Name: in vitro cellular activity evaluation of the nanoemulsion vaccine adjuvant ophiopogonin d
Uploaded: 2022-12-09T13:35:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Cellular Activity Evaluation of the Nanoemulsion Vaccine Adjuvant Ophiopogonin D at JoVE.com

이 연구는 중국 국가 핵심 연구 개발 프로그램의 보조금 번호 2021YFC2302603, 중국 국립 자연 과학 재단 프로그램의 보조금 번호 31670938, 32070924, 82041045 및 32000651, 충칭 자연 과학 재단 프로젝트 프로그램의 보조금 번호 2014jcyjA0107 및 2019jcyjA-msxmx0159, 보조금 번호. 충칭의 대학원 연구 및 혁신 프로젝트의 CYS21519, 육군 의과 대학 특별 프로젝트의 보조금 번호 2020XBK24 및 대학생을위한 국가 혁신 및 기업가 정신 프로그램 202090031021 번 부여.

모든 세포 실험은 기본 수술실, 완충실, 멸균 배양실, 식별 및 분석실을 갖춘 세포 공학 실험실에서 수행되었습니다. 작업 환경과 조건에는 미생물 오염 및 기타 유해 요인이 없었습니다. 동물실험은 실험동물의 관리 및 사용에 관한 가이드라인에 의거하여 수행되었으며, 제3군의과대학 실험동물복지윤리위원회의 승인을 받았다.
1. 오토클레이브 및 재료 준비
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	<li>Cao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+of+graphene+oxide+as+a+potential+vaccine+carrier+and+adjuvant.">Recent progress of graphene oxide as a potential vaccine carrier and adjuvant.</a> Acta Biomaterials. 112, 14-28 (2020).</li><li>Ko, E. J., Kang, S. 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Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+CpG-adjuvanted+stable+prefusion+SARS-CoV-2+spike+antigen+as+a+subunit+vaccine+against+COVID-19.">Development of CpG-adjuvanted stable prefusion SARS-CoV-2 spike antigen as a subunit vaccine against COVID-19.</a> Scientific Reports. 10, 20085 (2020).</li><li>Twentyman, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interim+recommendation+of+the+Advisory+Committee+on+Immunization+Practices+for+use+of+the+Novavax+COVID-19+vaccine+in+persons+aged+&gt;/=18+years+-+United+States,+July+2022.">Interim recommendation of the Advisory Committee on Immunization Practices for use of the Novavax COVID-19 vaccine in persons aged &gt;/=18 years - United States, July 2022.</a> MMWR Morbidity and Mortality Weekly Report. 71 (31), 988-992 (2022).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+aluminum+adjuvants+eliciting+stronger+immune+response+when+mixed+with+hepatitis+B+virus+surface+antigens.">Improved aluminum adjuvants eliciting stronger immune response when mixed with hepatitis B virus surface antigens.</a> ACS Omega. 7 (38), 34528-34537 (2022).</li><li>Wang, N., Chen, M., Wang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomes+used+as+a+vaccine+adjuvant-delivery+system:+From+basics+to+clinical+immunization.">Liposomes used as a vaccine adjuvant-delivery system: From basics to clinical immunization.</a> Journal of Controlled Release. 303, 130-150 (2019).</li><li>Akin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+safety+and+efficacy+of+Advax(TM)+as+an+adjuvant:+A+systematic+review+and+meta-analysis.">Evaluation of the safety and efficacy of Advax(TM) as an adjuvant: A systematic review and meta-analysis.</a> Advances in Medical Sciences. 67 (1), 10-17 (2022).</li><li>Lacaille-Dubois, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Updated+insights+into+the+mechanism+of+action+and+clinical+profile+of+the+immunoadjuvant+QS-21:+A+review.">Updated insights into the mechanism of action and clinical profile of the immunoadjuvant QS-21: A review.</a> Phytomedicine. 60, 152905 (2019).</li><li>Marty-Roix, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+QS-21+as+an+inflammasome-activating+molecular+component+of+saponin+adjuvants.">Identification of QS-21 as an inflammasome-activating molecular component of saponin adjuvants.</a> The Journal of Biological Chemistry. 291 (3), 1123-1136 (2016).</li><li>Zhang, Y. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ophiopogonin+D+ameliorates+DNCB-induced+atopic+dermatitis-like+lesions+in+BALB/c+mice+and+TNF-alpha-+inflamed+HaCaT+cell.">Ophiopogonin D ameliorates DNCB-induced atopic dermatitis-like lesions in BALB/c mice and TNF-alpha- inflamed HaCaT cell.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 522 (1), 40-46 (2020).</li><li>Song, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+polysaccharide+from+Ophiopogon+japonicus+on+immune+response+to+Newcastle+disease+vaccine+in+chicken.">Effects of polysaccharide from Ophiopogon japonicus on immune response to Newcastle disease vaccine in chicken.</a> Pesquisa Veterin&#225;ria Brasileira. 36 (12), 1155-1159 (2016).</li><li>Tong, Y. 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M., Williams, A., Eisenbarth, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+the+immune+system+in+the+spleen.">Structure and function of the immune system in the spleen.</a> Science Immunology. 4 (33), (2019).</li><li>Cox, J. H., Ferrari, G., Janetzki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+cytokine+release+at+the+single+cell+level+using+the+ELISPOT+assay.">Measurement of cytokine release at the single cell level using the ELISPOT assay.</a> Methods. 38 (4), 274-282 (2006).</li><li>Elliott, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+microscopy:+Principles+and+modern+practices.">Confocal microscopy: Principles and modern practices.</a> Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68 (2020).</li><li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4(+)+T+cell+activation+and+inflammation+in+NASH-related+fibrosis.">CD4(+) T cell activation and inflammation in NASH-related fibrosis.</a> Frontiers in Immunology. 13, 967410 (2022).</li><li>Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+activation+and+polarization.">Macrophage activation and polarization.</a> Frontiers in Bioscience. 13, 453-461 (2008).</li><li>Quesniaux, V., Erard, F., Ryffel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adjuvant+activity+on+murine+and+human+macrophages.">Adjuvant activity on murine and human macrophages.</a> Methods in Molecular Biology. 626, 117-130 (2010).</li></ol>

