Name: efficient transfection of in vitro transcribed mrna in cultured cells using peptide-poloxamine nanoparticles
Uploaded: 2022-08-17T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Transfection of In vitro Transcribed mRNA in Cultured Cells Using Peptide-Poloxamine Nanoparticles at JoVE.com

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (NSFC, Hibe No. 82041045 ve 82173764), Çin Bilim ve Teknoloji Bakanlığı tarafından Patogenez ve Epidemik Önleme Teknoloji Sistemi Çalışması'nın (2021YFC2302500) ana projesi, Chongqing Yetenekleri: Olağanüstü Genç Yetenekler Projesi (CQYC202005027) ve Chongqing Doğa Bilimleri Vakfı (cstc2021jcyj-msxmX0136) tarafından desteklenmiştir. Yazarlar, hidrodinamik çapı (nm) ve polidispersite indeksini (PDI) ölçtüğü için Dr. Xiaoyan Ding'e minnettardır.

1. Kimyasal olarak modifiye edilmiş mRNA'nın in vitro transkripsiyonu
NOT: Nükleaz içermeyen tüplerin, reaktiflerin, cam eşyaların, pipet uçlarının vb. kullanılması gerekir, çünkü RNazlar laboratuvar çözeltileri, cihaz yüzeyleri, saç, cilt, toz vb. gibi ortamlarda her yerde bulunur. Kullanmadan önce tezgah yüzeylerini ve pipetleri iyice temizleyin ve RNase kontaminasyonunu önlemek için eldiven giyin.
<ol><li>DNA kalıbının lineerleştirilmes...

