Name: in vitro cellular activity evaluation of the nanoemulsion vaccine adjuvant ophiopogonin d
Uploaded: 2022-12-09T13:35:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Cellular Activity Evaluation of the Nanoemulsion Vaccine Adjuvant Ophiopogonin D at JoVE.com

מחקר זה נתמך על ידי מענק מס '2021YFC2302603 של תוכנית המחקר והפיתוח הלאומית של סין, מענקים מס '31670938, 32070924, 82041045 ו- 32000651 של תוכנית הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין, מענקים מס ' 2014jcyjA0107 ומס ' 2019jcyjA-msxmx0159 של תוכנית פרויקט הקרן למדעי הטבע של צ'ונגצ'ינג, מענק מס 'CYS21519 של פרויקט המחקר והחדשנות לתואר שני של צ'ונגצ'ינג, מענק מס '2020XBK24 של פרויקטים מיוחדים של האוניברסיטה הרפואית הצבאית, ומענק מס '202090031021 של התוכנית הלאומית לחדשנות ויזמות לסטודנטים במכללה.

כל הניסויים בתאים בוצעו במעבדה להנדסת תאים המצוידת בחדרי ניתוח בסיסיים, חדרי חיץ, חדרי תרבית סטרילית וחדרי זיהוי וניתוח. סביבת העבודה והתנאים היו נקיים מזיהום מיקרוביאלי וגורמים מזיקים אחרים. הניסויים בבעלי חיים נערכו על בסיס ההנחיות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה ואושרו על ידי ועדת הרווחה ו?...

