Name: in vitro cellular activity evaluation of the nanoemulsion vaccine adjuvant ophiopogonin d
Uploaded: 2022-12-09T13:35:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Cellular Activity Evaluation of the Nanoemulsion Vaccine Adjuvant Ophiopogonin D at JoVE.com

تم دعم هذه الدراسة بالمنحة رقم 2021YFC2302603 من البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين ، والمنح رقم 31670938 ، و 32070924 ، و 82041045 ، و 32000651 من برنامج المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين ، والمنح رقم 2014jcyjA0107 ورقم 2019jcyjA-msxmx0159 من برنامج مشروع مؤسسة العلوم الطبيعية في تشونغتشينغ ، المنحة رقم. CYS21519 من مشروع أبحاث الدراسات العليا والابتكار في تشونغتشينغ ، المنحة رقم 2020XBK24 من المشاريع الخاصة بجامعة الجيش الطبية ، والمنحة رقم 202090031021 من البرنامج الوطني للابتكار وريادة الأعمال لطلاب الجامعات.

تم إجراء جميع تجارب الخلايا في مختبر هندسة الخلايا المجهز بغرف العمليات الأساسية والغرف العازلة وغرف الزراعة المعقمة وغرف تحديد الهوية والتحليل. كانت بيئة العمل وظروفه خالية من التلوث الميكروبي والعوامل الضارة الأخرى. أجريت التجارب على الحيوانات بناء على المبادئ التوجيهية لرعاية واستخ...