<ol>
	<li>Nature milestones in vaccines. Springer Nature Available from: <a target="_blank" href="https://www.nature.com/collections/hcajdiajij">https://www.nature.com/collections/hcajdiajij</a> (2020)</li><li>Barbier, A. J., Jiang, A. Y., Zhang, P., Wooster, R., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+progress+of+mRNA+vaccines+and+immunotherapies.">The clinical progress of mRNA vaccines and immunotherapies.</a> Nature Biotechnology. 40 (6), 840-854 (2022).</li><li>Mulligan, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+I/II+study+of+COVID-19+RNA+vaccine+BNT162b1+in+adults.">Phase I/II study of COVID-19 RNA vaccine BNT162b1 in adults.</a> Nature. 586 (7830), 589-593 (2020).</li><li>Tang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotechnologies+in+delivery+of+DNA+and+mRNA+vaccines+to+the+nasal+and+pulmonary+mucosa.">Nanotechnologies in delivery of DNA and mRNA vaccines to the nasal and pulmonary mucosa.</a> Nanomaterials. 12 (2), 226 (2022).</li><li>Freyn, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multi-targeting,+nucleoside-modified+mRNA+influenza+virus+vaccine+provides+broad+protection+in+mice.">A multi-targeting, nucleoside-modified mRNA influenza virus vaccine provides broad protection in mice.</a> Molecular Therapy. 28 (7), 1569-1584 (2020).</li><li>Wu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variant+SARS-CoV-2+mRNA+vaccines+confer+broad+neutralization+as+primary+or+booster+series+in+mice.">Variant SARS-CoV-2 mRNA vaccines confer broad neutralization as primary or booster series in mice.</a> Vaccine. 39 (51), 7394-7400 (2021).</li><li>Chaudhary, N., Weissman, D., Whitehead, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+vaccines+for+infectious+diseases:+Principles,+delivery+and+clinical+translation.">mRNA vaccines for infectious diseases: Principles, delivery and clinical translation.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 20, 817-838 (2021).</li><li>Kormann, M. S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+therapeutic+proteins+after+delivery+of+chemically+modified+mRNA+in+mice.">Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice.</a> Nature Biotechnology. 29 (2), 154-157 (2011).</li><li>Tavernier, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+as+gene+therapeutic:+How+to+control+protein+expression.">mRNA as gene therapeutic: How to control protein expression.</a> Journal of Controlled Release. 150 (3), 238-247 (2011).</li><li>Walsh, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+immunogenicity+of+two+RNA-based+Covid-19+vaccine+candidates.">Safety and immunogenicity of two RNA-based Covid-19 vaccine candidates.</a> The New England Journal of Medicine. 383 (25), 2439-2450 (2020).</li><li>Baden, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+safety+of+the+mRNA-1273+SARS-CoV-2+vaccine.">Efficacy and safety of the mRNA-1273 SARS-CoV-2 vaccine.</a> The New England Journal of Medicine. 384 (5), 403-416 (2021).</li><li>Guan, S., Rosenecker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotechnologies+in+delivery+of+mRNA+therapeutics+using+nonviral+vector-based+delivery+systems.">Nanotechnologies in delivery of mRNA therapeutics using nonviral vector-based delivery systems.</a> Gene Therapy. 24 (3), 133-143 (2017).</li><li>Sharova, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Database+for+mRNA+half-life+of+19+977+genes+obtained+by+DNA+microarray+analysis+of+pluripotent+and+differentiating+mouse+embryonic+stem+cells.">Database for mRNA half-life of 19 977 genes obtained by DNA microarray analysis of pluripotent and differentiating mouse embryonic stem cells.</a> DNA Research. 16 (1), 45-58 (2009).</li><li>Houseley, J., Tollervey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+many+pathways+of+RNA+degradation.">The many pathways of RNA degradation.</a> Cell. 136 (4), 763-776 (2009).</li><li>Kowalski, P. S., Rudra, A., Miao, L., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivering+the+messenger:+Advances+in+technologies+for+therapeutic+mRNA+delivery.">Delivering the messenger: Advances in technologies for therapeutic mRNA delivery.</a> Molecular Therapy. 27 (4), 710-728 (2019).</li><li>Sahin, U., Karik&#243;, K., T&#252;reci, &. #. 2. 1. 4. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MRNA-based+therapeutics-developing+a+new+class+of+drugs.">MRNA-based therapeutics-developing a new class of drugs.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 13, 359-380 (2014).</li><li>Hajj, K. A., Whitehead, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+translation:+Non-viral+materials+for+therapeutic+mRNA+delivery.">Tools for translation: Non-viral materials for therapeutic mRNA delivery.</a> Nature Reviews Materials. 2, 17056 (2017).</li><li>Deering, R. P., Kommareddy, S., Ulmer, J. B., Brito, L. A., Geall, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+acid+vaccines:+Prospects+for+non-viral+delivery+of+mRNA+vaccines.">Nucleic acid vaccines: Prospects for non-viral delivery of mRNA vaccines.</a> Expert Opinion on Drug Delivery. 11 (6), 885-899 (2014).</li><li>Wadhwa, A., Aljabbari, A., Lokras, A., Foged, C., Thakur, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opportunities+and+challenges+in+the+delivery+of+mRNA-based+vaccines.">Opportunities and challenges in the delivery of mRNA-based vaccines.</a> Pharmaceutics. 12 (2), 102 (2020).</li><li>Hou, X., Zaks, T., Langer, R., Dong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+nanoparticles+for+mRNA+delivery.">Lipid nanoparticles for mRNA delivery.</a> Nature Reviews Materials. 6 (12), 1078-1094 (2021).</li><li>Sahin, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COVID-19+vaccine+BNT162b1+elicits+human+antibody+and+T(H)1+T+cell+responses.">COVID-19 vaccine BNT162b1 elicits human antibody and T(H)1 T cell responses.</a> Nature. 586 (7830), 594-599 (2020).</li><li>Azzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+immune+response+in+BNT162b2+COVID-19+vaccine+recipients.">Mucosal immune response in BNT162b2 COVID-19 vaccine recipients.</a> EBioMedicine. 75, 103788 (2022).</li><li>Guan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+peptide-poloxamine+nanoparticles+enable+in+vitro+and+in+vivo+genome+restoration+for+cystic+fibrosis.">Self-assembled peptide-poloxamine nanoparticles enable in vitro and in vivo genome restoration for cystic fibrosis.</a> Nature Nanotechnology. 14 (3), 287-297 (2019).</li><li>Pitard, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negatively+charged+self-assembling+DNA/poloxamine+nanospheres+for+in+vivo+gene+transfer.">Negatively charged self-assembling DNA/poloxamine nanospheres for in vivo gene transfer.</a> Nucleic Acids Research. 32 (20), 159 (2004).</li><li>Hiroi, T., Shibayama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+particle+size+distribution+in+turbid+solutions+by+dynamic+light+scattering+microscopy.">Measurement of particle size distribution in turbid solutions by dynamic light scattering microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), e54885 (2017).</li><li>Hassett, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+lipid+nanoparticle+size+on+mRNA+vaccine+immunogenicity.">Impact of lipid nanoparticle size on mRNA vaccine immunogenicity.</a> Journal of Controlled Release. 335, 237-246 (2021).</li><li>Suk, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+penetration+of+fresh+undiluted+sputum+expectorated+by+cystic+fibrosis+patients+by+non-adhesive+polymer+nanoparticles.">The penetration of fresh undiluted sputum expectorated by cystic fibrosis patients by non-adhesive polymer nanoparticles.</a> Biomaterials. 30 (13), 2591-2597 (2009).</li><li>Kim, N., Duncan, G. A., Hanes, J., Suk, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barriers+to+inhaled+gene+therapy+of+obstructive+lung+diseases:+A+review.">Barriers to inhaled gene therapy of obstructive lung diseases: A review.</a> Journal of Controlled Release. 240, 465-488 (2016).</li><li>Liu, Z., Fontana, F., Python, A., Hirvonen, J. T., Santos, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+production+of+particles:+Mechanism,+methodology,+and+applications.">Microfluidics for production of particles: Mechanism, methodology, and applications.</a> Small. 16 (9), 1904673 (2020).</li><li>Guan, S., Darmst&#228;dter, M., Xu, C., Rosenecker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+investigations+on+optimizing+and+nebulization+of+IVT-mRNA+formulations+for+potential+pulmonary-based+alpha-1-antitrypsin+deficiency+treatment.">In vitro investigations on optimizing and nebulization of IVT-mRNA formulations for potential pulmonary-based alpha-1-antitrypsin deficiency treatment.</a> Pharmaceutics. 13 (8), 1281 (2021).</li><li>Shepherd, S. J., Issadore, D., Mitchell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+formulation+of+nanoparticles+for+biomedical+applications.">Microfluidic formulation of nanoparticles for biomedical applications.</a> Biomaterials. 274, 120826 (2021).</li><li>Han, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+confined+impingement+jets+mixer+for+flash+nanoprecipitation.">A simple confined impingement jets mixer for flash nanoprecipitation.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 101 (10), 4018-4023 (2012).</li></ol>

