Name: in vitro cellular activity evaluation of the nanoemulsion vaccine adjuvant ophiopogonin d
Uploaded: 2022-12-09T13:35:00
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Este estudio fue apoyado por la subvención No. 2021YFC2302603 del Programa Nacional Clave de Investigación y Desarrollo de China, subvenciones No. 31670938, 32070924, 82041045 y 32000651 del Programa de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China, subvenciones No. 2014jcyjA0107 y No. 2019jcyjA-msxmx0159 del Programa de Proyectos de la Fundación de Ciencias Naturales de Chongqing, subvención No. CYS21519 del Proyecto de Investigación e Innovación de Postgrado de Chongqing, subvención No. 2020XBK24 de los proyectos especiales de la Universidad Médica del Ejército, y subvención No. 202090031021 del Programa Nacional de Innovación y Emprendimiento para estudiantes universitarios.

Todos los experimentos celulares se realizaron en un laboratorio de ingeniería celular equipado con quirófanos básicos, salas de amortiguación, salas de cultivo estéril y salas de identificación y análisis. El entorno y las condiciones de trabajo estaban libres de contaminación microbiana y otros factores nocivos. Los experimentos con animales se llevaron a cabo con base en las Directrices para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y fueron aprobados por el Comité de Ética y Bienestar de los Animales de L...

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	<li>Cao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+of+graphene+oxide+as+a+potential+vaccine+carrier+and+adjuvant.">Recent progress of graphene oxide as a potential vaccine carrier and adjuvant.</a> Acta Biomaterials. 112, 14-28 (2020).</li><li>Ko, E. J., Kang, S. 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Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+CpG-adjuvanted+stable+prefusion+SARS-CoV-2+spike+antigen+as+a+subunit+vaccine+against+COVID-19.">Development of CpG-adjuvanted stable prefusion SARS-CoV-2 spike antigen as a subunit vaccine against COVID-19.</a> Scientific Reports. 10, 20085 (2020).</li><li>Twentyman, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interim+recommendation+of+the+Advisory+Committee+on+Immunization+Practices+for+use+of+the+Novavax+COVID-19+vaccine+in+persons+aged+&gt;/=18+years+-+United+States,+July+2022.">Interim recommendation of the Advisory Committee on Immunization Practices for use of the Novavax COVID-19 vaccine in persons aged &gt;/=18 years - United States, July 2022.</a> MMWR Morbidity and Mortality Weekly Report. 71 (31), 988-992 (2022).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+aluminum+adjuvants+eliciting+stronger+immune+response+when+mixed+with+hepatitis+B+virus+surface+antigens.">Improved aluminum adjuvants eliciting stronger immune response when mixed with hepatitis B virus surface antigens.</a> ACS Omega. 7 (38), 34528-34537 (2022).</li><li>Wang, N., Chen, M., Wang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomes+used+as+a+vaccine+adjuvant-delivery+system:+From+basics+to+clinical+immunization.">Liposomes used as a vaccine adjuvant-delivery system: From basics to clinical immunization.</a> Journal of Controlled Release. 303, 130-150 (2019).</li><li>Akin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+safety+and+efficacy+of+Advax(TM)+as+an+adjuvant:+A+systematic+review+and+meta-analysis.">Evaluation of the safety and efficacy of Advax(TM) as an adjuvant: A systematic review and meta-analysis.</a> Advances in Medical Sciences. 67 (1), 10-17 (2022).</li><li>Lacaille-Dubois, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Updated+insights+into+the+mechanism+of+action+and+clinical+profile+of+the+immunoadjuvant+QS-21:+A+review.">Updated insights into the mechanism of action and clinical profile of the immunoadjuvant QS-21: A review.</a> Phytomedicine. 60, 152905 (2019).</li><li>Marty-Roix, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+QS-21+as+an+inflammasome-activating+molecular+component+of+saponin+adjuvants.">Identification of QS-21 as an inflammasome-activating molecular component of saponin adjuvants.</a> The Journal of Biological Chemistry. 291 (3), 1123-1136 (2016).</li><li>Zhang, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ophiopogonin+D+attenuates+doxorubicin-induced+autophagic+cell+death+by+relieving+mitochondrial+damage+in+vitro+and+in+vivo.">Ophiopogonin D attenuates doxorubicin-induced autophagic cell death by relieving mitochondrial damage in vitro and in vivo.</a> The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 352 (1), 166-174 (2015).</li><li>An, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ophiopogonin+D+ameliorates+DNCB-induced+atopic+dermatitis-like+lesions+in+BALB/c+mice+and+TNF-alpha-+inflamed+HaCaT+cell.">Ophiopogonin D ameliorates DNCB-induced atopic dermatitis-like lesions in BALB/c mice and TNF-alpha- inflamed HaCaT cell.