<ol>
	<li>Cao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+of+graphene+oxide+as+a+potential+vaccine+carrier+and+adjuvant.">Recent progress of graphene oxide as a potential vaccine carrier and adjuvant.</a> Acta Biomaterials. 112, 14-28 (2020).</li><li>Ko, E. J., Kang, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunology+and+efficacy+of+MF59-adjuvanted+vaccines.">Immunology and efficacy of MF59-adjuvanted vaccines.</a> Human Vaccines &amp; Immunotherapeutics. 14 (12), 3041-3045 (2018).</li><li>Shi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccine+adjuvants:+Understanding+the+structure+and+mechanism+of+adjuvanticity.">Vaccine adjuvants: Understanding the structure and mechanism of adjuvanticity.</a> Vaccine. 37 (24), 3167-3178 (2019).</li><li>Kuo, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+CpG-adjuvanted+stable+prefusion+SARS-CoV-2+spike+antigen+as+a+subunit+vaccine+against+COVID-19.">Development of CpG-adjuvanted stable prefusion SARS-CoV-2 spike antigen as a subunit vaccine against COVID-19.</a> Scientific Reports. 10, 20085 (2020).</li><li>Twentyman, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interim+recommendation+of+the+Advisory+Committee+on+Immunization+Practices+for+use+of+the+Novavax+COVID-19+vaccine+in+persons+aged+&gt;/=18+years+-+United+States,+July+2022.">Interim recommendation of the Advisory Committee on Immunization Practices for use of the Novavax COVID-19 vaccine in persons aged &gt;/=18 years - United States, July 2022.</a> MMWR Morbidity and Mortality Weekly Report. 71 (31), 988-992 (2022).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+aluminum+adjuvants+eliciting+stronger+immune+response+when+mixed+with+hepatitis+B+virus+surface+antigens.">Improved aluminum adjuvants eliciting stronger immune response when mixed with hepatitis B virus surface antigens.</a> ACS Omega. 7 (38), 34528-34537 (2022).</li><li>Wang, N., Chen, M., Wang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomes+used+as+a+vaccine+adjuvant-delivery+system:+From+basics+to+clinical+immunization.">Liposomes used as a vaccine adjuvant-delivery system: From basics to clinical immunization.</a> Journal of Controlled Release. 303, 130-150 (2019).</li><li>Akin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+safety+and+efficacy+of+Advax(TM)+as+an+adjuvant:+A+systematic+review+and+meta-analysis.">Evaluation of the safety and efficacy of Advax(TM) as an adjuvant: A systematic review and meta-analysis.</a> Advances in Medical Sciences. 67 (1), 10-17 (2022).</li><li>Lacaille-Dubois, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Updated+insights+into+the+mechanism+of+action+and+clinical+profile+of+the+immunoadjuvant+QS-21:+A+review.">Updated insights into the mechanism of action and clinical profile of the immunoadjuvant QS-21: A review.</a> Phytomedicine. 60, 152905 (2019).</li><li>Marty-Roix, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+QS-21+as+an+inflammasome-activating+molecular+component+of+saponin+adjuvants.">Identification of QS-21 as an inflammasome-activating molecular component of saponin adjuvants.</a> The Journal of Biological Chemistry. 291 (3), 1123-1136 (2016).</li><li>Zhang, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ophiopogonin+D+attenuates+doxorubicin-induced+autophagic+cell+death+by+relieving+mitochondrial+damage+in+vitro+and+in+vivo.">Ophiopogonin D attenuates doxorubicin-induced autophagic cell death by relieving mitochondrial damage in vitro and in vivo.</a> The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 352 (1), 166-174 (2015).</li><li>An, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ophiopogonin+D+ameliorates+DNCB-induced+atopic+dermatitis-like+lesions+in+BALB/c+mice+and+TNF-alpha-+inflamed+HaCaT+cell.">Ophiopogonin D ameliorates DNCB-induced atopic dermatitis-like lesions in BALB/c mice and TNF-alpha- inflamed HaCaT cell.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 522 (1), 40-46 (2020).</li><li>Song, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+polysaccharide+from+Ophiopogon+japonicus+on+immune+response+to+Newcastle+disease+vaccine+in+chicken.">Effects of polysaccharide from Ophiopogon japonicus on immune response to Newcastle disease vaccine in chicken.</a> Pesquisa Veterin&#225;ria Brasileira. 36 (12), 1155-1159 (2016).</li><li>Tong, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immunopotentiator,+ophiopogonin+D,+encapsulated+in+a+nanoemulsion+as+a+robust+adjuvant+to+improve+vaccine+efficacy.">An immunopotentiator, ophiopogonin D, encapsulated in a nanoemulsion as a robust adjuvant to improve vaccine efficacy.</a> Acta Biomaterialia. 77, 255-267 (2018).</li><li>Lin, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronic+acid-glycine-cholesterol+conjugate-based+nanoemulsion+as+a+potent+vaccine+adjuvant+for+T+cell-mediated+immunity.">Hyaluronic acid-glycine-cholesterol conjugate-based nanoemulsion as a potent vaccine adjuvant for T cell-mediated immunity.</a> Pharmaceutics. 13 (10), 1569 (2021).</li><li>Xu, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+metabolomic+and+lipidomic+analysis+reveals+the+potential+mechanisms+of+hemolysis+effect+of+ophiopogonin+D+and+ophiopogonin+D'+in+vivo.">Global metabolomic and lipidomic analysis reveals the potential mechanisms of hemolysis effect of ophiopogonin D and ophiopogonin D' in vivo.</a> Chinese Medicine. 16 (1), 3 (2021).</li><li>Drane, D., Gittleson, C., Boyle, J., Maraskovsky, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISCOMATRIX+adjuvant+for+prophylactic+and+therapeutic+vaccines.">ISCOMATRIX adjuvant for prophylactic and therapeutic vaccines.</a> Expert Review of Vaccines. 6 (5), 761-772 (2007).</li><li>Rudolf, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microstructure+characterisation+and+identification+of+the+mechanical+and+functional+properties+of+a+new+PMMA-ZnO+composite.">Microstructure characterisation and identification of the mechanical and functional properties of a new PMMA-ZnO composite.</a> Materials. 13 (12), 2717 (2020).</li><li>Cannella, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxicity+evaluation+of+endodontic+pins+on+L929+cell+line.">Cytotoxicity evaluation of endodontic pins on L929 cell line.</a> BioMed Research International. 2019, 3469525 (2019).</li><li>Jiao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+MTT+and+CCK-8+assay+for+evaluation+of+graphene+cytotoxicity.">Limitations of MTT and CCK-8 assay for evaluation of graphene cytotoxicity.</a> RSC Advances. 5 (66), 53240-53244 (2015).</li><li>Ghasemi, M., Turnbull, T., Sebastian, S., Kempson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MTT+assay:+Utility,+limitations,+pitfalls,+and+interpretation+in+bulk+and+single-cell+analysis.">The MTT assay: Utility, limitations, pitfalls, and interpretation in bulk and single-cell analysis.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 12827 (2021).</li><li>Li, W., Zhou, J., Xu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+the+in+vitro+cytotoxicity+testing+of+medical+devices.">Study of the in vitro cytotoxicity testing of medical devices.</a> Biomedical Reports. 3 (5), 617-620 (2015).</li><li>Wu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+elevated+inflammatory+cytokines+of+spleen+and+spleen+index+in+acute+spinal+cord+injury.">Correlation between elevated inflammatory cytokines of spleen and spleen index in acute spinal cord injury.</a> Journal of Neuroimmunology. 344, 577264 (2020).</li><li>Lewis, S. M., Williams, A., Eisenbarth, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+the+immune+system+in+the+spleen.">Structure and function of the immune system in the spleen.</a> Science Immunology. 4 (33), (2019).</li><li>Cox, J. H., Ferrari, G., Janetzki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+cytokine+release+at+the+single+cell+level+using+the+ELISPOT+assay.">Measurement of cytokine release at the single cell level using the ELISPOT assay.</a> Methods. 38 (4), 274-282 (2006).</li><li>Elliott, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+microscopy:+Principles+and+modern+practices.">Confocal microscopy: Principles and modern practices.</a> Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68 (2020).</li><li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4(+)+T+cell+activation+and+inflammation+in+NASH-related+fibrosis.">CD4(+) T cell activation and inflammation in NASH-related fibrosis.</a> Frontiers in Immunology. 13, 967410 (2022).</li><li>Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+activation+and+polarization.">Macrophage activation and polarization.</a> Frontiers in Bioscience. 13, 453-461 (2008).</li><li>Quesniaux, V., Erard, F., Ryffel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adjuvant+activity+on+murine+and+human+macrophages.">Adjuvant activity on murine and human macrophages.</a> Methods in Molecular Biology. 626, 117-130 (2010).</li></ol>