Burada açıklanan protokol sadece tanımlanmış özelliklere sahip IVT mRNA aşı formülasyonlarının uygun maliyetli ve hızlı üretimine izin vermekle kalmaz, aynı zamanda PP-sNp formülasyonunu gen terapisi gibi spesifik terapötik amaçlara göre özelleştirme imkanı da sunar. IVT mRNA/PP-sNp'nin başarılı bir şekilde üretilmesini sağlamak için, bazı kritik adımlara daha fazla dikkat edilmesi önerilir. mRNA ile çalışırken, süreç boyunca RNaz içermeyen koşulların korunması gerektiğini daima...

Aşılama, bulaşıcı hastalıkların neden olduğu morbidite ve mortaliteyi azaltmaya yönelik en etkili tıbbi müdahalelerden biri olarak müjdelenmiştir1. Aşıların önemi, koronavirüs hastalığının 2019 (COVID-19) salgınından bu yana gösterilmiştir. Geleneksel inaktive edilmiş veya canlı zayıflatılmış patojenlerin enjekte edilmesi kavramının aksine, nükleik asit bazlı aşılar gibi son teknoloji aşı yaklaşımları, geleneksel bütün mikrobiyal virüs veya bakteri bazlı aşılarla ilişkili potansiyel güvenlik sorunlarından kaçınırken, hedef patojenlerin bağışıklık uyarıcı özelliklerini korumaya odaklanır. Hem DNA hem de RNA (yani, in vitro transkribe edilmiş mesajcı RNA, IVT mRNA) bazlı aşılar, bulaşıcı hastalıklar ve kanserler de dahil olmak üzere çeşitli hastalıklara karşı profilaktik ila terapötik potansiyel sergiler 2,3. Prensip olarak, nükleik asit bazlı aşıların potansiyeli, üretimleri, etkinlikleri ve güvenlikleri ile ilgilidir4. Bu aşılar, uygun maliyetli, ölçeklenebilir ve hızlı üretime izin vermek için hücresiz bir şekilde üretilebilir.
Tek bir nükleik asit bazlı aşı, birden fazla antijeni kodlayabilir, bu da çok sayıda viral varyantın veya bakterinin daha az sayıda aşılama ile hedeflenmesini sağlar ve dirençli patojenlere karşı bağışıklık tepkisini güçlendirir 5,6. Ayrıca, nükleik asit bazlı aşılar, virüs veya bakteriyel enfeksiyonun doğal istila sürecini taklit edebilir ve hem B hücresi hem de T hücresi aracılı bağışıklık tepkileri getirebilir. Bazı virüs veya DNA bazlı aşıların aksine, IVT mRNA bazlı aşılar güvenlik açısından büyük bir avantaj sunar. Sitosolde istenen antijeni hızlı bir şekilde eksprese edebilirler ve konakçı genomuna entegre edilmezler, bu da yerleştirme mutajenezi7 ile ilgili endişeleri ortadan kaldırır. IVT-mRNA başarılı translasyondan sonra otomatik olarak parçalanır, bu nedenle protein ekspresyon kinetiği kolayca kontrol edilebilir 8,9. Şiddetli akut solunum sendromu koronavirüs 2 (SARS-CoV-2) pandemisi tarafından katalize edilen dünya çapındaki şirketlerin/kurumların çabaları, birçok aşı türünün piyasaya sürülmesini sağlamıştır. IVT mRNA tabanlı aşı teknolojisi büyük bir potansiyel göstermektedir ve ilk kez, hızlı tasarımı ve birkaç ay içinde herhangi bir hedef antijene uyum sağlama esnekliği sayesinde daha önce beklenen başarısını göstermiştir. IVT mRNA aşılarının COVID-19'a karşı klinik uygulamalardaki başarısı sadece IVT mRNA aşısı araştırma ve geliştirmede yeni bir çağ açmakla kalmadı, aynı zamanda bulaşıcı hastalık salgınlarıyla başa çıkmak için etkili aşıların hızlı bir şekilde geliştirilmesi için değerli deneyimler biriktirdi10,11.
IVT mRNA aşılarının umut verici potansiyeline rağmen, IVT mRNA'nın etki bölgesine (yani sitoplazmaya) etkili hücre içi iletimi, özellikle hava yolları 4 yoluyla uygulananlar için büyük bir engel12 oluşturmaya devam etmektedir. IVT mRNA, doğası gereği son derece kısa bir yarı ömre (~ 7 saat) 13 sahip kararsız bir moleküldür ve bu da IVT mRNA'yı her yerde bulunan RNaz14 tarafından bozulmaya oldukça eğilimli hale getirir. Doğuştan gelen bağışıklık sisteminin lenfositleri, in vivo uygulama durumlarında tanınan IVT mRNA'yı yutma eğilimindedir. Ayrıca, IVT mRNA'nın yüksek negatif yük yoğunluğu ve büyük moleküler ağırlığı (1 x 104-1 x 106 Da), hücresel membranların anyonik lipid çift katmanı boyunca etkili geçirgenliğini bozar15. Bu nedenle, IVT mRNA moleküllerinin bozulmasını inhibe etmek ve hücresel alımı kolaylaştırmak için belirli biyo-fonksiyonel materyallere sahip bir dağıtım sistemi gereklidir16.