서브유닛 백신은 안전성은 우수하지만 면역원성은 좋지 않습니다. 면역원성을 향상시키기 위한 주요 전략은 항원을 보조제와 물리적으로 흡착하거나 결합하고 이를 약물 전달 시스템에 통합하여 DC의 흡수 및 제시를 촉진하는 것입니다. 퀼라이아 사포닌 및 그 유도체와 같은 천연 식물 사포닌은 독성이 강하며 인간 백신 개발에 적합하지 않습니다17. 따라서 백신이나 보조제가 ?...

백신은 전염성 및 비 전염성 질병을 예방하고 치료하는 중요한 수단입니다. 백신 제형에 보조제 및 전달 비히클의 적절한 첨가는 항원의 면역원성을 향상시키고 오래 지속되는면역 반응을 생성하는 데 유익합니다1. 고전적인 보조제 명반 (알루미늄 염) 외에도 현재 판매되는 백신 용 보조제에는 MF592,3, AS04 3, AS03 3, AS01 3, CpG10184 및 Matrix-M5의 6 가지 보조제가 있습니다. 일반적으로 인체가 바이러스 공격을 받으면 1, 2차 방어선(피부, 점막, 대식세포)이 주도적으로 바이러스를 제거하고, 마지막으로 면역기관과 면역세포를 포함하는 3차 방어선이 활성화된다. 알루미늄 및 알루미늄 염은 1920년대 초부터 인간 백신에 가장 널리 사용되는 보조제였으며 효과적인 선천성면역 반응을 유도했습니다6. 그러나, 면역 세포가 특정 세트의 사이토카인 및 케모카인을 생성하도록 자극하는 고전적인 보조제에 의한 항원 제시 세포(APC)의 활성화는 보조제가 작동하는 메커니즘이며 보조제가 특정면역 반응에 일시적인 효과만 발휘하는 이유 중 하나일 수 있다고 제안되었습니다7. 인간 사용을 위한 제한된 허가된 보조제의 존재는 효과적인면역 반응을 유도하는 백신 개발을 위한 제한 요소입니다8.
현재, 점점 더 많은 보조 연구가 마우스에서 강력한 세포 면역 반응을 유도하는 능력을 입증하고 있습니다. QS-21은 균형 잡힌 T- 헬퍼 1 (Th1) 및 T- 헬퍼 2 (Th2) 면역 반응을 유도하고, 더 높은 수준의 항체 역가를 생성하고, 보조제로서의 보호를 연장시키는 것으로 나타 났지만, 강한 독성 및 용혈 특성으로 인해 독립형 임상 보조제 9,10. OP-D (루스코게닌-O-α-L-람노피라노시1-(1→2)-β-D-자일로피라노실-(1→3)-β-D-푸카피라노사이드)는 중국 약용 식물 오피오포곤 자포니카스4의 뿌리에서 분리된 스테로이드성 사포닌 중 하나입니다. 또한, 그것은 Radix Ophiopogonis에서 발견되는 주요 약리학 적 활성 성분 (Shen Mai San)이며 특정 약리학 적 특성을 갖는 것으로 알려져 있습니다11. 또한, 그것은 백합과에 속하며 세포 염증 및 심근 손상에 대한 억제 및 보호 효과로 널리 활용됩니다. 예를 들어, OP-D는 BALB/c 마우스12에서 DNCB 유발 아토피 피부염 유사 병변 및 종양 괴사 인자 알파(TNF-α) 염증성 HaCaT 세포를 개선합니다. 중요하게도, OP-D는 심혈 관계의 항산화 보호를 촉진하고 활성 산소 종 생성을 줄이고 미토콘드리아 막 손상을 방해하여 독소루비신 유발자가 포식 손상으로부터 심장을 보호합니다. 실험에 따르면 모노 데스모사이드와 함께 OP-D를 복용하면 면역 건강을 강화하고 백혈구 수와 DNA 합성을 증가시키며 항체를 더 오래 지속하는 데 도움이 됩니다13. OP-D는 보조 효과14를 갖는 것으로 이전에 밝혀졌다.
나노 에멀젼은 계면 활성제, 오일, 보조 계면 활성제 및 물12,15의 조합으로 구성된 수 중유 나노 제형입니다. 이러한 나노백신 설계는 항원과 보조제를 함께 캡슐화하여 면역 자극을 강화하고 항원을 보호하며 수지상 세포(DC) 성숙을 촉진합니다16. 스크리닝으로부터 수득된 이들 신규한 보조제의 개발을 위해서는, 이들의 세포 반응 능력을 평가하기 위한 적절한 방법을 찾는 것이 중요하다.
이 프로토콜의 목적은 보조제가 시험관 내 세포 배양에서 식균 작용 및 면역 세포의 발현을 향상시킬 수 있는지 체계적으로 평가하고 주요 실험 방법을 자세히 설명하는 것입니다. 실험은 4 개의 하위 섹션으로 나뉩니다 : (1) L929 세포에 대한 OP-D 및 NOD의 독성은 세포 계수 키트 -8 (CCK-8) 분석에 의해 결정됩니다. (2) 면역화 된 마우스에서 내분비 IFN-γ 및 IL-17A의 사이토 카인 수준과 상응하는 세포 수는 비장 세포 자극 및 ELISpot 분석에 의해 검출되고; (3) 보조 자극 후 DCs의 항원 제시 능력은 공초점 현미경을 사용하여 관찰되고; 및 (4) 보조제와 함께 공동 배양된 정상 마우스의 복막 대식세포(PMs)로부터 수득된 상청액에서 3가지 사이토카인, IL-1β, IL-6, 및 TNF-α가 검출된다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA (1x)</td>
			<td>GIBCO, USA</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well filter plates</td>
			<td>Millipore. Billerica, MA</td>
			<td>CLS3922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlPO4</td>
			<td>General Chemical Company, USA</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated Cell Counter</td>
			<td>Countstar, China</td>
			<td>IC1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/c mice and C57BL/6 mice</td>
			<td>Beijing HFK Bioscience Co. Ltd</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>caprylic/capric triglyceride (GTCC)</td>
			<td>Beijing Fengli Pharmaceutical Co. Ltd., Beijing, China</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCK-8 kits</td>
			<td>Dojindo, Japan</td>
			<td>CK04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counting Plate</td>
			<td>Costar, Corning, USA</td>
			<td>CO010101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Sieve</td>
			<td>biosharp, China</td>
			<td>BS-70-CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810 R</td>
			<td>Eppendorf, Germany&#160;</td>
			<td>5811000398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM basic(1x) medium</td>
