Name: in vitro cellular activity evaluation of the nanoemulsion vaccine adjuvant ophiopogonin d
Uploaded: 2022-12-09T13:35:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Cellular Activity Evaluation of the Nanoemulsion Vaccine Adjuvant Ophiopogonin D at JoVE.com

Это исследование было поддержано грантом No 2021YFC2302603 Национальной программы ключевых исследований и разработок Китая, грантами No 31670938, 32070924, 82041045 и 32000651 Программы Национального фонда естественных наук Китая, грантами No 2014jcyjA0107 и No 2019jcyjA-msxmx0159 Проектной программы Фонда естественных наук Чунцина, грантом No CYS21519 Проекта исследований и инноваций для аспирантов Чунцина, грант No 2020XBK24 Специальных проектов Армейского медицинского университета и грант No 202090031021 Национальной программы инноваций и предпринимательства для студентов колледжей.

Все клеточные эксперименты проводились в лаборатории клеточной инженерии, оснащенной базовыми операционными, буферными комнатами, стерильными культуральными комнатами, а также комнатами идентификации и анализа. Рабочая среда и условия были свободны от микробного загрязнения и друг?...

<ol>
	<li>Cao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+of+graphene+oxide+as+a+potential+vaccine+carrier+and+adjuvant.">Recent progress of graphene oxide as a potential vaccine carrier and adjuvant.</a> Acta Biomaterials. 112, 14-28 (2020).</li><li>Ko, E. J., Kang, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunology+and+efficacy+of+MF59-adjuvanted+vaccines.">Immunology and efficacy of MF59-adjuvanted vaccines.</a> Human Vaccines &amp; Immunotherapeutics. 14 (12), 3041-3045 (2018).</li><li>Shi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccine+adjuvants:+Understanding+the+structure+and+mechanism+of+adjuvanticity.">Vaccine adjuvants: Understanding the structure and mechanism of adjuvanticity.</a> Vaccine. 37 (24), 3167-3178 (2019).</li><li>Kuo, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+CpG-adjuvanted+stable+prefusion+SARS-CoV-2+spike+antigen+as+a+subunit+vaccine+against+COVID-19.">Development of CpG-adjuvanted stable prefusion SARS-CoV-2 spike antigen as a subunit vaccine against COVID-19.</a> Scientific Reports. 10, 20085 (2020).</li><li>Twentyman, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interim+recommendation+of+the+Advisory+Committee+on+Immunization+Practices+for+use+of+the+Novavax+COVID-19+vaccine+in+persons+aged+&gt;/=18+years+-+United+States,+July+2022.">Interim recommendation of the Advisory Committee on Immunization Practices for use of the Novavax COVID-19 vaccine in persons aged &gt;/=18 years - United States, July 2022.</a> MMWR Morbidity and Mortality Weekly Report. 71 (31), 988-992 (2022).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+aluminum+adjuvants+eliciting+stronger+immune+response+when+mixed+with+hepatitis+B+virus+surface+antigens.">Improved aluminum adjuvants eliciting stronger immune response when mixed with hepatitis B virus surface antigens.</a> ACS Omega. 7 (38), 34528-34537 (2022).</li><li>Wang, N., Chen, M., Wang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomes+used+as+a+vaccine+adjuvant-delivery+system:+From+basics+to+clinical+immunization.">Liposomes used as a vaccine adjuvant-delivery system: From basics to clinical immunization.</a> Journal of Controlled Release. 303, 130-150 (2019).</li><li>Akin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+safety+and+efficacy+of+Advax(TM)+as+an+adjuvant:+A+systematic+review+and+meta-analysis.">Evaluation of the safety and efficacy of Advax(TM) as an adjuvant: A systematic review and meta-analysis.</a> Advances in Medical Sciences. 67 (1), 10-17 (2022).</li><li>Lacaille-Dubois, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Updated+insights+into+the+mechanism+of+action+and+clinical+profile+of+the+immunoadjuvant+QS-21:+A+review.">Updated insights into the mechanism of action and clinical profile of the immunoadjuvant QS-21: A review.</a> Phytomedicine. 60, 152905 (2019).</li><li>Marty-Roix, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+QS-21+as+an+inflammasome-activating+molecular+component+of+saponin+adjuvants.">Identification of QS-21 as an inflammasome-activating molecular component of saponin adjuvants.</a> The Journal of Biological Chemistry. 291 (3), 1123-1136 (2016).</li><li>Zhang, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ophiopogonin+D+attenuates+doxorubicin-induced+autophagic+cell+death+by+relieving+mitochondrial+damage+in+vitro+and+in+vivo.">Ophiopogonin D attenuates doxorubicin-induced autophagic cell death by relieving mitochondrial damage in vitro and in vivo.</a> The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 352 (1), 166-174 (2015).</li><li>An, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ophiopogonin+D+ameliorates+DNCB-induced+atopic+dermatitis-like+lesions+in+BALB/c+mice+and+TNF-alpha-+inflamed+HaCaT+cell.">Ophiopogonin D ameliorates DNCB-induced atopic dermatitis-like lesions in BALB/c mice and TNF-alpha- inflamed HaCaT cell.