Çıplak IVT mRNA'nın in vivo araştırmalar için doğrudan kullanıldığı birkaç istisnai durum dışında, IVT mRNA'yı terapötik etki bölgesine taşımak için çeşitli dağıtım sistemleri kullanılmaktadır17,18. Önceki çalışmalar, bir dağıtım sisteminin yardımı olmadan sitosolde sadece birkaç IVT mRNA'nın tespit edildiğini ortaya koymuştur19. Protamin yoğuşmasından lipit kapsüllemesine kadar sahada sürekli çabalarla RNA iletimini iyileştirmek için çok sayıda strateji geliştirilmiştir20. Lipid nanopartikülleri (LNP'ler), klinik kullanım için onaylanmış tüm mRNA COVID-19 aşılarının LNP tabanlı dağıtım sistemleri kullanması gerçeğiyle kanıtlandığı gibi, mRNA dağıtım araçları arasında klinik olarak en gelişmiş olanlardır21. Bununla birlikte, LNP'ler, formülasyonlar solunum yolu22 üzerinden verildiğinde etkili mRNA transfeksiyonuna aracılık edemez, bu da bu formülasyonların mukozal immün yanıtları indüklemede veya kistik fibroz veya α1-antitripsin eksikliği gibi pulmoner ile ilişkili hastalıkların ele alınmasında uygulanmasını önemli ölçüde sınırlar. Bu nedenle, IVT mRNA'nın hava yolu ile ilgili hücrelerde verimli bir şekilde verilmesini ve transfeksiyonunu kolaylaştırmak için yeni bir dağıtım sistemi geliştirmek, bu karşılanmamış ihtiyacı çözmek için gereklidir.
Peptit-poloksamin kendinden montajlı nanopartikül (PP-sNp) dağıtım sisteminin, farelerin solunum yollarındaki nükleik asitlerin verimli transfeksiyonuna aracılık edebileceği doğrulanmıştır23. PP-sNap, hızlı tarama ve optimizasyon için farklı fonksiyonel modülleri nanopartiküllere entegre edebilen çok işlevli bir modüler tasarım yaklaşımıbenimser23. PP-sNp içindeki sentetik peptitler ve elektriksel olarak nötr amfifilik blok kopolimerleri (poloksamin), kompakt bir yapıya ve pürüzsüz bir yüzeye sahip düzgün dağılmış nanopartiküller üretmek için IVT mRNA ile kendiliğinden etkileşime girebilir23. PP-sNb, kültürlü hücrelerde IVT mRNA moleküllerinin gen transfeksiyon etkisini ve farelerin solunum yollarını artırabilir23. Bu çalışmada, Metridia lusiferazı (MetLuc-mRNA) kodlayan IVT mRNA içeren PP-sNp üretmek için bir protokol tanımlanmaktadır (Şekil 1). Bu protokolde, kademeli balıksırtı karıştırma tasarımını kullanan bir mikroakışkan karıştırma cihazı aracılığıyla kontrollü ve hızlı karıştırma kullanılmaktadır. Prosedürün uygulanması kolaydır ve daha düzgün boyutlarda PP-sNp oluşturulmasına izin verir. Mikroakışkan karıştırıcı kullanılarak PP-sNp üretiminin genel amacı, mRNA kompleksi için PP-sNp'yi iyi kontrol edilen bir şekilde oluşturmak ve böylece in vitro olarak verimli ve tekrarlanabilir hücre transfeksiyonuna izin vermektir. Mevcut protokol, MetLuc-mRNA içeren PP-sNp'nin hazırlanmasını, birleştirilmesini ve karakterizasyonunu açıklamaktadır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BamHI</td>
			<td>Takara</td>
			<td>1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cap 1 capping system</td>
			<td>Jinan</td>
			<td>M082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dendritic cell-line</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SCC142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA sequence</td>
			<td>Genescript</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human bronchial epithelial cells</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SCC150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KpnI</td>
			<td>Takara</td>
			<td>1068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LP</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium chloride</td>
			<td>APEXBio</td>
			<td>B6083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malvern Zetasizer Nano ZS90</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>NB007605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic chip</td>
			<td>ZHONGXINQIHENG</td>
			<td>Standard PDMS chip</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate readers</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Varioskan lux</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>ND-ONE-W (A30221)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudouridine</td>
			<td>APE&#215;Bio</td>
			<td>B7972</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quanti-Luc</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>Rep-qlc2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RiboRuler High Range RNA Ladder</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>SM1821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free conical tube</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BS-100-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium 1640</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C11875500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Chemyx</td>
			<td>Fusion 101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 transcription Kit</td>
			<td>Jinan</td>
			<td>E131</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient transfection of in vitro transcribed mrna in cultured cells using peptide-poloxamine nanoparticles