חיסונים תת-יחידות מספקים בטיחות מצוינת אך אימונוגניות ירודה. האסטרטגיה העיקרית לשיפור האימונוגניות היא לספוח פיזית או להצמיד אנטיגנים עם אדג'ובנטים ולשלב אותם במערכות אספקת התרופות כדי לקדם את הקליטה וההצגה על ידי DCs. ספונינים צמחיים טבעיים כגון quillaia saponin ונגזרותיו הם רעילים מאוד ואינם מ...

חיסונים הם אמצעי חשוב למניעה וטיפול במחלות זיהומיות ולא קומוניקטיביות. התוספת המתאימה של אדג'ובנטים וכלי משלוח לפורמולציות חיסונים מועילה להגברת האימונוגניות של אנטיגנים וליצירת תגובות חיסוניות ארוכות טווח1. בנוסף לאלום האדג'ובנטי הקלאסי (מלח אלומיניום), ישנם שישה סוגים של אדג'ובנטים לחיסונים המשווקים כיום: MF592,3, AS04 3, AS03 3, AS01 3, CpG10184 ומטריצה-M5. בדרך כלל, כאשר גוף האדם נתקל בהתקפה ויראלית, קווי ההגנה הראשון והשני (עור, רירית ומקרופאגים) לוקחים את ההובלה בניקוי הנגיף, ולבסוף, קו ההגנה השלישי, הכולל את איברי החיסון ותאי החיסון, מופעל. מלחי אלומיניום ואלומיניום הם האדג'ובנטים הנפוצים ביותר לחיסונים אנושיים מאז תחילת שנות ה-20 של המאה ה-20, מה שמעורר תגובה חיסונית מולדת יעילה6. עם זאת, הוצע כי הפעלת תאים המציגים אנטיגן (APCs) על ידי אדג'ובנטים קלאסיים, אשר מגרה את תאי החיסון ליצור קבוצות ספציפיות של ציטוקינים וכמוקינים, היא המנגנון שבאמצעותו אדג'ובנטים פועלים ועשויה להיות אחת הסיבות לכך שאדג'ובנטים מפעילים רק השפעות חולפות על תגובות חיסוניות ספציפיות7. נוכחותם של אדג'ובנטים מורשים מוגבלים לשימוש אנושי היא גורם מגביל לפיתוח חיסונים המעוררים תגובות חיסוניות יעילות8.
כיום, מספר גדל והולך של מחקרים אדג'ובנטיים מדגימים את היכולת לגרום לתגובה חיסונית תאית חזקה בעכברים. הוכח כי QS-21 משרה תגובה חיסונית מאוזנת של T-helper 1 (Th1) ו-T-helper 2 (Th2), מייצר רמות גבוהות יותר של טיטרים של נוגדנים ומאריך את ההגנה כאדג'ובנט, אך רעילותו החזקה ותכונותיו ההמוליטיות מגבילות את התפתחותו כאדג'ובנט קליניעצמאי 9,10. OP-D (רוסקוגנין-O-α-L-ראמנופירנוזיל1-(1→2)-β-D-קסילופירנוזיל-(1→3)-β-D-fucopyranoside) הוא אחד הספונינים הסטרואידים שבודדו משורש צמח המרפא הסיני Ophiopogon japonicas4. בנוסף, זהו המרכיב הפרמקולוגי הפעיל העיקרי (שן מאי סאן) שנמצא ברדיקס אופיופוגוניס וידוע כבעל תכונות פרמקולוגיות מסוימות11. יתר על כן, הוא חבר במשפחת Liliaceae והוא נמצא בשימוש נרחב עבור ההשפעות המעכבות והמגינות שלו בדלקת תאית ופגיעה בשריר הלב. לדוגמה, OP-D משמיד נגעים דמויי אטופיק דרמטיטיס המושרים על-ידי DNCB ותאי HaCaT דלקתיים של גורם נמק הגידול אלפא (TNF-α) בעכברי BALB/c12. חשוב לציין כי OP-D מקדם את ההגנה נוגדת החמצון של מערכת הלב וכלי הדם ומגן על הלב מפני פגיעה אוטופגית הנגרמת על ידי דוקסורוביצין על ידי הפחתת ייצור מיני חמצן תגובתי ושיבוש הנזק לממברנה המיטוכונדריאלית. ניסויים הראו כי נטילת OP-D עם מונו-דסמוזיד עוזרת לשפר את בריאות מערכת החיסון, להגביר את ספירת תאי הדם הלבנים ואת סינתזת הדנ"א, ולגרום לנוגדנים להחזיק מעמד זמן רב יותר13. בעבר נמצא כי OP-D יש אפקט אדג'ובנטי14.
ננו-מולקולות הן ננו-מולקולות שמן במים המורכבות משילוב של חומרים פעילי שטח, נפט, חומרים פעילי שטח ומים12,15. עיצובים אלה של ננו-חיסונים מאפשרים לעטוף אנטיגנים ואדג'ובנטים יחד כדי להגביר את הגירוי החיסוני, להגן על האנטיגנים ולקדם התבגרות של תאים דנדריטיים (DC)16. לצורך פיתוח של אדג'ובנטים חדשניים אלה המתקבלים מהקרנה, חשוב למצוא שיטות מתאימות להערכת יכולות התגובה התאית שלהם.
מטרת פרוטוקול זה היא להעריך באופן שיטתי אם אדג'ובנטים יכולים לשפר את הפאגוציטוזה ואת הביטוי של תאי מערכת החיסון בתרבית תאים במבחנה ולפרט על שיטות הניסוי העיקריות. הניסוי מחולק לארבעה סעיפי משנה: (1) הרעילות של OP-D ו-NOD לתאי L929 נקבעת על ידי בדיקת ערכת ספירת התאים 8 (CCK-8); (2) רמות הציטוקינים של IFN-γ ו-IL-17A האנדוקריניים ומספרי התאים המתאימים בעכברים מחוסנים מזוהים על ידי גירוי ספלנוציטים ומבחני ELISpot; (3) יכולת הצגת האנטיגן של DCs לאחר גירוי אדג'ובנטי נצפית באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית; ו-(4) מזוהים שלושת סוגי הציטוקינים, IL-1β, IL-6 ו-TNF-α, בסופרנטנטים המתקבלים ממקרופאגים של הצפק (PMs) בעכברים רגילים שעברו התרבות יחד עם אדג'ובנטים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA (1x)</td>
			<td>GIBCO, USA</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well filter plates</td>
			<td>Millipore. Billerica, MA</td>
			<td>CLS3922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlPO4</td>
			<td>General Chemical Company, USA</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated Cell Counter</td>
			<td>Countstar, China</td>