			<td>GIBCO, USA</td>
			<td>C11885500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSZ5000X Inverted Microscope</td>
			<td>Nikon,Japan</td>
			<td>DSZ5000X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EL-35 (Cremophor-35)</td>
			<td>Mumbai, India</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISpot classic</td>
			<td>AID, Germany</td>
			<td>ELR06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>GIBCO, USA</td>
			<td>10099141C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Full-function Microplate Reader</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>VL0000D2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>P42212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Granulocyte Macrophage Colony-Stimulating Factor</td>
			<td>GM-CSF, R&#38;D Systems, USA</td>
			<td>315-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>15630106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HF 90/240 Incubator</td>
			<td>Heal Force, Switzerland</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-4</td>
			<td>PeproTech, USA</td>
			<td>042149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L929 cell line</td>
			<td>FENGHUISHENGWU, China</td>
			<td>&#160;NCTC clone 929 (RRID:CVCL_0462)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Scanning Confocal Microscopy</td>
			<td>Zeiss, Germany</td>
			<td>LSM 980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MONTANE 85 PPI</td>
			<td>SEPPIC, France</td>
			<td>L12910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MONTANOX 80 PPI</td>
			<td>SEPPIC, France</td>
			<td>36372K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IFN-&#947; ELISA kit</td>
			<td>Dakewe, China</td>
			<td>1210002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IFN-&#947; precoated ELISPOT kit</td>
			<td>Dakewe, China</td>
			<td>DKW22-2000-096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-17A ELISA kit</td>
			<td>Dakewe, China</td>
			<td>1211702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-17A ELISpotPLUS Kit</td>
			<td>ebiosciences, USA</td>
			<td>3521-4HPW-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-1&#946; ELISA kit</td>
			<td>Dakewe, China</td>
			<td>1210122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-6 ELISA kit</td>
			<td>Dakewe, China</td>
			<td>1210602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse TNF-&#945; ELISA kit</td>
			<td>Dakewe, China</td>
			<td>1217202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids(100x)</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophiopogonin-D</td>
			<td>Chengdu Purui Technology Co. Ltd</td>
			<td>945619-74-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin</td>
			<td>Solarbio, China</td>
			<td>CA1620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>ZSGB-BIO, China</td>
			<td>ZLI-9062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td>Solarbio, China</td>
			<td>R1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium</td>
			<td>Hyclone (Life Technology), USA</td>
			<td>SH30809.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate(100 mM)</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Squalene</td>
			<td>Sigma, USA</td>
			<td>S3626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;- Mercaptoethanol</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro cellular activity evaluation of the nanoemulsion vaccine adjuvant ophiopogonin d