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 522 (1), 40-46 (2020).</li><li>Song, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+polysaccharide+from+Ophiopogon+japonicus+on+immune+response+to+Newcastle+disease+vaccine+in+chicken.">Effects of polysaccharide from Ophiopogon japonicus on immune response to Newcastle disease vaccine in chicken.</a> Pesquisa Veterin&#225;ria Brasileira. 36 (12), 1155-1159 (2016).</li><li>Tong, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immunopotentiator,+ophiopogonin+D,+encapsulated+in+a+nanoemulsion+as+a+robust+adjuvant+to+improve+vaccine+efficacy.">An immunopotentiator, ophiopogonin D, encapsulated in a nanoemulsion as a robust adjuvant to improve vaccine efficacy.</a> Acta Biomaterialia. 77, 255-267 (2018).</li><li>Lin, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronic+acid-glycine-cholesterol+conjugate-based+nanoemulsion+as+a+potent+vaccine+adjuvant+for+T+cell-mediated+immunity.">Hyaluronic acid-glycine-cholesterol conjugate-based nanoemulsion as a potent vaccine adjuvant for T cell-mediated immunity.</a> Pharmaceutics. 13 (10), 1569 (2021).</li><li>Xu, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+metabolomic+and+lipidomic+analysis+reveals+the+potential+mechanisms+of+hemolysis+effect+of+ophiopogonin+D+and+ophiopogonin+D'+in+vivo.">Global metabolomic and lipidomic analysis reveals the potential mechanisms of hemolysis effect of ophiopogonin D and ophiopogonin D' in vivo.</a> Chinese Medicine. 16 (1), 3 (2021).</li><li>Drane, D., Gittleson, C., Boyle, J., Maraskovsky, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISCOMATRIX+adjuvant+for+prophylactic+and+therapeutic+vaccines.">ISCOMATRIX adjuvant for prophylactic and therapeutic vaccines.</a> Expert Review of Vaccines. 6 (5), 761-772 (2007).</li><li>Rudolf, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microstructure+characterisation+and+identification+of+the+mechanical+and+functional+properties+of+a+new+PMMA-ZnO+composite.">Microstructure characterisation and identification of the mechanical and functional properties of a new PMMA-ZnO composite.</a> Materials. 13 (12), 2717 (2020).</li><li>Cannella, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxicity+evaluation+of+endodontic+pins+on+L929+cell+line.">Cytotoxicity evaluation of endodontic pins on L929 cell line.</a> BioMed Research International. 2019, 3469525 (2019).</li><li>Jiao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+MTT+and+CCK-8+assay+for+evaluation+of+graphene+cytotoxicity.">Limitations of MTT and CCK-8 assay for evaluation of graphene cytotoxicity.</a> RSC Advances. 5 (66), 53240-53244 (2015).</li><li>Ghasemi, M., Turnbull, T., Sebastian, S., Kempson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MTT+assay:+Utility,+limitations,+pitfalls,+and+interpretation+in+bulk+and+single-cell+analysis.">The MTT assay: Utility, limitations, pitfalls, and interpretation in bulk and single-cell analysis.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 12827 (2021).</li><li>Li, W., Zhou, J., Xu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+the+in+vitro+cytotoxicity+testing+of+medical+devices.">Study of the in vitro cytotoxicity testing of medical devices.</a> Biomedical Reports. 3 (5), 617-620 (2015).</li><li>Wu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+elevated+inflammatory+cytokines+of+spleen+and+spleen+index+in+acute+spinal+cord+injury.">Correlation between elevated inflammatory cytokines of spleen and spleen index in acute spinal cord injury.</a> Journal of Neuroimmunology. 344, 577264 (2020).</li><li>Lewis, S. M., Williams, A., Eisenbarth, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+the+immune+system+in+the+spleen.">Structure and function of the immune system in the spleen.</a> Science Immunology. 4 (33), (2019).</li><li>Cox, J. H., Ferrari, G., Janetzki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+cytokine+release+at+the+single+cell+level+using+the+ELISPOT+assay.">Measurement of cytokine release at the single cell level using the ELISPOT assay.</a> Methods. 38 (4), 274-282 (2006).</li><li>Elliott, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+microscopy:+Principles+and+modern+practices.">Confocal microscopy: Principles and modern practices.</a> Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68 (2020).</li><li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4(+)+T+cell+activation+and+inflammation+in+NASH-related+fibrosis.">CD4(+) T cell activation and inflammation in NASH-related fibrosis.</a> Frontiers in Immunology. 13, 967410 (2022).</li><li>Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+activation+and+polarization.">Macrophage activation and polarization.</a> Frontiers in Bioscience. 13, 453-461 (2008).</li><li>Quesniaux, V., Erard, F., Ryffel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adjuvant+activity+on+murine+and+human+macrophages.">Adjuvant activity on murine and human macrophages.</a> Methods in Molecular Biology. 626, 117-130 (2010).</li></ol>