			<td>IC1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/c mice and C57BL/6 mice</td>
			<td>Beijing HFK Bioscience Co. Ltd</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>caprylic/capric triglyceride (GTCC)</td>
			<td>Beijing Fengli Pharmaceutical Co. Ltd., Beijing, China</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCK-8 kits</td>
			<td>Dojindo, Japan</td>
			<td>CK04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counting Plate</td>
			<td>Costar, Corning, USA</td>
			<td>CO010101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Sieve</td>
			<td>biosharp, China</td>
			<td>BS-70-CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810 R</td>
			<td>Eppendorf, Germany&#160;</td>
			<td>5811000398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM basic(1x) medium</td>
			<td>GIBCO, USA</td>
			<td>C11885500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSZ5000X Inverted Microscope</td>
			<td>Nikon,Japan</td>
			<td>DSZ5000X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EL-35 (Cremophor-35)</td>
			<td>Mumbai, India</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISpot classic</td>
			<td>AID, Germany</td>
			<td>ELR06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>GIBCO, USA</td>
			<td>10099141C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Full-function Microplate Reader</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>VL0000D2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>P42212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Granulocyte Macrophage Colony-Stimulating Factor</td>
			<td>GM-CSF, R&#38;D Systems, USA</td>
			<td>315-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>15630106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HF 90/240 Incubator</td>
			<td>Heal Force, Switzerland</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-4</td>
			<td>PeproTech, USA</td>
			<td>042149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L929 cell line</td>
			<td>FENGHUISHENGWU, China</td>
			<td>&#160;NCTC clone 929 (RRID:CVCL_0462)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Scanning Confocal Microscopy</td>
			<td>Zeiss, Germany</td>
			<td>LSM 980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MONTANE 85 PPI</td>
			<td>SEPPIC, France</td>
			<td>L12910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MONTANOX 80 PPI</td>
			<td>SEPPIC, France</td>
			<td>36372K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IFN-&#947; ELISA kit</td>
			<td>Dakewe, China</td>
			<td>1210002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IFN-&#947; precoated ELISPOT kit</td>
			<td>Dakewe, China</td>
			<td>DKW22-2000-096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-17A ELISA kit</td>
			<td>Dakewe, China</td>
			<td>1211702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-17A ELISpotPLUS Kit</td>
			<td>ebiosciences, USA</td>
			<td>3521-4HPW-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-1&#946; ELISA kit</td>
			<td>Dakewe, China</td>
			<td>1210122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-6 ELISA kit</td>
			<td>Dakewe, China</td>
			<td>1210602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse TNF-&#945; ELISA kit</td>
			<td>Dakewe, China</td>
			<td>1217202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids(100x)</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophiopogonin-D</td>
			<td>Chengdu Purui Technology Co. Ltd</td>
			<td>945619-74-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin</td>
			<td>Solarbio, China</td>
			<td>CA1620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>ZSGB-BIO, China</td>
			<td>ZLI-9062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td>Solarbio, China</td>
			<td>R1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium</td>
			<td>Hyclone (Life Technology), USA</td>
			<td>SH30809.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate(100 mM)</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Squalene</td>
			<td>Sigma, USA</td>
			<td>S3626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;- Mercaptoethanol</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro cellular activity evaluation of the nanoemulsion vaccine adjuvant ophiopogonin d