In vitro transkribe edilmiş mesajcı RNA (mRNA) aşıları, koronavirüs hastalığı 2019 (COVID-19) pandemisine karşı mücadelede muazzam bir potansiyel göstermiştir. mRNA'nın kırılgan özelliklerinden dolayı mRNA aşılarına etkin ve güvenli dağıtım sistemleri dahil edilmelidir. Kendinden montajlı bir peptid-poloksamin nanopartikül (PP-sNp) gen dağıtım sistemi, nükleik asitlerin pulmoner iletimi için özel olarak tasarlanmıştır ve başarılı mRNA transfeksiyonuna aracılık etmede umut verici yetenekler gösterir. Burada, PP-sNp'nin Metridia lusiferaz (MetLuc) mRNA'sını nasıl kapsüllediğini ve kültürlenmiş hücreleri başarıyla nasıl transfekte ettiğini detaylandırmak için PP-sNp hazırlamak için geliştirilmiş bir yöntem açıklanmaktadır. MetLuc-mRNA, lineer bir DNA şablonundan in vitro transkripsiyon işlemi ile elde edilir. Bir PP-sNk, sentetik peptit/poloksaminin mikroakışkan bir karıştırıcı kullanılarak mRNA çözeltisi ile karıştırılmasıyla üretilir ve PP-sNp'nin kendi kendine montajına izin verir. PP-sNp yükü daha sonra zeta potansiyeli ölçülerek değerlendirilir. Bu arada, PP-sNp nanopartiküllerinin polidispersitesi ve hidrodinamik boyutu, dinamik ışık saçılması kullanılarak ölçülür. mRNA / PP-sNp nanopartikülleri kültürlenmiş hücrelere transfekte edilir ve hücre kültüründen süpernatanlar lusiferaz aktivitesi için test edilir. Temsili sonuçlar in vitro transfeksiyon kapasitelerini göstermektedir. Bu protokol, yeni nesil mRNA aşı dağıtım sistemlerinin geliştirilmesine ışık tutabilir.