Субъединичные вакцины обеспечивают отличную безопасность, но плохую иммуногенность. Основная стратегия повышения иммуногенности заключается в физическом адсорбировании или соединении антигенов с адъювантами и включении их в системы доставки лекарств для содействия поглощению и пр...

Вакцины являются важным средством профилактики и лечения инфекционных и неинфекционных заболеваний. Соответствующее добавление адъювантов и средств доставки в составы вакцин полезно для повышения иммуногенности антигенов и генерации длительных иммунных реакций1. В дополнение к классическим адъювантным квасцам (алюминиевая соль), существует шесть видов адъювантов для вакцин, которые в настоящее время продаются: MF59 2,3, AS043,AS03 3, AS013, CpG10184 и Matrix-M5. Как правило, когда организм человека сталкивается с вирусной атакой, первая и вторая линии защиты (кожа, слизистая оболочка и макрофаги) берут на себя инициативу в очистке вируса, и, наконец, активируется третья линия защиты, включающая иммунные органы и иммунные клетки. Алюминий и соли алюминия были наиболее широко используемыми адъювантами для вакцин человека с начала 1920-х годов, вызывая эффективный врожденный иммунный ответ6. Однако было высказано предположение, что активация антигенпрезентирующих клеток (АПК) классическими адъювантами, которая стимулирует иммунные клетки генерировать специфические наборы цитокинов и хемокинов, является механизмом, с помощью которого работают адъюванты, и может быть одной из причин, по которой адъюванты оказывают только преходящее воздействие на специфические иммунные реакции7. Наличие ограниченных лицензированных адъювантов для использования человеком является ограничительным фактором для разработки вакцин, которые вызывают эффективные иммунные реакции8.
В настоящее время все большее число адъювантных исследований демонстрирует способность индуцировать сильный клеточный иммунный ответ у мышей. Было показано, что QS-21 индуцирует сбалансированный иммунный ответ Т-хелпер 1 (Th1) и Т-хелпер 2 (Th2), продуцирует более высокие уровни титров антител и продлевает защиту в качестве адъюванта, но его сильная токсичность и гемолитические свойства ограничивают его развитие в качестве автономного клинического адъюванта 9,10. OP-D (рускогенин-O-α-L-рамнопиранозии1-(1→2)-β-D-ксилопиранозил-(1→3)-β-D-фукопиранозид) является одним из стероидных сапонинов, выделенных из корня китайского лекарственного растения Ophiopogon japonicas4. Кроме того, это главный фармакологически активный компонент (Shen Mai San), обнаруженный в Radix Ophiopogonis и, как известно, обладающий определенными фармакологическими свойствами11. Кроме того, он является членом семейства Liliaceae и широко используется для его ингибирующих и защитных эффектов при клеточном воспалении и повреждении миокарда. Например, OP-D улучшает DNCB-индуцированные атопические дерматитоподобные поражения и альфа-фактор некроза опухоли (TNF-α) воспалительные клетки HaCaT у мышей BALB/c12. Важно отметить, что OP-D способствует антиоксидантной защите сердечно-сосудистой системы и защищает сердце от аутофагического повреждения, вызванного доксорубицином, уменьшая как генерацию активных форм кислорода, так и нарушая повреждение митохондриальной мембраны. Эксперименты показали, что прием OP-D с монодесмозидом помогает укрепить иммунное здоровье, увеличить количество лейкоцитов и синтез ДНК, а также продлить срок действия антител13. Ранее было установлено, что OP-D обладает адъювантным эффектом14.
Наноэмульсии представляют собой наноформуляции «масло в воде», состоящие из комбинации поверхностно-активных веществ, масла, соврафактантов и воды12,15. Эти нановакцинные конструкции позволяют инкапсулировать антигены и адъюванты вместе для усиления иммунной стимуляции, защиты антигенов и содействия созреванию дендритных клеток (DC)16. Для разработки этих новых адъювантов, полученных в результате скрининга, важно найти соответствующие методы оценки их способностей клеточного ответа.
Целью этого протокола является систематическая оценка того, могут ли адъюванты усиливать фагоцитоз и экспрессию иммунных клеток в культуре клеток in vitro , и разработка основных экспериментальных методов. Эксперимент разделен на четыре подраздела: (1) токсичность OP-D и NOD для клеток L929 определяется с помощью анализа набора для подсчета клеток-8 (CCK-8); (2) уровни цитокинов эндокринных IFN-γ и IL-17A и соответствующие номера клеток у иммунизированных мышей обнаруживаются с помощью стимуляции спленоцитов и анализов ELISpot; (3) антигенная презентационная способность ДК после адъювантной стимуляции наблюдается с помощью конфокальной микроскопии; и (4) обнаруживаются три вида цитокинов, IL-1β, IL-6 и TNF-α, в супернатантах, полученных из перитонеальных макрофагов (ПМ) у нормальных мышей, кокутивированных с адъювантами.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA (1x)</td>