כמרכיב עיקרי בחיסונים, אדג'ובנטים יכולים לגרום או לשפר באופן ישיר את התגובות החיסוניות החזקות, הנפוצות, המולדות והנרכשות הקשורות לאנטיגנים. Epiopogonin D (OP-D), רכיב מטוהר המופק מהצמח Ophiopogon japonicus, נמצא שימושי כאדג'ובנט לחיסון. ניתן להתגבר ביעילות על הבעיות של המסיסות והרעילות הנמוכה של OP-D על ידי שימוש בשיטת תחליב באנרגיה נמוכה להכנת ננו-אמולסיה אופיופוגונין D (NOD). במאמר זה נבחנת סדרה של פרוטוקולים חוץ-גופיים להערכת פעילות תאית. ההשפעות הציטוטוקסיות של L929 נקבעו באמצעות בדיקת ערכת ספירת תאים-8. לאחר מכן, רמות הציטוקינים המופרשים ומספר תאי החיסון המתאימים לאחר הגירוי והתרבית של ספלנוציטים מעכברים מחוסנים זוהו בשיטות ELISA ו-ELISpot. בנוסף, יכולת ספיגת האנטיגן בתאים דנדריטיים שמקורם במח עצם (BMDCs), שבודדו מעכברי C57BL/6 והבשילו לאחר הדגירה עם GM-CSF בתוספת IL-4, נצפתה על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית של סריקת לייזר (CLSM). חשוב לציין שהפעלת המקרופאגים אושרה על ידי מדידת הרמות של ציטוקינים מסוג IL-1β, IL-6 וגורם נמק הגידול אלפא (TNF-α) על ידי ערכות ELISA לאחר שקוקולט מקרופאגים פריטוניאליים (PMs) מעכברים ריקים עם האדג'ובנט במשך 24 שעות. התקווה היא שפרוטוקול זה יספק לחוקרים אחרים גישות ניסוייות ישירות ויעילות להערכת יעילות התגובה התאית של אדג'ובנטים חדשניים לחיסונים.