백신의 주성분으로서 보조제는 항원과 관련된 강력하고 광범위하며 선천적이며 적응적인 면역 반응을 직접 유도하거나 향상시킬 수 있습니다. 오피오포곤 자포 니쿠스 식물에서 추출한 정제 성분인 오피오포고닌 D(OP-D)는 백신 보조제로 유용한 것으로 밝혀졌습니다. OP-D의 낮은 용해도 및 독성 문제는 저에너지 유화 방법을 사용하여 나노 에멀젼 오피오포고닌 D(NOD)를 제조함으로써 효과적으로 극복할 수 있습니다. 이 기사에서는 세포 활동 평가를 위한 일련의 시험관 내 프로토콜을 검사합니다. L929의 세포독성 효과는 세포 계수 키트-8 분석을 사용하여 결정하였다. 이어서, 면역화된 마우스로부터 비장세포를 자극하고 배양한 후에 분비된 사이토카인 수치 및 상응하는 면역세포수를 ELISA 및 ELISpot 방법으로 검출하였다. 또한, C57BL/6 마우스로부터 분리되고 GM-CSF와 IL-4로 배양한 후 성숙된 골수 유래 수지상 세포(BMDC)의 항원 흡수능을 레이저 스캐닝 공초점 현미경(CLSM)으로 관찰하였다. 중요하게는, 대식세포 활성화는 24시간 동안 보조제와 함께 빈 마우스로부터의 복막 대식세포 (PMs)를 공동 배양한 후 ELISA 키트에 의해 IL-1β, IL-6, 및 종양 괴사 인자 알파 (TNF-α) 사이토카인의 수준을 측정함으로써 확인되었다. 이 프로토콜이 다른 연구자들에게 새로운 백신 보조제의 세포 반응 효율성을 평가하기 위한 직접적이고 효과적인 실험적 접근 방식을 제공할 것으로 기대됩니다.