			<td>GIBCO, USA</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well filter plates</td>
			<td>Millipore. Billerica, MA</td>
			<td>CLS3922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlPO4</td>
			<td>General Chemical Company, USA</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated Cell Counter</td>
			<td>Countstar, China</td>
			<td>IC1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/c mice and C57BL/6 mice</td>
			<td>Beijing HFK Bioscience Co. Ltd</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>caprylic/capric triglyceride (GTCC)</td>
			<td>Beijing Fengli Pharmaceutical Co. Ltd., Beijing, China</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCK-8 kits</td>
			<td>Dojindo, Japan</td>
			<td>CK04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counting Plate</td>
			<td>Costar, Corning, USA</td>
			<td>CO010101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Sieve</td>
			<td>biosharp, China</td>
			<td>BS-70-CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810 R</td>
			<td>Eppendorf, Germany&#160;</td>
			<td>5811000398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM basic(1x) medium</td>
			<td>GIBCO, USA</td>
			<td>C11885500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSZ5000X Inverted Microscope</td>
			<td>Nikon,Japan</td>
			<td>DSZ5000X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EL-35 (Cremophor-35)</td>
			<td>Mumbai, India</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISpot classic</td>
			<td>AID, Germany</td>
			<td>ELR06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>GIBCO, USA</td>
			<td>10099141C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Full-function Microplate Reader</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>VL0000D2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>P42212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Granulocyte Macrophage Colony-Stimulating Factor</td>
			<td>GM-CSF, R&#38;D Systems, USA</td>
			<td>315-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>15630106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HF 90/240 Incubator</td>
			<td>Heal Force, Switzerland</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-4</td>
			<td>PeproTech, USA</td>
			<td>042149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L929 cell line</td>
			<td>FENGHUISHENGWU, China</td>
			<td>&#160;NCTC clone 929 (RRID:CVCL_0462)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Scanning Confocal Microscopy</td>
			<td>Zeiss, Germany</td>
			<td>LSM 980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MONTANE 85 PPI</td>
			<td>SEPPIC, France</td>
			<td>L12910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MONTANOX 80 PPI</td>
			<td>SEPPIC, France</td>
			<td>36372K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IFN-&#947; ELISA kit</td>
			<td>Dakewe, China</td>
			<td>1210002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IFN-&#947; precoated ELISPOT kit</td>
			<td>Dakewe, China</td>
			<td>DKW22-2000-096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-17A ELISA kit</td>
			<td>Dakewe, China</td>
			<td>1211702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-17A ELISpotPLUS Kit</td>
			<td>ebiosciences, USA</td>
			<td>3521-4HPW-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-1&#946; ELISA kit</td>
			<td>Dakewe, China</td>
			<td>1210122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-6 ELISA kit</td>
			<td>Dakewe, China</td>
			<td>1210602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse TNF-&#945; ELISA kit</td>
			<td>Dakewe, China</td>
			<td>1217202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids(100x)</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophiopogonin-D</td>
			<td>Chengdu Purui Technology Co. Ltd</td>
			<td>945619-74-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin</td>
			<td>Solarbio, China</td>
			<td>CA1620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>ZSGB-BIO, China</td>
			<td>ZLI-9062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td>Solarbio, China</td>
			<td>R1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium</td>
			<td>Hyclone (Life Technology), USA</td>
			<td>SH30809.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate(100 mM)</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Squalene</td>
			<td>Sigma, USA</td>
			<td>S3626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;- Mercaptoethanol</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro cellular activity evaluation of the nanoemulsion vaccine adjuvant ophiopogonin d