הערכת הפעילות התאית של האדג'ובנטים OP-D ו-NOD הושלמה במבחנה על פי הפרוטוקול. פיברובלסטים L929 הם מודל סינון שימושי לבדיקת רעילות במבחנה של NOD (איור 1). כימות רמות הציטוקינים הדלקתיים בטחול יכול לעזור לחוקרים להבין טוב יותר את התגובה החיסונית (איור 2). ניטו...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Cellular Activity Evaluation of the Nanoemulsion Vaccine Adjuvant Ophiopogonin D at JoVE.com

In Vitro Cellular Activity Evaluation of the Nanoemulsion Vaccine Adjuvant Ophiopogonin D

הפרוטוקול מציג שיטות מפורטות להערכה אם ננו-אמולסיה אופיופוגונין D אדג'ובנט מקדם תגובות חיסוניות תאיות יעילות.

במבחנה הערכת פעילות תאית של חיסון ננו-אמולסיה אדג'ובנט אופיופוגונין D

As a principal ingredient of vaccines, adjuvants can directly induce or enhance the powerful, widespread, innate, and adaptive immune responses associated ...

פרוטוקול זה יכול לספק לחוקרים אחרים גישות ניסוייות ישירות ויעילות ואת הצעדים המפורטים להערכת יעילות התגובה התאית של אדג'ובנטים חדשניים לחיסונים. הוא אינו יכול רק לספק לחוקרים שיטות ספציפיות להערכה תאית עבור אדג'ובנטים, אלא יכול גם לפרק שיטות מיצוי כגון מחלת BM. פרוטוקולים אלה לא רק שאינם מדגימים רעילות ואספקה תאית גבוהה, אלא גם מספקים נהלים מפורטים לתחום ההערכה האדג'ובנטית.כדי להתחיל, הפעל את אמבט המים והתאם את הטמפרטורה ל -37 מעלות צלזיוס. ואז לאחר איסוף צינור של תאי L929 קפואים מחנקן נוזלי, להפשיר במהירות באמבט המים. לאחר שהכניסו את התאים לצינור צנטריפוגה סטרילי של 15 מיליליטר, הוסיפו שני מיליליטר DMEM וערבבו היטב.צנטריפוגה את הדגימות ב 129 x גרם במשך חמש דקות. ולאחר השלכת supernatant, להוסיף שני מיליליטר של DMEM כדי להשעות את התאים. צנטריפוגה את הדגימות שוב.ולאחר השלכת הסופרנטנט, הוסיפו שישה מיליליטרים של DMEM מדיום שלם לחידוש מחדש, והעבירו לבקבוקון תרבית בריבוע T25 סנטימטר בחממה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני לתרבית למשך 48 שעות. ביום ה-24 לאחר החיסון הראשוני, מוציאים את העכברים מחדר החיות, מניחים אותם בכלי זכוכית ומשרים ב-75% אלכוהול למשך חמש דקות. הניחו את צינורות הצנטריפוגה על מתלה צינורות צנטריפוגה, ספרו את צלחות הפטרי החד פעמיות, והוסיפו חמישה מיליליטר של PBS לכל צלחת פטרי עם פיפטה של 10 מיליליטר.בצע חתך של שישה עד שמונה סנטימטרים עם מספריים באמצע הצד הגחוני השמאלי של העכבר. יש לקרוע את העור כדי לחשוף את דופן הבטן ולאתר את הרצועה האדומה הארוכה של הטחול. לאחר מכן, להרים את הצפק בצד התחתון של הטחול עם מלקחיים.חותכים אותו פתוח והופכים אותו כלפי מעלה כדי לחשוף את הטחול. מרימים את הטחול עם מלקחיים. להפריד את רקמת החיבור מתחת לטחול עם מספריים עיניים ולהסיר את הטחול.מניחים את הטחול בצלחת פטרי המכילה חמישה מיליליטר של PBS וטחנה עם מסננת ובוכנה מזרק. לאחר שחיקה, להעביר את הנוזל לתוך צינור צנטריפוגה 15 מיליליטר עם פיפטה בהתאם למספור. לאחר מכן, צנטריפוגה את הנוזל ב 453 x גרם במשך חמש דקות.ולאחר השלכת supernatant, להוסיף שלושה מיליליטר של תזה תאי דם אדומים חיץ לכל צינור. יש להשעות את התאים ולהניח אותם בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. לאחר מכן להוסיף 10 עד 12 מיליליטר של PBS לכל צינור.ולאחר ערבוב צנטריפוגה ב 453 x גרם במשך חמש דקות, להשליך את supernatant ולהוסיף 10 מיליליטר של PBS לכל צינור צנטריפוגה להשעות את התאים. קח 20 מיקרוליטרים של כל דגימה בבאר של צלחת ספירת התאים ותעד את מספר התאים החיים באמצעות מונה תאים אוטומטי. לאחר מכן, צנטריפוגה את הדגימות ב 453 x גרם במשך חמש דקות.