<ol>
	<li>Cao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+of+graphene+oxide+as+a+potential+vaccine+carrier+and+adjuvant.">Recent progress of graphene oxide as a potential vaccine carrier and adjuvant.</a> Acta Biomaterials. 112, 14-28 (2020).</li><li>Ko, E. J., Kang, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunology+and+efficacy+of+MF59-adjuvanted+vaccines.">Immunology and efficacy of MF59-adjuvanted vaccines.</a> Human Vaccines &amp; Immunotherapeutics. 14 (12), 3041-3045 (2018).</li><li>Shi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccine+adjuvants:+Understanding+the+structure+and+mechanism+of+adjuvanticity.">Vaccine adjuvants: Understanding the structure and mechanism of adjuvanticity.</a> Vaccine. 37 (24), 3167-3178 (2019).</li><li>Kuo, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+CpG-adjuvanted+stable+prefusion+SARS-CoV-2+spike+antigen+as+a+subunit+vaccine+against+COVID-19.">Development of CpG-adjuvanted stable prefusion SARS-CoV-2 spike antigen as a subunit vaccine against COVID-19.</a> Scientific Reports. 10, 20085 (2020).</li><li>Twentyman, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interim+recommendation+of+the+Advisory+Committee+on+Immunization+Practices+for+use+of+the+Novavax+COVID-19+vaccine+in+persons+aged+&gt;/=18+years+-+United+States,+July+2022.">Interim recommendation of the Advisory Committee on Immunization Practices for use of the Novavax COVID-19 vaccine in persons aged &gt;/=18 years - United States, July 2022.</a> MMWR Morbidity and Mortality Weekly Report. 71 (31), 988-992 (2022).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+aluminum+adjuvants+eliciting+stronger+immune+response+when+mixed+with+hepatitis+B+virus+surface+antigens.">Improved aluminum adjuvants eliciting stronger immune response when mixed with hepatitis B virus surface antigens.</a> ACS Omega. 7 (38), 34528-34537 (2022).</li><li>Wang, N., Chen, M., Wang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomes+used+as+a+vaccine+adjuvant-delivery+system:+From+basics+to+clinical+immunization.">Liposomes used as a vaccine adjuvant-delivery system: From basics to clinical immunization.</a> Journal of Controlled Release. 303, 130-150 (2019).</li><li>Akin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+safety+and+efficacy+of+Advax(TM)+as+an+adjuvant:+A+systematic+review+and+meta-analysis.">Evaluation of the safety and efficacy of Advax(TM) as an adjuvant: A systematic review and meta-analysis.</a> Advances in Medical Sciences. 67 (1), 10-17 (2022).</li><li>Lacaille-Dubois, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Updated+insights+into+the+mechanism+of+action+and+clinical+profile+of+the+immunoadjuvant+QS-21:+A+review.">Updated insights into the mechanism of action and clinical profile of the immunoadjuvant QS-21: A review.</a> Phytomedicine. 60, 152905 (2019).</li><li>Marty-Roix, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+QS-21+as+an+inflammasome-activating+molecular+component+of+saponin+adjuvants.">Identification of QS-21 as an inflammasome-activating molecular component of saponin adjuvants.</a> The Journal of Biological Chemistry. 291 (3), 1123-1136 (2016).</li><li>Zhang, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ophiopogonin+D+attenuates+doxorubicin-induced+autophagic+cell+death+by+relieving+mitochondrial+damage+in+vitro+and+in+vivo.">Ophiopogonin D attenuates doxorubicin-induced autophagic cell death by relieving mitochondrial damage in vitro and in vivo.</a> The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 352 (1), 166-174 (2015).</li><li>An, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ophiopogonin+D+ameliorates+DNCB-induced+atopic+dermatitis-like+lesions+in+BALB/c+mice+and+TNF-alpha-+inflamed+HaCaT+cell.">Ophiopogonin D ameliorates DNCB-induced atopic dermatitis-like lesions in BALB/c mice and TNF-alpha- inflamed HaCaT cell.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 522 (1), 40-46 (2020).</li><li>Song, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+polysaccharide+from+Ophiopogon+japonicus+on+immune+response+to+Newcastle+disease+vaccine+in+chicken.">Effects of polysaccharide from Ophiopogon japonicus on immune response to Newcastle disease vaccine in chicken.</a> Pesquisa Veterin&#225;ria Brasileira. 36 (12), 1155-1159 (2016).</li><li>Tong, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immunopotentiator,+ophiopogonin+D,+encapsulated+in+a+nanoemulsion+as+a+robust+adjuvant+to+improve+vaccine+efficacy.">An immunopotentiator, ophiopogonin D, encapsulated in a nanoemulsion as a robust adjuvant to improve vaccine efficacy.</a> Acta Biomaterialia. 77, 255-267 (2018).</li><li>Lin, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronic+acid-glycine-cholesterol+conjugate-based+nanoemulsion+as+a+potent+vaccine+adjuvant+for+T+cell-mediated+immunity.">Hyaluronic acid-glycine-cholesterol conjugate-based nanoemulsion as a potent vaccine adjuvant for T cell-mediated immunity.</a> Pharmaceutics. 13 (10), 1569 (2021).</li><li>Xu, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+metabolomic+and+lipidomic+analysis+reveals+the+potential+mechanisms+of+hemolysis+effect+of+ophiopogonin+D+and+ophiopogonin+D'+in+vivo.">Global metabolomic and lipidomic analysis reveals the potential mechanisms of hemolysis effect of ophiopogonin D and ophiopogonin D' in vivo.</a> Chinese Medicine. 16 (1), 3 (2021).</li><li>Drane, D., Gittleson, C., Boyle, J., Maraskovsky, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISCOMATRIX+adjuvant+for+prophylactic+and+therapeutic+vaccines.">ISCOMATRIX adjuvant for prophylactic and therapeutic vaccines.</a> Expert Review of Vaccines. 6 (5), 761-772 (2007).</li><li>Rudolf, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microstructure+characterisation+and+identification+of+the+mechanical+and+functional+properties+of+a+new+PMMA-ZnO+composite.">Microstructure characterisation and identification of the mechanical and functional properties of a new PMMA-ZnO composite.</a> Materials. 13 (12), 2717 (2020).</li><li>Cannella, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxicity+evaluation+of+endodontic+pins+on+L929+cell+line.">Cytotoxicity evaluation of endodontic pins on L929 cell line.</a> BioMed Research International. 2019, 3469525 (2019).</li><li>Jiao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+MTT+and+CCK-8+assay+for+evaluation+of+graphene+cytotoxicity.">Limitations of MTT and CCK-8 assay for evaluation of graphene cytotoxicity.</a> RSC Advances. 5 (66), 53240-53244 (2015).</li><li>Ghasemi, M., Turnbull, T., Sebastian, S., Kempson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MTT+assay:+Utility,+limitations,+pitfalls,+and+interpretation+in+bulk+and+single-cell+analysis.">The MTT assay: Utility, limitations, pitfalls, and interpretation in bulk and single-cell analysis.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 12827 (2021).</li><li>Li, W., Zhou, J., Xu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+the+in+vitro+cytotoxicity+testing+of+medical+devices.">Study of the in vitro cytotoxicity testing of medical devices.</a> Biomedical Reports. 3 (5), 617-620 (2015).</li><li>Wu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+elevated+inflammatory+cytokines+of+spleen+and+spleen+index+in+acute+spinal+cord+injury.">Correlation between elevated inflammatory cytokines of spleen and spleen index in acute spinal cord injury.</a> Journal of Neuroimmunology. 344, 577264 (2020).</li><li>Lewis, S. M., Williams, A., Eisenbarth, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+the+immune+system+in+the+spleen.">Structure and function of the immune system in the spleen.</a> Science Immunology. 4 (33), (2019).</li><li>Cox, J. H., Ferrari, G., Janetzki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+cytokine+release+at+the+single+cell+level+using+the+ELISPOT+assay.">Measurement of cytokine release at the single cell level using the ELISPOT assay.</a> Methods. 38 (4), 274-282 (2006).</li><li>Elliott, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+microscopy:+Principles+and+modern+practices.">Confocal microscopy: Principles and modern practices.</a> Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68 (2020).</li><li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4(+)+T+cell+activation+and+inflammation+in+NASH-related+fibrosis.">CD4(+) T cell activation and inflammation in NASH-related fibrosis.</a> Frontiers in Immunology. 13, 967410 (2022).</li><li>Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+activation+and+polarization.">Macrophage activation and polarization.</a> Frontiers in Bioscience. 13, 453-461 (2008).</li><li>Quesniaux, V., Erard, F., Ryffel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adjuvant+activity+on+murine+and+human+macrophages.">Adjuvant activity on murine and human macrophages.</a> Methods in Molecular Biology. 626, 117-130 (2010).</li></ol>

