfekterade cellerna i 24 timmar som visats tidigare och samla supernatanterna som ska detekteras från varje brunn. Förbered en ny analyslösning genom att tillsätta PBS till coelenterazinsubstratet.Blanda lösningen noggrant genom att virvla i 10 sekunder. Tillsätt 50 mikroliter av den uppsamlade supernatanten till en 96-brunnsplatta. Ställ in mikroplattläsaren med en lästid på 1 000 millisekunder och tillsätt 30 mikroliter coelenterazinlösning till varje brunn manuellt eller genom automatisk injektion.Omedelbart efter tillsats av coelenterazinlösningen till supernatanten klickar du på Start för att mäta luminescenssignalen. Den rekombinanta plasmiden isolerades och smältes för att producera den linjäriserade DNA-mallen. In vitro-transkriptionen producerade uppkapslat och begränsat MetLuc mRNA.Celler transfekterade med Metridia luciferas mRNA / PP-sNp visade signifikant högre uttryck av luciferas jämfört med de som transfekterades med kommersiellt tillgängligt lipidbaserat transfektionsreagens, naken Metridia luciferas mRNA, PBS eller T7044 syntetiska peptider, blandad lösning i humana bronkialepitelceller, 16 HBE och dendritisk cellinje DC2.4 Metridia luciferas mRNA / PP-sNp visade högre luciferasuttryck än LP.vilket tyder på att PP-sNp-leveranssystemet är viktigt för skydda MetLuc-mRNA mot nedbrytning och för att främja transfektionseffektiviteten hos det exogena Metridia luciferas-mRNA. Se till att den syntetiska strukturen för obegränsat Met-mRNA har tagits bort. Beräkna och ladda ner Met-mRNA T704 och peptidföreningen noggrant för att förbereda och komprimera poloxaminnanopartiklarna.Transmissionselektronmikroskopi kan utföras för att observera morfologin hos peptid-poloxaminnanopartiklar. Denna teknik hjälper forskare att utveckla mukosala mRNA-vacciner och möjliggöra screening med hög genomströmning av genterapiformuleringar för alla relaterade celler.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Efficient Transfection of In vitro Transcribed mRNA in Cultured Cells Using Peptide-Poloxamine Nanoparticles

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Retroviral Transduction av T-cell receptorer i Mus T-celler

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Genotypisk Inferens av HIV-1 Tropism Använda Befolkning-sekvensering av V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Seven Steps to Stellate Cells

Sju steg till stellate celler

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

Optimerade protokoll för effektiv Transfektion av dendritiska celler utan cellmognaden

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Kvantitativ<em&gt; In vitro</em&gt; Analys för att mäta neutrofilvidhäftning till Aktiverade primära humana mikrovaskulära endotelceller under statiska förhållanden

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Använda fluorescerande proteiner för att visualisera och kvantifiera<em&gt; Klamydia</em&gt; Vacuole tillväxtdynamiken i levande celler

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificiell antigenpresenterande celler (KaAPC) för effektiv<em&gt; In Vitro</em&gt; Utarmning av humant antigen-specifika T-celler

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Mycket effektiv Transfektion av mänskliga THP-1 makrofager från Nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Härledning av T-celler<em&gt; In Vitro</em&gt; Från Mouse embryonala stamceller

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...