ולאחר השלכת הסופרנטנט, יש לדלל ל-2.5 על 10 לתאים השישיים למיליליטר עם מדיום RF10 ולהוסיף לצלחת של 96 באר ב-100 מיקרוליטר לבאר. חותכים חתך של שישה עד שמונה סנטימטרים מתחת לבטן העכבר במספריים ומהדקים את שני קצוות הפתח כדי להפריד אותו לכיוונים שונים ולחשוף את רגלי העכבר. הפרד את עצם הירך של העכבר מגוף העכבר ואת השוקה מהמפרק.ולשמור על העצמות שלמות בשני הקצוות. לאחר מכן, להסיר את הרקמה שיורית וסחוס מן המפרקים המפרקים בשני הקצוות של עצם הירך עם מספריים ומלקחיים. השרו את עצם הירך ב-75% אלכוהול למשך חמש דקות ולאחר מכן השרו בתמיסת PBS סטרילית כדי לשטוף את האלכוהול שעל פני השטח.ואז לחתוך את הקצוות של עצם הירך עם מספריים ולשטוף את מוח העצם בצלחת פטרי סטרילית עם תמיסת PBS סטרילית, ואחריו שאיפה עם מזרק מיליליטר אחד. חזרו על הכביסה שלוש עד חמש פעמים. לאחר מכן, סננו על ידי מסננת תאים ואספו את התאים הדנדריטיים שמקורם במח העצם לתוך צינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר.לאחר צנטריפוגה של הדגימות ב 290 x g במשך חמש דקות, להשליך את supernatant ולהוסיף ארבעה מיליליטר של חיץ תזה תאי דם אדומים, ressuse ו lyse בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. לאחר מכן, להוסיף 10 מיליליטר של תמיסת PBS סטרילית כדי לנטרל את ליזאט, ולאחר צנטריפוגה ב 290 x גרם במשך חמש דקות, להשליך את supernatant. יש לתלות את התאים במיליליטר אחד של DMEM המכיל תמיסת 1% פניצילין-סטרפטומיצין ו-10% סרום בקר עוברי ולספור.לאחר מכן הוסיפו גורם מגרה של מושבת גרנולוציטים מקרופאגים בתוספת אינטרלוקין-4 למדיום. התאם את ריכוז התאים ל-5 x 10 למיליליטר וחסן את התאים על גבי תלושי כיסוי. לאחר הוספת תרחיף התא לצלחת של שש בארות בשני מיליליטר לבאר, מניחים את הצלחת באינקובטור לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך 48 שעות.שנה את המדיום לחלוטין לאחר יומיים ושנה מחצית מהמדיום לאחר ארבעה ימים. טבלו את העכברים ב-75% אלכוהול לאחר המתת חסד והניחו אותם עם הפנים כלפי מעלה בצלחת פטרי מזכוכית בסדר ממוספר. העבירו את העכברים דרך חלון ההעברה לחדר הניתוח הסטרילי והניחו אותם על שולחן הניתוחים למשך חמש דקות.באמצעות מזרק, לשאף 10 מיליליטר של מלוחים. הטו את העכברים כלפי מטה בטמפרטורה של כ-45 מעלות והזריקו למרכז חלל הבטן. למשוך כחמישה מיליליטר של השעיית התא לתוך צינור צנטריפוגה 15 מיליליטר עבור כל 10 מיליליטר ולחזור על ההזרקה שלוש פעמים.צנטריפוגה של מתלה התא ב 129 x גרם במשך חמש דקות כדי לקבל מקרופאגים ראשוניים הצפק של העכבר. פיברובלסטים L929 הם מודל סינון שימושי לבדיקת רעילות במבחנה של NOD. כימות רמות הציטוקינים הדלקתיים בטחול יכול לסייע לחוקרים להבין טוב יותר את התגובה החיסונית.ניטור לימפוציטים ציטוטוקסיים מסוג T עם אימונוספוט הקשור לאנזימים הוא תקן הזהב להערכת חסינות תאי T ספציפיים לאנטיגן בניסויים קליניים ולסינון מועמדים לחיסונים. הספיגה המוגברת של אנטיגן על-ידי תאים דנדריטיים יכולה לעורר תגובות חיסוניות נרכשות משופרות. מקרופאגים ממלאים תפקיד חשוב בהצגת אנטיגנים לתאי T, כמו גם בגרימת תאים אחרים המציגים אנטיגן לבטא מולקולות ממריצות משותפות, ובכך ליזום תגובות חיסוניות נרכשות.בידוד התאים תחת היחס בין פעולה של תרופה לתא הם בעלי חשיבות עליונה.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vitro Cellular Activity Evaluation of the Nanoemulsion Vaccine Adjuvant Ophiopogonin D