보조제 OP-D 및 NOD의 세포 활성 평가는 프로토콜 에 따라 시험관내에서 완료되었다. L929 섬유아세포는 NOD 의 시험관내 독성 시험을 위한 유용한 스크리닝 모델이다(도 1). 비장의 염증성 사이토카인 수치의 정량화는 연구자들이 면역 반응을 더 잘 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다(그림 2). ELISpot을 사용한 CTL 모니터링은 임상 시험에서 항?...

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In Vitro Cellular Activity Evaluation of the Nanoemulsion Vaccine Adjuvant Ophiopogonin D

이 프로토콜은 나노 에멀젼 오피오포고닌 D 보조제가 효과적인 세포 면역 반응을 촉진하는지 여부를 평가하기 위한 상세한 방법을 제시합니다.

체외 나노에멀젼 백신 보조제인 오피오포고닌 D의 세포 활성 평가

As a principal ingredient of vaccines, adjuvants can directly induce or enhance the powerful, widespread, innate, and adaptive immune responses associated ...

이 프로토콜은 다른 연구자들에게 직접적이고 효과적인 실험적 접근법과 새로운 백신 보조제의 세포 반응 효율성을 평가하기 위한 세부 단계를 제공할 수 있습니다. 연구자에게 보조제에 대한 특정 세포 평가 방법을 제공 할뿐만 아니라 BM 질환과 같은 추출 방법을 분해 할 수도 있습니다. 이 프로토콜은 독성이 없고 높은 세포 전달을 입증할 뿐만 아니라 보조제 평가 분야에 대한 자세한 절차도 제공합니다.시작하려면 수조를 켜고 온도를 섭씨 37도로 조정하십시오. 그런 다음 액체 질소에서 냉동 L929 세포 튜브를 수집 한 후 수조에서 빠르게 해동합니다. 세포를 15 밀리리터 멸균 원심분리 튜브에 피펫팅한 후, DMEM 2밀리리터를 넣고 잘 혼합합니다.샘플을 129 x g에서 5분 동안 원심분리합니다. 그리고 상청액을 버린 후 2 밀리리터의 DMEM을 추가하여 세포를 재현탁시킵니다. 샘플을 다시 원심분리합니다.그리고 상청액을 버린 후 재현탁용 DMEM 완전 배지 6밀리리터를 첨가하고 섭씨 37도의 인큐베이터에서 5%이산화탄소가 있는 T25cm 제곱 배양 플라스크로 옮겨 48시간 동안 배양합니다. 1 차 예방 접종 후 24 일째에 동물 방에서 마우스를 꺼내 유리 접시에 넣고 5 분 동안 75 % 알코올에 담그십시오. 원심 분리 튜브를 원심 분리기 튜브 랙에 놓고 일회용 페트리 접시에 번호를 매기고 10 밀리리터 피펫으로 각 페트리 접시에 5 밀리리터의 PBS를 추가합니다.마우스의 왼쪽 복부 중앙에서 가위로 6-8 센티미터 절개를하십시오. 피부를 찢어 복벽을 노출시키고 비장의 긴 빨간색 스트립을 찾습니다. 다음으로, 집게로 비장의 아래쪽에있는 복막을 들어 올리십시오.그것을 열고 위로 돌려 비장을 노출시킵니다. 집게로 비장을 들어 올리십시오. 안과 가위로 비장 아래의 결합 조직을 분리하고 비장을 제거하십시오.5 밀리리터의 PBS가 들어있는 페트리 접시에 비장을 넣고 체와 주사기 플런저로 분쇄하십시오. 분쇄 후, 번호를 매기고 피펫으로 액체를 15 밀리리터 원심 분리 튜브로 옮깁니다. 다음으로, 액체를 453 x g에서 5 분 동안 원심 분리한다.그리고 상청액을 버린 후 각 튜브에 3 밀리리터의 적혈구 용해 완충액을 첨가하십시오. 세포를 재현탁시키고 실온에서 10분 동안 용해시킨다. 그런 다음 각 튜브에 10-12 밀리리터의 PBS를 추가하십시오.453 x g에서 5분 동안 혼합 및 원심분리한 후, 상청액을 버리고 각 원심분리 튜브에 PBS 10ml를 첨가하고 세포를 재현탁시킨다. 