Rekombinant plazmid, doğrusallaştırılmış DNA şablonunu üretmek için sindirildi (Şekil 2A). Açıklanan protokolü kullanarak, T7 in vitro transkripsiyon kiti, 20 μL reaksiyon başına 80-120 μg'a kadar açılmamış MetLuc-mRNA ve 100 μL reaksiyon başına 50-60 μg kapaklı MetLuc-mRNA üretebilir. Elektroforez ile analiz edildiğinde, yüksek kalitede bozulmamış MetLuc-mRNA, Şekil 2B'de gösterildiği gibi tek ve net bir bant gösterme...

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Transfection of In vitro Transcribed mRNA in Cultured Cells Using Peptide-Poloxamine Nanoparticles at JoVE.com

Efficient Transfection of In vitro Transcribed mRNA in Cultured Cells Using Peptide-Poloxamine Nanoparticles

Kendinden montajlı bir peptid-poloksamin nanopartikülü (PP-sNp), in vitro transkribe edilmiş mesajcı RNA'yı kapsüllemek ve iletmek için mikroakışkan bir karıştırma cihazı kullanılarak geliştirilmiştir. Tanımlanan mRNA / PP-sNp, in vitro kültürlenmiş hücreleri verimli bir şekilde transfekt edebilir.

Peptit-Poloksamin Nanopartikülleri Kullanılarak Kültürlenmiş Hücrelerde In vitro Transkribe mRNA'nın Verimli Transfeksiyonu

In vitro transcribed messenger RNA (mRNA) vaccines have displayed enormous potential in fighting against the coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic. ...