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

האדם בידוד T לימפוציטים, התרבות ניתוח של הגירה במבחנה</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

ניתוח כמותי של השפעת כל סוג Hemagglutinins ויראלי ו Neuraminidases באמצעות נוגדנים יוניברסל מבחני כתם פשוט חריץ

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

דור של Arenavirus רקומביננטי לפיתוח חיסון בתאי Vero-FDA

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

הפקת חלבון סה&quot;כ ו2-D שיטות ג&#39;ל אלקטרופורזה עבור<em&gt; Burkholderia</em&gt; מינים

The investigation of  the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to  understanding the pathogenic mechanisms of diseases ...

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

הגבלת אנזים מבוסס שיבוט שיטה להערכה<em&gt; במבחנה</em&gt; יכולת שכפול של HIV-1 Gag-MJ4 וירוסי כימרי C סוג משנה

The protective effect of many HLA class I alleles on HIV-1 pathogenesis and disease progression is, in part, attributed to their ability to target ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

בניתוח חוץ גופייה של תיווך Myd88 הסלולרי תגובה החיסונית לוירוס הנילוס המערבי זיהום הזנים Mutant

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

הערכה של פתוגן-פונדקאי תגובות והיעילות החיסון בעכברים

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

בדיקת מחוץ גופית מבחן להערכת כלבת חיסון עוצמת

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...

Intranasal Immunization and Milk Collection in Studies of Maternal Immunization in New Zealand White Rabbits (Oryctolagus cuniculus)

Intranasal Immunization and Milk Collection in Studies of Maternal Immunization in New Zealand White Rabbits Oryctolagus cuniculus

חיסון תוך-כלי ואוסף חלב במחקרים על חיסון אימהי בארנבים הלבנים של ניו זילנד (Oryctolagus cuniculus)

Due to similarities in placentation and antibody transfer with humans, rabbits are an excellent model of maternal immunization. Additional advantages of ...