توفر لقاحات الوحدات الفرعية أمانا ممتازا ولكنها ضعيفة المناعة. تتمثل الاستراتيجية الرئيسية لتعزيز الاستمناع في الامتزاز المادي أو إقران المستضدات بالمواد المساعدة ودمجها في أنظمة توصيل الأدوية لتعزيز امتصاص وعرض المستضدات النامية. الصابونين النباتي الطبيعي مثل quillaia saponin ومشتقاته شديد...

اللقاحات وسيلة مهمة للوقاية من الأمراض المعدية وغير السارية وعلاجها. تعد الإضافة المناسبة للمواد المساعدة ووسائل التوصيل إلى تركيبات اللقاح مفيدة لتعزيز مناعة المستضدات وتوليد استجابات مناعية طويلة الأمد1. بالإضافة إلى الشب المساعد الكلاسيكي (ملح الألومنيوم) ، هناك ستة أنواع من المواد المساعدة للقاحات التي يتم تسويقها حاليا: MF59 2,3 و AS04 3 و AS03 3 و AS01 3 و CpG1018 4 و Matrix-M5. بشكل عام ، عندما يواجه جسم الإنسان هجوما فيروسيا ، فإن خطي الدفاع الأول والثاني (الجلد والغشاء المخاطي والبلاعم) يأخذان زمام المبادرة في إزالة الفيروس ، وأخيرا ، يتم تنشيط خط الدفاع الثالث ، الذي يشمل الأعضاء المناعية والخلايا المناعية. كانت أملاح الألومنيوم والألمنيوم أكثر المواد المساعدة استخداما على نطاق واسع للقاحات البشرية منذ أوائل 1920s ، مما أثار استجابة مناعية فطرية فعالة6. ومع ذلك ، فقد اقترح أن تنشيط الخلايا المقدمة للمستضد (APCs) بواسطة المواد المساعدة الكلاسيكية ، والتي تحفز الخلايا المناعية على توليد مجموعات محددة من السيتوكينات والكيموكينات ، هي الآلية التي تعمل بها المواد المساعدة وقد تكون أحد الأسباب التي تجعل المواد المساعدة تمارس تأثيرات عابرة فقط على استجابات مناعية محددة7. يعد وجود مواد مساعدة مرخصة محدودة للاستخدام البشري عاملا مقيدا لتطوير اللقاحات التي تثير استجابات مناعية فعالة8.
حاليا ، يظهر عدد متزايد من الدراسات المساعدة القدرة على إحداث استجابة مناعية خلوية قوية في الفئران. لقد ثبت أن QS-21 يحفز استجابة مناعية متوازنة T-helper 1 (Th1) و T-helper 2 (Th2) ، وينتج مستويات أعلى من عيار الأجسام المضادة ، ويطيل الحماية كمساعد ، لكن سميته القوية وخصائصه الانحلالية تحد من تطوره كمساعد سريري مستقل 9,10. OP-D (روسجوجينين-O-α-L-rhamnopyranosy1- (1→2)-β-D-xylopyranosyl-(1→3)-β-D-fucopyranoside) هو أحد الصابونين الستيرويدية المعزولة من جذر النبات الطبي الصيني Ophiopogon japonicas4. بالإضافة إلى ذلك ، فهو المكون الرئيسي النشط دوائيا (شين ماي سان) الموجود في Radix Ophiopogonis ومن المعروف أن له خصائص دوائية معينة11. علاوة على ذلك ، فهو عضو في عائلة Liliaceae ويستخدم على نطاق واسع لآثاره المثبطة والوقائية في التهاب الخلايا وإصابة عضلة القلب. على سبيل المثال ، يحسن OP-D الآفات الشبيهة بالتهاب الجلد التأتبي الناجم عن DNCB وعامل نخر الورم ألفا (TNF-α) خلايا HaCaT الالتهابية في الفئران BALB / c12. الأهم من ذلك ، يعزز OP-D الحماية المضادة للأكسدة لنظام القلب والأوعية الدموية ويحمي القلب من إصابة الالتهام الذاتي التي يسببها دوكسوروبيسين عن طريق تقليل كل من توليد أنواع الأكسجين التفاعلية وتعطيل تلف غشاء الميتوكوندريا. أظهرت التجارب أن تناول OP-D مع أحادي ديسموسيد يساعد على تعزيز صحة المناعة ، وزيادة عدد خلايا الدم البيضاء وتخليق الحمض النووي ، وجعل الأجسام المضادة تدوم لفترة أطول13. وقد وجد سابقا أن OP-D له تأثير مساعد14.
المستحلبات النانوية عبارة عن تركيبات نانوية من الزيت في الماء تتكون من مزيج من المواد الخافضة للتوتر السطحي والزيت والمواد الخافضة للتوتر السطحي والماء12,15. تسمح تصميمات اللقاحات النانوية هذه بتغليف المستضدات والمواد المساعدة معا لتعزيز التحفيز المناعي وحماية المستضدات وتعزيز نضوج الخلايا المتغصنة (DC)16. لتطوير هذه المواد المساعدة الجديدة التي تم الحصول عليها من الفحص ، من المهم إيجاد طرق مناسبة لتقييم قدرات الاستجابة الخلوية الخاصة بهم.
الغرض من هذا البروتوكول هو التقييم المنهجي لما إذا كانت المواد المساعدة يمكن أن تعزز البلعمة والتعبير عن الخلايا المناعية في زراعة الخلايا في المختبر وتوضيح الطرق التجريبية الرئيسية. تنقسم التجربة إلى أربعة أقسام فرعية: (1) يتم تحديد سمية OP-D و NOD لخلايا L929 بواسطة فحص مجموعة عد الخلايا -8 (CCK-8) ؛ (2) يتم الكشف عن مستويات السيتوكين في الغدد الصماء IFN-γ و IL-17A وأرقام الخلايا المقابلة في الفئران المحصنة عن طريق تحفيز الخلايا الطحالية ومقايسات ELISpot ؛ (3) لوحظت قدرة عرض المستضد ل DCs بعد التحفيز المساعد باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر ؛ و (4) تم الكشف عن الأنواع الثلاثة من السيتوكينات ، IL-1β و IL-6 و TNF-α ، في المواد الطافية التي تم الحصول عليها من الضامة البريتونية (PMs) في الفئران الطبيعية المستزرعة مع المواد المساعدة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA (1x)</td>
			<td>GIBCO, USA</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well filter plates</td>
			<td>Millipore. Billerica, MA</td>
			<td>CLS3922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlPO4</td>