Peptit-poloksamin nanopartikülleri potansiyel pulmoner mRNA dağıtım sistemlerinden biridir. Protokolümüz, peptid-poloksamin nanopartiküllerini daha yüksek verimlilik ve verimlilikle yapar ve bu da mukozal mRNA aşısının geliştirilmesini kolaylaştırır. Tekniğin gerektirdiği malzemeler düşük maliyetlidir ve protokol kısa sürede tamamlanabilir.Peptit-poloksamin nanopartikülleri, verimli mRNA transfeksiyonuna aracılık etme yeteneğine sahiptir. Peptit-poloksamin nanopartikülleri, insan bronşiyal epitel hücrelerinde başarılı mRNA transfeksiyonu sergiledi ve bu da mukozal COVID-19 aşıları, akciğer kanserlerinin tedavisi ve kistik fibroz gen tedavisi için ek uygulamaları içeriyor. Bireyin deneyleri yapmaya başlamadan önce ilgili bir alanda, protokolde ve birçok teknikte bazı temel bilgilere sahip olmasını bekliyorum.Metridia lusiferazın açık okuma çerçevesini sentezledikten ve pUC57 vektörüne klonladıktan sonra, bir saat boyunca 37 santigrat derecede BamHI ve KpnI kullanarak doğrusallaştırılmış bir DNA şablonu hazırlayın. Makalede açıklandığı gibi bir T7 transkripsiyon kiti ve psödoüridin kullanarak mRNA sentezi için 20 mikrolitre hacimli bir reaksiyon hazırlayın. Bileşenleri iyice karıştırın ve üç saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.Daha sonra, 50 mikrogram açılmamış IVT mRNA'nın ikincil yapısını, 10 dakika boyunca 65 santigrat derecede ısıtarak çıkarın. IVT mRNA kapağı için Cap 1 kapak sistemini kullanın ve 30 ila 60 dakika boyunca 37 santigrat derecede S-adenosilmetiyonin ve 2'O-metiltransferazlar kullanarak 7-metilguanosin kapak yapısını değiştirerek Cap 1'i hazırlayın. Kapaklı IVT mRNA'nın konsantrasyonunu UV görünür bir spektrofotometre ile ölçün.Bir RNA belirteci kullanarak,% 18 formaldehit içeren% 1 formaldehit denatüre edici agaroz jelinde kapaklı IVT mRNA'nın moleküler boyutunu analiz edin. T704'ü nükleaz içermeyen suda çözündürerek mililitre başına 10 miligram poloksamin 704 stok çözeltisi hazırlayın. Peptitin nükleaz içermeyen suda çözündürülmesini sağlayarak peptidin mililitre stok çözeltisi başına 2 miligram hazırlayın.Hazırlanan çözeltiyi 4 santigrat derecede saklayın. IVT mRNA'yı buz üzerinde çözün. Tüpü açmadan önce, tüpü oda sıcaklığında üç saniye boyunca 300 kez G'de santrifüj edin ve IVT mRNA çözeltisini nükleaz içermeyen suyla seyreltin.T704 çözeltisini mikrolitre konsantrasyon başına sekiz mikrograma ve sentetik peptit çözeltisini nükleaz içermeyen su ile sırasıyla mikrolitre konsantrasyon başına 0.555 mikrograma seyrelterek T704 ve sentetik peptit karışım çözeltisi hazırlayın. Daha fazla kullanmadan önce karışık çözeltiyi oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. IVT mRNA çözeltisini bir mililitrelik bir şırıngaya çekerek şırınga ucundaki hava boşluklarından veya kabarcıklardan kaçının.Şırıngayı kartuşun bir tarafına döner bloğun yanına yerleştirin. Ardından, bir mililitrelik bir şırıngayı T704 ve sentetik peptit karışım çözeltisi ile doldurun ve şırınga ucundaki kabarcıkları veya hava boşluklarını giderin. Şırıngayı pompanın diğer girişine yerleştirin ve pompayı dakikada toplam 4 ila 10 mililitre akış hızına ayarlayın.Karıştırma cihazının akış yolunun sonuna karışık IVT mRNA / PP-sNp çözeltisini toplamak için on mililitrelik RNaz içermeyen bir konik tüp yerleştirin. Karıştırmayı başlatmak için pompayı çalıştırın ve parametrelerin doğru girildiğinden emin olun. Pompayı altı saniye çalıştırdıktan sonra, IVT mRNA / PP-sNp örneğini konik tüpten toplayın.Transfeksiyondan 24 saat önce 96 delikli plakalarda insan bronşiyal epitel hücreleri ve dendritik hücre hattı. Hücreleri% 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal sığır serumu ve% 1 penisilin streptomisin ile desteklenmiş bir kültür ortamında büyütün. Büyüme ortamını çıkardıktan sonra, kaplanmış hücreleri kuyu başına 0.2 mililitre PBS ile yıkayın.Kaplanmış hücre kültürlerini içeren her bir kuyucuğa 170 mikrolitre serumsuz kültür ortamı ekleyin. Daha sonra, her bir kuyucuğa akıllıca damlayan 0.4 