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 522 (1), 40-46 (2020).</li><li>Song, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+polysaccharide+from+Ophiopogon+japonicus+on+immune+response+to+Newcastle+disease+vaccine+in+chicken.">Effects of polysaccharide from Ophiopogon japonicus on immune response to Newcastle disease vaccine in chicken.</a> Pesquisa Veterin&#225;ria Brasileira. 36 (12), 1155-1159 (2016).</li><li>Tong, Y. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+metabolomic+and+lipidomic+analysis+reveals+the+potential+mechanisms+of+hemolysis+effect+of+ophiopogonin+D+and+ophiopogonin+D'+in+vivo.">Global metabolomic and lipidomic analysis reveals the potential mechanisms of hemolysis effect of ophiopogonin D and ophiopogonin D' in vivo.</a> Chinese Medicine. 16 (1), 3 (2021).</li><li>Drane, D., Gittleson, C., Boyle, J., Maraskovsky, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISCOMATRIX+adjuvant+for+prophylactic+and+therapeutic+vaccines.">ISCOMATRIX adjuvant for prophylactic and therapeutic vaccines.</a> Expert Review of Vaccines. 6 (5), 761-772 (2007).</li><li>Rudolf, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microstructure+characterisation+and+identification+of+the+mechanical+and+functional+properties+of+a+new+PMMA-ZnO+composite.">Microstructure characterisation and identification of the mechanical and functional properties of a new PMMA-ZnO composite.</a> Materials. 13 (12), 2717 (2020).</li><li>Cannella, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxicity+evaluation+of+endodontic+pins+on+L929+cell+line.">Cytotoxicity evaluation of endodontic pins on L929 cell line.</a> BioMed Research International. 2019, 3469525 (2019).</li><li>Jiao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+MTT+and+CCK-8+assay+for+evaluation+of+graphene+cytotoxicity.">Limitations of MTT and CCK-8 assay for evaluation of graphene cytotoxicity.</a> RSC Advances. 5 (66), 53240-53244 (2015).</li><li>Ghasemi, M., Turnbull, T., Sebastian, S., Kempson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MTT+assay:+Utility,+limitations,+pitfalls,+and+interpretation+in+bulk+and+single-cell+analysis.">The MTT assay: Utility, limitations, pitfalls, and interpretation in bulk and single-cell analysis.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 12827 (2021).</li><li>Li, W., Zhou, J., Xu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+the+in+vitro+cytotoxicity+testing+of+medical+devices.">Study of the in vitro cytotoxicity testing of medical devices.</a> Biomedical Reports. 3 (5), 617-620 (2015).</li><li>Wu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+elevated+inflammatory+cytokines+of+spleen+and+spleen+index+in+acute+spinal+cord+injury.">Correlation between elevated inflammatory cytokines of spleen and spleen index in acute spinal cord injury.</a> Journal of Neuroimmunology. 344, 577264 (2020).</li><li>Lewis, S. M., Williams, A., Eisenbarth, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+the+immune+system+in+the+spleen.">Structure and function of the immune system in the spleen.</a> Science Immunology. 4 (33), (2019).</li><li>Cox, J. H., Ferrari, G., Janetzki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+cytokine+release+at+the+single+cell+level+using+the+ELISPOT+assay.">Measurement of cytokine release at the single cell level using the ELISPOT assay.</a> Methods. 38 (4), 274-282 (2006).</li><li>Elliott, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+microscopy:+Principles+and+modern+practices.">Confocal microscopy: Principles and modern practices.</a> Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68 (2020).</li><li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4(+)+T+cell+activation+and+inflammation+in+NASH-related+fibrosis.">CD4(+) T cell activation and inflammation in NASH-related fibrosis.</a> Frontiers in Immunology. 13, 967410 (2022).</li><li>Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+activation+and+polarization.">Macrophage activation and polarization.</a> Frontiers in Bioscience. 13, 453-461 (2008).</li><li>Quesniaux, V., Erard, F., Ryffel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adjuvant+activity+on+murine+and+human+macrophages.">Adjuvant activity on murine and human macrophages.</a> Methods in Molecular Biology. 626, 117-130 (2010).</li></ol>

Las vacunas de subunidades proporcionan una excelente seguridad pero una inmunogenicidad deficiente. La estrategia principal para mejorar la inmunogenicidad es adsorber físicamente o acoplar antígenos con adyuvantes e incorporarlos a los sistemas de administración de fármacos para promover la absorción y presentación por parte de las DC. Las saponinas vegetales naturales como la saponina quillaia y sus derivados son altamente tóxicas y no son adecuadas para el desarrollo de vacunas humanas17</sup...