В качестве основного ингредиента вакцин адъюванты могут непосредственно индуцировать или усиливать мощные, широко распространенные, врожденные и адаптивные иммунные реакции, связанные с антигенами. Было обнаружено, что офиопогонин D (OP-D), очищенный компонент, извлеченный из растения Ophiopogon japonicus, полезен в качестве адъюванта вакцины. Проблемы низкой растворимости и токсичности OP-D могут быть эффективно преодолены с помощью метода низкоэнергетического эмульгирования для получения наноэмульсии офиопогонина D (NOD). В этой статье рассматривается ряд протоколов in vitro для оценки клеточной активности. Цитотоксические эффекты L929 определяли с помощью анализа набора для подсчета клеток-8. Затем секретируемые уровни цитокинов и соответствующие номера иммунных клеток после стимуляции и культивирования спленоцитов у иммунизированных мышей были обнаружены методами ИФА и ELISpot. Кроме того, способность поглощения антигена в дендритных клетках костного мозга (BMDC), которые были выделены у мышей C57BL/6 и созрели после инкубации с GM-CSF плюс IL-4, наблюдалась с помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии (CLSM). Важно отметить, что активация макрофагов была подтверждена путем измерения уровней цитокинов IL-1β, IL-6 и альфа-фактора некроза опухоли (TNF-α) с помощью наборов ИФА после кокультурирования перитонеальных макрофагов (ПМ) у чистых мышей с адъювантом в течение 24 ч. Есть надежда, что этот протокол предоставит другим исследователям прямые и эффективные экспериментальные подходы к оценке эффективности клеточного ответа новых вакцинных адъювантов.

Оценка клеточной активности адъювантов OP-D и NOD была завершена in vitro в соответствии с протоколом. Фибробласты L929 являются полезной скрининговой моделью для тестирования токсичности NOD in vitro (рисунок 1). Количественная оценка уровней воспалительных цитокинов в се...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Cellular Activity Evaluation of the Nanoemulsion Vaccine Adjuvant Ophiopogonin D at JoVE.com

In Vitro Cellular Activity Evaluation of the Nanoemulsion Vaccine Adjuvant Ophiopogonin D

В протоколе представлены подробные методы оценки того, способствует ли наноэмульсионный адъювант офиопогонина D эффективным клеточным иммунным реакциям.

В пробирке Оценка клеточной активности наноэмульсионной вакцины Адъювант офиопогонин D

As a principal ingredient of vaccines, adjuvants can directly induce or enhance the powerful, widespread, innate, and adaptive immune responses associated ...