			<td>General Chemical Company, USA</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated Cell Counter</td>
			<td>Countstar, China</td>
			<td>IC1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/c mice and C57BL/6 mice</td>
			<td>Beijing HFK Bioscience Co. Ltd</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>caprylic/capric triglyceride (GTCC)</td>
			<td>Beijing Fengli Pharmaceutical Co. Ltd., Beijing, China</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCK-8 kits</td>
			<td>Dojindo, Japan</td>
			<td>CK04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counting Plate</td>
			<td>Costar, Corning, USA</td>
			<td>CO010101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Sieve</td>
			<td>biosharp, China</td>
			<td>BS-70-CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810 R</td>
			<td>Eppendorf, Germany&#160;</td>
			<td>5811000398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM basic(1x) medium</td>
			<td>GIBCO, USA</td>
			<td>C11885500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSZ5000X Inverted Microscope</td>
			<td>Nikon,Japan</td>
			<td>DSZ5000X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EL-35 (Cremophor-35)</td>
			<td>Mumbai, India</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISpot classic</td>
			<td>AID, Germany</td>
			<td>ELR06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>GIBCO, USA</td>
			<td>10099141C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Full-function Microplate Reader</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>VL0000D2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>P42212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Granulocyte Macrophage Colony-Stimulating Factor</td>
			<td>GM-CSF, R&#38;D Systems, USA</td>
			<td>315-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>15630106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HF 90/240 Incubator</td>
			<td>Heal Force, Switzerland</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-4</td>
			<td>PeproTech, USA</td>
			<td>042149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L929 cell line</td>
			<td>FENGHUISHENGWU, China</td>
			<td>&#160;NCTC clone 929 (RRID:CVCL_0462)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Scanning Confocal Microscopy</td>
			<td>Zeiss, Germany</td>
			<td>LSM 980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MONTANE 85 PPI</td>
			<td>SEPPIC, France</td>
			<td>L12910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MONTANOX 80 PPI</td>
			<td>SEPPIC, France</td>
			<td>36372K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IFN-&#947; ELISA kit</td>
			<td>Dakewe, China</td>
			<td>1210002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IFN-&#947; precoated ELISPOT kit</td>
			<td>Dakewe, China</td>
			<td>DKW22-2000-096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-17A ELISA kit</td>
			<td>Dakewe, China</td>
			<td>1211702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-17A ELISpotPLUS Kit</td>
			<td>ebiosciences, USA</td>
			<td>3521-4HPW-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-1&#946; ELISA kit</td>
			<td>Dakewe, China</td>
			<td>1210122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-6 ELISA kit</td>
			<td>Dakewe, China</td>
			<td>1210602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse TNF-&#945; ELISA kit</td>
			<td>Dakewe, China</td>
			<td>1217202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids(100x)</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophiopogonin-D</td>
			<td>Chengdu Purui Technology Co. Ltd</td>
			<td>945619-74-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin</td>
			<td>Solarbio, China</td>
			<td>CA1620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>ZSGB-BIO, China</td>
			<td>ZLI-9062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td>Solarbio, China</td>
			<td>R1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium</td>
			<td>Hyclone (Life Technology), USA</td>
			<td>SH30809.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate(100 mM)</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Squalene</td>
			<td>Sigma, USA</td>
			<td>S3626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;- Mercaptoethanol</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro cellular activity evaluation of the nanoemulsion vaccine adjuvant ophiopogonin d