세포 계수 플레이트의 웰에서 각 샘플 20 마이크로 리터를 취하고 자동 세포 카운터를 사용하여 살아있는 세포 수를 기록합니다. 다음으로, 샘플을 453 x g에서 5분 동안 원심분리한다.상청액을 폐기한 후, 6번째 세포를 RF10 배지로 밀리리터당 2.5 x 10으로 희석하고, 웰당 100 마이크로리터로 96-웰 플레이트에 첨가한다. 가위로 마우스 복부 아래 6-8 센티미터의 절개를 자르고 개구부의 두 끝을 고정하여 다른 방향으로 분리하고 마우스 다리를 노출시킵니다. 마우스 대퇴골을 마우스 몸에서, 경골을 관절에서 분리하십시오.그리고 양쪽 끝에서 뼈를 그대로 유지하십시오. 다음으로 가위와 집게로 대퇴골 양쪽 끝의 관절 관절에서 잔여 조직과 연골을 제거하십시오. 대퇴골을 75 % 알코올에 5 분 동안 담근 다음 멸균 PBS 용액에 담가 표면 알코올을 씻어냅니다.그런 다음 가위로 대퇴골의 끝을 잘라 내고 멸균 PBS 용액으로 멸균 된 페트리 접시에서 골수를 헹구고 1 밀리리터 주사기로 흡인합니다. 세척을 3-5 회 반복하십시오. 다음으로, 세포 체로 여과하고 골수 유래 수지상 세포를 15 밀리리터 원심 분리 튜브에 모은다.샘플을 290 x g에서 5분 동안 원심분리한 후, 상청액을 버리고 4밀리리터의 적혈구 용해 완충액을 첨가하고, 재현탁시키고, 실온에서 5분 동안 용해시킨다. 다음으로, 10 밀리리터의 멸균 PBS 용액을 첨가하여 용해물을 중화시키고, 290 x g에서 5분 동안 원심분리한 후, 상청액을 버린다. 1% 페니실린-스트렙토마이신 용액과 10% 태아 소 혈청을 포함하는 DMEM 1밀리리터에 세포를 재현탁하고 계수합니다.그런 다음 과립구 대 식세포 콜로니 자극 인자와 인터루킨 -4를 배지에 첨가하십시오. 세포 농도를 밀리리터당 5 x 10에서 5로 조정하고 커버 슬립에 세포를 접종합니다. 세포 현탁액을 웰당 2밀리리터의 6웰 플레이트에 추가한 후 플레이트를 섭씨 37도의 가습 인큐베이터에 넣고 5%이산화탄소를 48시간 동안 넣습니다.2일 후에 배지를 완전히 교체하고 4일 후에 배지의 절반을 교체하십시오. 안락사 후 생쥐를 75%알코올에 담그고 앞면이 위로 향하도록 유리 페트리 접시에 번호를 매긴 순서대로 놓습니다. 마우스를 이송 창을 통해 멸균 수술실로 통과시키고 5 분 동안 수술대에 놓습니다.주사기를 사용하여 10 밀리리터의 식염수를 흡인하십시오. 마우스를 약 45도 아래로 기울이고 복강 중앙에 주사하십시오. 각 10 밀리리터에 대해 15 밀리리터의 원심 분리 튜브에 약 5 밀리리터의 세포 현탁액을 넣고 주입을 세 번 반복하십시오.세포 현탁액을 129 x g에서 5분 동안 원심분리하여 마우스 복막 1차 대식세포를 얻었다. L929 섬유아세포는 NOD의 시험관내 독성 시험을 위한 유용한 스크리닝 모델이다. 비장의 염증성 사이토카인 수치의 정량화는 연구자들이 면역 반응을 더 잘 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다.효소 결합 면역반점으로 세포독성 T 림프구를 모니터링하는 것은 임상 시험에서 항원 특이적 T 세포 면역을 평가하고 백신 후보를 선별하기 위한 황금 표준입니다. 수지상 세포에 의한 항원의 증가 된 흡수는 향상된 적응 면역 반응을 이끌어 낼 수 있습니다. 대식세포는 T 세포에 항원을 제시하고 다른 항원 제시 세포가 공동 자극 분자를 발현하도록 유도하여 적응 면역 반응을 시작하는 데 중요한 역할을 합니다.약물 대 세포 작용의 비율에 따른 세포의 분리가 가장 중요합니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vitro Cellular Activity Evaluation of the Nanoemulsion Vaccine Adjuvant Ophiopogonin D