Этот протокол может предоставить другим исследователям прямые и эффективные экспериментальные подходы и подробные шаги для оценки эффективности клеточного ответа новых адъювантов вакцины. Он не только предоставляет исследователям конкретные методы клеточной оценки адъювантов, но также может разрушать методы экстракции, такие как болезнь БМ. Эти протоколы не только демонстрируют отсутствие токсичности и высокую клеточную доставку, но и предоставляют подробные процедуры для области оценки адъюванта.Для начала включите водяную баню и отрегулируйте температуру до 37 градусов по Цельсию. Затем, собрав трубку замороженных клеток L929 из жидкого азота, быстро разморозьте на водяной бане. После пипетки клеток в 15-миллилитровую стерильную центрифужную трубку добавляют два миллилитра ДМЭМ и хорошо перемешивают.Центрифугирование образцов при 129 х г в течение пяти минут. И после выброса супернатанта добавьте два миллилитра DMEM для повторного суспендирования клеток. Центрифугируйте образцы снова.А после выброса супернатанта добавляют шесть миллилитров полной среды DMEM для повторного суспендирования и переносят в квадратную колбу для культивирования T25 сантиметров в инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия с 5% углекислого газа для культивирования в течение 48 часов. На 24 день после первичной иммунизации выведите мышей из комнаты для животных, поместите в стеклянную посуду и замочите в 75% спирте в течение пяти минут. Поместите трубки центрифуги на стойку для трубок центрифуги, пронумеруйте одноразовые чашки Петри и добавьте пять миллилитров PBS к каждой чашке Петри с помощью пипетки 10 миллилитров.Сделайте шести-восьмисантиметровый разрез ножницами посередине левой вентральной стороны мыши. Разорвите кожу, чтобы обнажить брюшную стенку и найти длинную красную полоску селезенки. Далее поднимите брюшину на нижнюю сторону селезенки щипцами.Разрежьте его и поверните вверх, чтобы обнажить селезенку. Поднимите селезенку щипцами. Отделите соединительную ткань под селезенкой офтальмологическими ножницами и удалите селезенку.Поместите селезенку в чашку Петри, содержащую пять миллилитров PBS, и измельчите с помощью сита и шприцевого плунжера. После измельчения переложить жидкость в 15-миллилитровую центрифужную трубку с пипеткой в соответствии с нумерацией. Затем центрифугируйте жидкость при 453 х г в течение пяти минут.А после выброса супернатанта добавьте в каждую трубку три миллилитра буфера лизиса эритроцитов. Повторно суспендировать клетки и лизировать при комнатной температуре в течение 10 минут. Затем добавьте от 10 до 12 миллилитров PBS в каждую трубку.А после смешивания и центрифугирования при 453 х г в течение пяти минут отбросьте надосадочный агент и добавьте 10 миллилитров PBS в каждую трубку центрифуги и повторно суспендируйте клетки. Возьмите 20 микролитров каждого образца в колодце счетной пластины и запишите количество живых клеток с помощью автоматизированного счетчика клеток. Затем центрифугируйте образцы при 453 х г в течение пяти минут.А после выброса супернатанта разбавляют до 2,5 х 10 до шестых ячеек на миллилитр средой RF10 и добавляют в 96-луночную пластину по 100 микролитров на лунку. Вырежьте ножницами разрез на шесть-восемь сантиметров ниже брюшка мыши и зажмите два конца отверстия, чтобы отделить его в разные стороны и обнажить ноги мыши. Отделите бедренную кость мыши от тела мыши и большеберцовую кость от сустава.И держите кости нетронутыми на обоих концах. Далее удаляют остаточную ткань и хрящи из суставных суставов на обоих концах бедренной кости ножницами и щипцами. Замочите бедренные кости в 75% спирте в течение пяти минут, а затем замочите в стерильном растворе PBS, чтобы смыть поверхностный спирт.Затем ножницами срезают концы бедренных костей и ополаскивают костный мозг в стерильной чашке Петри стерильным раствором PBS с последующим аспирацией одним миллилитровым шприцем. Повторите стирку три-пять раз. Затем отфильтруйте клеточным ситом и соберите дендритные клетки, полученные из костного мозга, в 15-миллилитровую центрифужную трубку.После центрифугирования образцов при 290 х г в течение пяти минут выбрасывают супернатант и добавляют четыре миллилитра буфера лизиса эритроцитов, повторно суспендируют и лизируют при комнатной температуре в течение пяти минут. Далее добавляют 10 миллилитров стерильного раствора PBS для нейтрализации лизата, а после центрифугирования при 290 х г в течение пяти минут отбрасывают супернатант. Повторно суспендируют клетки в одном миллилитре DMEM, содержащем 1% раствора пенициллина-стрептомицина и 10% фетальной бычьей сыворотки и количества.Затем добавьте гранулоцитарный макрофаг, стимулирующий колониестимулирующий фактор плюс интерлейкин-4 в среду. Отрегулируйте концентрацию клеток до 5 х 10 до пятого на миллилитр и привите ячейки на крышках. После добавления клеточной суспензии к шестилуночной пластине по два миллилитра на лунку поместите пластину в увлажненный инкубатор при 37 градусах Цельсия с 5% углекислым газом в течение 48 часов.Полностью измените среду через два дня и измените половину среды через четыре дня. Погрузите мышей в 75% алкоголя после эвтаназии и поместите их лицевой стороной вверх в стеклянную чашку Петри в пронумерованном порядке. Пропустите мышей через трансферное окно в стерильную операционную и положите их на операционный стол на пять минут.Используя шприц, аспирировать 10 миллилитров физиологического раствора. Наклоните мышей вниз примерно на 45 градусов и введите в середину брюшной полости. Втяните около пяти миллилитров клеточной суспензии в 15-миллилитровую центрифужную трубку на каждые 10 миллилитров и повторите инъекцию три раза.Центрифугируют клеточную суспензию при 129 х г в течение пяти минут для получения перитонеальных первичных макрофагов мыши. Фибробласты L929 являются полезной моделью скрининга для тестирования токсичности NOD in vitro. Количественная оценка уровней воспалительных цитокинов в селезенке может помочь исследователям лучше понять иммунный ответ.Мониторинг цитотоксических Т-лимфоцитов с помощью иммуноферментного пятна является золотым стандартом для оценки антиген-специфического Т-клеточного иммунитета в клинических испытаниях и для скрининга кандидатов на вакцину. Повышенное поглощение антигена дендритными клетками может вызвать усиленные адаптивные иммунные реакции. Макрофаги играют важную роль в представлении антигенов Т-клеткам, а также в индуцировании других антигенпрезентирующих клеток к экспрессии костимулирующих молекул, тем самым инициируя адаптивные иммунные реакции.Выделение клеток при соотношении действия препарата к клеточному имеет первостепенное значение.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vitro Cellular Activity Evaluation of the Nanoemulsion Vaccine Adjuvant Ophiopogonin D