mikrogram Metridia lusiferaz mRNA içeren 30 mikrolitre IVT mRNA / PP-sNp formülasyonu ekleyin. IVT mRNA / PP-sNp formülasyonu ile hücreleri, nemlendirilmiş% 5 karbondioksit ile zenginleştirilmiş bir atmosferde 37 santigrat derecede dört saat boyunca inkübe edin.Transfeksiyon ortamını aspire edin ve% 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal sığır serumu ve% 1 penisilin streptomisin ile desteklenmiş 0.2 mililitre taze kültür ortamı ekleyin. Transfekte hücreleri daha önce gösterildiği gibi 24 saat boyunca inkübe edin ve her bir kuyucuktan tespit edilecek süpernatantları toplayın. Koelenterazine substratına PBS ekleyerek yeni bir tahlil çözeltisi hazırlayın.Çözeltiyi 10 saniye boyunca vorteks yaparak iyice karıştırın. Toplanan süpernatantın 50 mikrolitresini 96 kuyucuklu bir plakaya ekleyin. Mikroplaka okuyucuyu 1.000 milisaniyelik bir okuma süresiyle ayarlayın ve her bir kuyucuğa manuel olarak veya otomatik enjeksiyonla 30 mikrolitre koelenterazine çözeltisi ekleyin.Coelenterazine çözeltisini süpernatana ekledikten hemen sonra, lüminesans sinyalini ölçmek için Başlat'a tıklayın. Rekombinant plazmid, lineerleştirilmiş DNA şablonunu üretmek için izole edildi ve sindirildi. In vitro transkripsiyon, kapaklı ve kapaklı MetLuc mRNA üretti.Metridia lusiferaz mRNA / PP-sNp ile transfekte edilen hücreler, ticari olarak temin edilebilen lipit bazlı transfeksiyon reaktifi, çıplak Metridia lusiferaz mRNA, PBS veya T7044 sentetik peptitler, insan bronşiyal epitel hücrelerinde karışık çözelti, 16 HBE ve dendritik hücre hattı DC2.4 Metridia lusiferaz mRNA / PP-sNp ile transfekte edilenlere kıyasla önemli ölçüde daha yüksek lusiferaz ekspresyonu göstermiştir.PP-sNp dağıtım sisteminin LP'den daha yüksek lusiferaz ekspresyonu gösterdiğini düşündürmektedir. MetLuc mRNA'sını bozunmaya karşı korumak ve eksojen Metridia lusiferaz mRNA'nın transfeksiyon verimliliğini arttırmak için. Lütfen kapaksız Met-mRNA'nın sentetik yapısının başarıyla çıkarıldığından emin olun. Poloksamin nanopartiküllerini hazırlamak ve sıkıştırmak için Met-mRNA T704 ve peptid bileşiğini dikkatlice hesaplayın ve indirin.Peptit-poloksamin nanopartiküllerinin morfolojisini gözlemlemek için transmisyon elektron mikroskobu yapılabilir. Bu teknik, araştırmacıların mukozal mRNA aşıları geliştirmelerine ve ilgili her hücre için gen terapisi formülasyonlarının yüksek verimli bir şekilde taranmasını sağlamalarına yardımcı olur.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Efficient Transfection of In vitro Transcribed mRNA in Cultured Cells Using Peptide-Poloxamine Nanoparticles

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Fare T-hücrelerinin, T-hücre reseptörleri retroviral İletimi

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

HIV-1 tropizm genotipik Çıkarım kullanarak Nüfus tabanlı Sıralama V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Seven Steps to Stellate Cells

Hücreler stellat Yedi Adımda

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

Hücre olgunlaşması olmadan Dendritik Hücreler Verimli Transfeksiyon için optimize edilmiş Protokolü

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Nicel<em&gt; In vitro</emStatik Koşullarında Account İlköğretim İnsan mikrovasküler endotel hücreleri için Nötrofil yapışma Tedbir&gt; Testi

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Görselleştirme ve Miktarının Belirlenmesi için floresan proteinleri kullanarak<em&gt; Chlamydia</em&gt; Vakuol Büyüme Dinamikleri Yaşayan Hücrelerde

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Etkin Killer yapay antijen sunan hücreler (KaAPC)<em&gt; İn Vitro</em&gt; İnsan Antijen-spesifik T hücrelerinin tükenmesi

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Nucleofection İnsan THP-1 Makrofagların Yüksek Verimli Transfeksiyonu

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

T hücrelerinin türetilmesi<em&gt; İn Vitro</em&gt; Fare Embriyonik Kök Hücreleri

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...