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

마이 그 레이션의 인간 T 림프구 분리, 문화 및 분석 체외에서</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

연구

면역학 및 감염병학

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

모든 독감의 양적 분석 간단한 슬롯 얼룩 Assays에서 유니버설 항체를 사용하는 바이러스성 Hemagglutinins 및 Neuraminidases를 입력하십시오

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

FDA 승인 베로 세포 백신 개발을위한 재조합 Arenavirus의 생성

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

총 단백질 추출 및 2-D 겔 전기 영동 방법에 대한<em&gt; Burkholderia의</em&gt; 종

The investigation of  the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to  understanding the pathogenic mechanisms of diseases ...

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

제한 효소 기반의 복제 방법을 평가하기 위해<em&gt; 시험관</em&gt; HIV-1 서브 타입 C 개그 - MJ4 키메라 바이러스의 복제 능력

The protective effect of many HLA class I alleles on HIV-1 pathogenesis and disease progression is, in part, attributed to their ability to target ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

웨스트 나일 바이러스 돌연변이 균주의 감염에에서 MyD88 매개 세포 면역 반응의 생체 외 분석

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

호스트 병원 체 응답 및 쥐에 백신의 효능 평가

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

광견병 백신 효능을 평가하기 위한 시험관 내 ELISA 테스트

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...

Intranasal Immunization and Milk Collection in Studies of Maternal Immunization in New Zealand White Rabbits (Oryctolagus cuniculus)

Intranasal Immunization and Milk Collection in Studies of Maternal Immunization in New Zealand White Rabbits Oryctolagus cuniculus

뉴질랜드 흰 토끼의 모성 예방 접종 연구에서 비강 내 예방 접종 및 우유 수집(Oryctolagus cuniculus)

Due to similarities in placentation and antibody transfer with humans, rabbits are an excellent model of maternal immunization. Additional advantages of ...