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Человеческий Т-лимфоцитов изоляции, культуры и анализ миграции In Vitro</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Количественный анализ всех гриппа типа Вирусный Hemagglutinins и нейраминидазы использованием универсального антител в простом Анализы Blot Слот

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

Генерация рекомбинантного ареновирус для разработки вакцины в FDA-Approved клетках Веро

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Всего экстракции белка и 2-D электрофореза в геле Методы<em&gt; Burkholderia</em&gt; Вид

The investigation of  the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to  understanding the pathogenic mechanisms of diseases ...

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Клеточная проточной цитометрии измерить цитотоксическую активность

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

Рестриктазой основе Клонирование метод оценки<em&gt; В пробирке</em&gt; Репликация Емкость ВИЧ-1 подтипа С Gag-MJ4 химерных вирусов

The protective effect of many HLA class I alleles on HIV-1 pathogenesis and disease progression is, in part, attributed to their ability to target ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro анализ MyD88-опосредованной клеточного иммунного ответа на вирус Западного Нила мутантный штамм инфекции

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Оценка хост возбудитель ответы и эффективность вакцины в мышей

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

В Vitro ELISA тест для оценки бешенства вакцины потенции

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...

Intranasal Immunization and Milk Collection in Studies of Maternal Immunization in New Zealand White Rabbits (Oryctolagus cuniculus)

Intranasal Immunization and Milk Collection in Studies of Maternal Immunization in New Zealand White Rabbits Oryctolagus cuniculus

Интраназальная иммунизация и сбор молока в исследованиях материнской иммунизации у новозеландских белых кроликов (Oryctolagus cuniculus)

Due to similarities in placentation and antibody transfer with humans, rabbits are an excellent model of maternal immunization. Additional advantages of ...