Las vacunas son un medio importante para prevenir y tratar las enfermedades infecciosas y no transmisibles. La adición adecuada de adyuvantes y vehículos de administración a las formulaciones de vacunas es beneficiosa para mejorar la inmunogenicidad de los antígenos y generar respuestas inmunes duraderas1. Además del alumbre adyuvante clásico (sal de aluminio), hay seis tipos de adyuvantes para vacunas que se comercializan actualmente: MF592,3, AS04 3, AS03 3, AS01 3, CpG10184 y Matrix-M5. Generalmente, cuando el cuerpo humano se encuentra con un ataque viral, la primera y segunda línea de defensa (piel, mucosa y macrófagos) toman la delantera en la eliminación del virus, y finalmente, se activa la tercera línea de defensa, que involucra los órganos inmunes y las células inmunes. El aluminio y las sales de aluminio han sido los adyuvantes más utilizados para las vacunas humanas desde principios de la década de 1920, provocando una respuesta inmune innata efectiva6. Sin embargo, se ha propuesto que la activación de las células presentadoras de antígeno (APC) por adyuvantes clásicos, que estimula a las células inmunes para generar conjuntos específicos de citoquinas y quimiocinas, es el mecanismo por el cual funcionan los adyuvantes y puede ser una de las razones por las cuales los adyuvantes ejercen solo efectos transitorios sobre respuestas inmunes específicas7. La presencia de adyuvantes autorizados limitados para uso humano es un factor restrictivo para el desarrollo de vacunas que provoquen respuestas inmunes efectivas8.
Actualmente, un número creciente de estudios adyuvantes están demostrando la capacidad de inducir una fuerte respuesta inmune celular en ratones. Se ha demostrado que QS-21 induce una respuesta inmune equilibrada de T-helper 1 (Th1) y T-helper 2 (Th2), produce niveles más altos de títulos de anticuerpos y prolonga la protección como adyuvante, pero su fuerte toxicidad y propiedades hemolíticas limitan su desarrollo como adyuvante clínico independiente 9,10. OP-D (ruscogenina-O-α-L-ramnopiranosia1-(1→2)-β-D-xilopiranosil-(1→3)-β-D-fucopiranósido) es una de las saponinas esteroides aisladas de la raíz de la planta medicinal china Ophiopogon japonicas4. Además, es el principal componente farmacológicamente activo (Shen Mai San) que se encuentra en Radix Ophiopogonis y se sabe que tiene ciertas propiedades farmacológicas11. Además, es un miembro de la familia Liliaceae y es ampliamente utilizado por sus efectos inhibitorios y protectores en la inflamación celular y la lesión miocárdica. Por ejemplo, OP-D mejora las lesiones similares a la dermatitis atópica inducida por DNCB y las células inflamatorias HaCaT del factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) en ratones BALB/c12. Es importante destacar que OP-D promueve la protección antioxidante del sistema cardiovascular y protege el corazón contra la lesión autofágica inducida por doxorrubicina al reducir la generación de especies reactivas de oxígeno e interrumpir el daño de la membrana mitocondrial. Los experimentos han demostrado que tomar OP-D con monodesósido ayuda a mejorar la salud inmunológica, aumentar el recuento de glóbulos blancos y la síntesis de ADN, y hacer que los anticuerpos duren más13. Anteriormente se ha encontrado que la OP-D tiene un efecto adyuvante14.