كمكون رئيسي للقاحات ، يمكن للمواد المساعدة أن تحفز أو تعزز بشكل مباشر الاستجابات المناعية القوية والواسعة الانتشار والفطرية والتكيفية المرتبطة بالمستضدات. تم العثور على Ophiopogonin D (OP-D) ، وهو مكون منقى مستخرج من نبات Ophiopogon japonicus ، ليكون مفيدا كمساعد للقاح. يمكن التغلب على مشاكل الذوبان المنخفض والسمية ل OP-D بشكل فعال باستخدام طريقة استحلاب منخفضة الطاقة لإعداد المستحلب النانوي ophiopogonin D (NOD). في هذه المقالة ، يتم فحص سلسلة من البروتوكولات في المختبر لتقييم النشاط الخلوي. تم تحديد التأثيرات السامة للخلايا ل L929 باستخدام مقايسة مجموعة عد الخلايا -8. بعد ذلك ، تم الكشف عن مستويات السيتوكين المفرزة وأرقام الخلايا المناعية المقابلة بعد تحفيز وثقافة الخلايا الطحالية من الفئران المحصنة بواسطة طرق ELISA و ELISpot. بالإضافة إلى ذلك ، تمت ملاحظة قدرة امتصاص المستضد في الخلايا المتغصنة المشتقة من نخاع العظم (BMDCs) ، والتي تم عزلها من الفئران C57BL / 6 ونضجت بعد الحضانة باستخدام GM-CSF بالإضافة إلى IL-4 ، بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر بالمسح بالليزر (CLSM). الأهم من ذلك ، تم تأكيد تنشيط البلاعم من خلال قياس مستويات السيتوكينات IL-1β و IL-6 وعامل نخر الورم ألفا (TNF-α) بواسطة مجموعات ELISA بعد استزراع البلاعم البريتونية (PMs) من الفئران الفارغة مع المساعد لمدة 24 ساعة. ومن المأمول أن يزود هذا البروتوكول الباحثين الآخرين بمناهج تجريبية مباشرة وفعالة لتقييم كفاءة الاستجابة الخلوية للمواد المساعدة الجديدة للقاحات.

تم الانتهاء من تقييم النشاط الخلوي للمواد المساعدة OP-D و NOD في المختبر وفقا للبروتوكول. الخلايا الليفية L929 هي نموذج فحص مفيد لاختبار السمية في المختبر ل NOD (الشكل 1). يمكن أن يساعد القياس الكمي لمستويات السيتوكين الالتهابية في الطحال الباحثين على فهم الاستجابة المن?...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Cellular Activity Evaluation of the Nanoemulsion Vaccine Adjuvant Ophiopogonin D at JoVE.com

In Vitro Cellular Activity Evaluation of the Nanoemulsion Vaccine Adjuvant Ophiopogonin D

يقدم البروتوكول طرقا مفصلة لتقييم ما إذا كان المستحلب النانوي ophiopogonin D المساعد يعزز الاستجابات المناعية الخلوية الفعالة.

في المختبر تقييم النشاط الخلوي لمساعد لقاح المستحلب النانوي Ophiopogonin D

As a principal ingredient of vaccines, adjuvants can directly induce or enhance the powerful, widespread, innate, and adaptive immune responses associated ...

يمكن أن يزود هذا البروتوكول الباحثين الآخرين بمناهج تجريبية مباشرة وفعالة وخطوات تفصيلية لتقييم كفاءة الاستجابة الخلوية لمواد اللقاح المساعدة الجديدة. لا يمكن أن يزود الباحثين فقط بطرق تقييم خلوية محددة للمواد المساعدة ، ولكن يمكنه أيضا تحطيم طرق الاستخراج مثل مرض BM. لا تظهر هذه البروتوكولات عدم وجود سمية وتوصيل خلوي عالي فحسب ، بل توفر أيضا إجراءات مفصلة لمجال التقييم المساعد.للبدء ، قم بتشغيل حمام مائي واضبط درجة الحرارة على 37 درجة مئوية. ثم بعد جمع أنبوب من خلايا L929 المجمدة من النيتروجين السائل ، قم بإذابة الثلج بسرعة في حمام مائي. بعد سحب الخلايا في أنبوب طرد مركزي معقم سعة 15 ملليلتر ، أضف ملليلتر من DMEM واخلطه جيدا.أجهزة الطرد المركزي العينات في 129 × ز لمدة خمس دقائق. وبعد التخلص من المادة الطافية ، أضف ملليلتر من DMEM لإعادة تعليق الخلايا. أجهزة الطرد المركزي العينات مرة أخرى.وبعد التخلص من المادة الطافية ، أضف ستة ملليلتر من وسيط DMEM الكامل للتعليق ، وانقله إلى دورق استزراع T25 سم مربع في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون للاستزراع لمدة 48 ساعة. في اليوم 24 بعد التحصين الأولي ، أخرج الفئران من غرفة الحيوانات ، وضعها في طبق زجاجي ونقع في 75٪ كحول لمدة خمس دقائق. ضع أنابيب الطرد المركزي على رف أنبوب الطرد المركزي ، وقم بترقيم أطباق بتري التي تستخدم لمرة واحدة ، وأضف خمسة ملليلتر من PBS إلى كل طبق بتري باستخدام ماصة سعة 10 ملليلتر.قم بعمل شق من ستة إلى ثمانية سنتيمترات باستخدام مقص في منتصف الجانب البطني الأيسر من الماوس. افتح الجلد المسيل للدموع لكشف جدار البطن وتحديد موقع الشريط الأحمر الطويل للطحال. بعد ذلك ، ارفع الصفاق على الجانب السفلي من الطحال بالملقط.اقطعه واقلبه لأعلى لكشف الطحال. رفع الطحال مع ملقط. افصل النسيج الضام أسفل الطحال بمقص العيون وقم بإزالة الطحال.ضع الطحال في طبق بتري يحتوي على خمسة ملليلتر من PBS وطاحونة مع غربال ومكبس حقنة. بعد الطحن ، انقل السائل إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 ملليلتر مع ماصة وفقا للترقيم. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للسائل عند 453 × جم لمدة خمس دقائق.وبعد التخلص من المادة الطافية، أضف ثلاثة ملليلتر من محلول تحلل خلايا الدم الحمراء إلى كل أنبوب. أعد تعليق الخلايا وتحلل في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. ثم أضف 10 إلى 12 ملليلتر من PBS إلى كل أنبوب.وبعد الخلط والطرد المركزي عند 453 × جم لمدة خمس دقائق ، تخلص من المادة الطافية وأضف 10 ملليلتر من PBS إلى كل أنبوب طرد مركزي وأعد تعليق الخلايا. خذ 20 ميكرولترا من كل عينة في بئر من لوحة عد الخلايا وسجل عدد الخلايا الحية باستخدام عداد الخلايا الآلي. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للعينات عند 453 × جم لمدة خمس دقائق.وبعد التخلص من المادة الطافية ، قم بتخفيفها إلى 2.5 × 10 إلى الخلايا السادسة لكل ملليلتر باستخدام وسيط RF10 وأضفها إلى صفيحة 96 بئرا بمعدل 100 ميكرولتر لكل بئر. قطع شق من ستة إلى ثمانية سنتيمترات أسفل بطن الفأر بالمقص وتثبيت طرفي الفتحة لفصلها في اتجاهات مختلفة وكشف أرجل الماوس. افصل عظم الفخذ عن جسم الفأر والساق عن المفصل.والحفاظ على العظام سليمة من كلا الطرفين. بعد ذلك ، قم بإزالة الأنسجة المتبقية والغضاريف من المفاصل المفصلية على طرفي عظم الفخذ بالمقص والملقط. نقع عظم الفخذ في 75 ٪ الكحول لمدة خمس دقائق ثم نقع في محلول PBS معقم لغسل الكحول السطحي.ثم قطع نهايات عظم الفخذ بالمقص وشطف نخاع العظم في طبق بتري معقم بمحلول PBS معقم ، يليه الطموح باستخدام حقنة ملليلتر. كرر الغسيل ثلاث إلى خمس مرات. بعد ذلك ، قم بالتصفية بواسطة غربال خلوي واجمع الخلايا المتغصنة المشتقة من نخاع العظم في أنبوب طرد مركزي سعة 15 ملليلتر.بعد الطرد المركزي للعينات عند 290 × جم لمدة خمس دقائق ، تخلص من المادة الطافية وأضف أربعة ملليلتر من محلول تحلل خلايا الدم الحمراء ، وأعد تعليقها وتحللها في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، أضف 10 ملليلتر من محلول PBS المعقم لتحييد المحللة ، وبعد الطرد المركزي عند 290 × جم لمدة خمس دقائق ، تخلص من المادة الطافية. أعد تعليق الخلايا في ملليلتر واحد من DMEM يحتوي على محلول 1٪ بنسلين-ستربتومايسين و 10٪ مصل بقري جنيني وعدده.ثم أضف عامل تحفيز مستعمرة البلاعم المحببة بالإضافة إلى إنترلوكين -4 إلى الوسط. اضبط تركيز الخلية على 5 × 10 إلى الخامس لكل ملليلتر وقم بتلقيح الخلايا على زلات الغطاء. بعد إضافة معلق الخلية إلى لوحة من ستة آبار بمعدل مليلتر لكل بئر ، ضع اللوحة في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 48 ساعة.قم بتغيير الوسيط تماما بعد يومين وقم بتغيير نصف الوسيط بعد أربعة أيام. اغمر الفئران في 75٪ كحول بعد القتل الرحيم وضعها في طبق بتري زجاجي بترتيب مرقم. مرر الفئران عبر نافذة النقل إلى غرفة العمليات المعقمة وضعها على طاولة العمليات لمدة خمس دقائق.باستخدام المحقنة ، نضح 10 ملليلتر من المياه المالحة. قم بإمالة الفئران لأسفل عند حوالي 45 درجة وحقنها في منتصف تجويف البطن. ارسم حوالي خمسة ملليلتر من معلق الخلية في أنبوب طرد مركزي سعة 15 ملليلتر لكل 10 ملليلتر وكرر الحقن ثلاث مرات.الطرد المركزي تعليق الخلية في 129 × ز لمدة خمس دقائق للحصول على الضامة الأولية البريتوني الفأر. الخلايا الليفية L929 هي نموذج فحص مفيد لاختبار السمية في المختبر ل NOD. يمكن أن يساعد القياس الكمي لمستويات السيتوكين الالتهابية في الطحال الباحثين على فهم الاستجابة المناعية بشكل أفضل.تعد مراقبة الخلايا الليمفاوية التائية السامة ذات البقعة المناعية المرتبطة بالإنزيم هي المعيار الذهبي لتقييم مناعة الخلايا التائية الخاصة بالمستضد في التجارب السريرية ولفحص اللقاحات المرشحة. يمكن أن تؤدي زيادة امتصاص الخلايا المتغصنة لمولد الضد إلى تعزيز الاستجابات المناعية التكيفية. تلعب البلاعم دورا مهما في تقديم مولدات الضد إلى الخلايا التائية ، بالإضافة إلى حث الخلايا الأخرى التي تقدم مولد الضد على التعبير عن جزيئات التحفيز المشترك ، وبالتالي بدء الاستجابات المناعية التكيفية.عزل الخلايا تحت نسبة الدواء إلى عمل الخلية له أهمية قصوى.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vitro Cellular Activity Evaluation of the Nanoemulsion Vaccine Adjuvant Ophiopogonin D

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

عزل الخلايا الليمفاوية T الإنسان والثقافة والتحليل للهجرة في المختبر</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

نوع التحاليل الكمية للجميع الأنفلونزا من Hemagglutinins الفيروسية وNeuraminidases باستخدام الاجسام المضادة العالمي في فتحة بسيطة فحوصات لطخة

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

جيل من الفيروسة الرملية المؤتلف استحداث اللقاحات وافقت عليها الهيئة في خلايا فيرو

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

مجموع استخراج بروتين و 2-D طرق جل الكهربائي ل<em&gt; بيركولديريا</em&gt; الأنواع

The investigation of  the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to  understanding the pathogenic mechanisms of diseases ...

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

تقييد أنزيم الاستنساخ القائم على أسلوب لتقييم<em&gt; في المختبر</em&gt; القدرة تكرار HIV-1 النوع الفرعي C-الكمامة MJ4 همي الفيروسات

The protective effect of many HLA class I alleles on HIV-1 pathogenesis and disease progression is, in part, attributed to their ability to target ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

في تحليل المختبر من الاستجابة المناعية الخلوية بوساطة Myd88 لفيروس غرب النيل المسخ سلالة العدوى

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

تقييم استجابات المضيف الممرض ونجاعة اللقاح في الفئران

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

في اختبار فيترو ELISA لتقييم قوة لقاح داء الكلب

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...

Intranasal Immunization and Milk Collection in Studies of Maternal Immunization in New Zealand White Rabbits (Oryctolagus cuniculus)

Intranasal Immunization and Milk Collection in Studies of Maternal Immunization in New Zealand White Rabbits Oryctolagus cuniculus

التحصين داخل النعوس وجمع الحليب في دراسات تحصين الأمهات في نيوزيلندا الأرانب البيضاء (Oryctolagus cuniculus)

Due to similarities in placentation and antibody transfer with humans, rabbits are an excellent model of maternal immunization. Additional advantages of ...