Las nanoemulsiones son nanoformulaciones de aceite en agua compuestas por una combinación de tensioactivos, aceite, cosurfactantes y agua12,15. Estos diseños de nanovacunas permiten encapsular antígenos y adyuvantes juntos para mejorar la estimulación inmune, proteger los antígenos y promover la maduración de las células dendríticas (DC)16. Para el desarrollo de estos nuevos adyuvantes obtenidos del cribado, es importante encontrar métodos apropiados para evaluar sus capacidades de respuesta celular.
El propósito de este protocolo es evaluar sistemáticamente si los adyuvantes pueden mejorar la fagocitosis y la expresión de células inmunes en cultivo celular in vitro y elaborar los principales métodos experimentales. El experimento se divide en cuatro subsecciones: (1) la toxicidad de OP-D y NOD para las células L929 se determina mediante el ensayo del kit de conteo de células-8 (CCK-8); (2) los niveles de citoquinas de IFN-γ endocrino e IL-17A y el número de células correspondiente en ratones inmunizados se detectan mediante estimulación de esplenocitos y ensayos ELISpot; (3) la capacidad de presentación de antígenos de las CD después de la estimulación adyuvante se observa mediante microscopía confocal; y (4) se detectan los tres tipos de citocinas, IL-1β, IL-6 y TNF-α, en los sobrenadantes obtenidos de macrófagos peritoneales (PM) en ratones normales cocultivados con adyuvantes.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA (1x)</td>
			<td>GIBCO, USA</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well filter plates</td>
			<td>Millipore. Billerica, MA</td>
			<td>CLS3922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlPO4</td>
			<td>General Chemical Company, USA</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated Cell Counter</td>
			<td>Countstar, China</td>
			<td>IC1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/c mice and C57BL/6 mice</td>
			<td>Beijing HFK Bioscience Co. Ltd</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>caprylic/capric triglyceride (GTCC)</td>
			<td>Beijing Fengli Pharmaceutical Co. Ltd., Beijing, China</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCK-8 kits</td>
			<td>Dojindo, Japan</td>
			<td>CK04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counting Plate</td>
			<td>Costar, Corning, USA</td>
			<td>CO010101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Sieve</td>
			<td>biosharp, China</td>
			<td>BS-70-CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810 R</td>
			<td>Eppendorf, Germany&#160;</td>
			<td>5811000398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM basic(1x) medium</td>
			<td>GIBCO, USA</td>
			<td>C11885500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSZ5000X Inverted Microscope</td>
			<td>Nikon,Japan</td>
			<td>DSZ5000X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EL-35 (Cremophor-35)</td>
			<td>Mumbai, India</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISpot classic</td>
			<td>AID, Germany</td>
			<td>ELR06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>GIBCO, USA</td>
			<td>10099141C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Full-function Microplate Reader</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>VL0000D2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>P42212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Granulocyte Macrophage Colony-Stimulating Factor</td>
			<td>GM-CSF, R&#38;D Systems, USA</td>
			<td>315-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>15630106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HF 90/240 Incubator</td>
			<td>Heal Force, Switzerland</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-4</td>
			<td>PeproTech, USA</td>
			<td>042149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L929 cell line</td>
			<td>FENGHUISHENGWU, China</td>
			<td>&#160;NCTC clone 929 (RRID:CVCL_0462)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Scanning Confocal Microscopy</td>
			<td>Zeiss, Germany</td>
			<td>LSM 980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MONTANE 85 PPI</td>
			<td>SEPPIC, France</td>
			<td>L12910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MONTANOX 80 PPI</td>
			<td>SEPPIC, France</td>
			<td>36372K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IFN-&#947; ELISA kit</td>
			<td>Dakewe, China</td>
			<td>1210002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IFN-&#947; precoated ELISPOT kit</td>
			<td>Dakewe, China</td>
			<td>DKW22-2000-096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-17A ELISA kit</td>
			<td>Dakewe, China</td>
			<td>1211702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-17A ELISpotPLUS Kit</td>
			<td>ebiosciences, USA</td>
			<td>3521-4HPW-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-1&#946; ELISA kit</td>
			<td>Dakewe, China</td>
			<td>1210122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-6 ELISA kit</td>
			<td>Dakewe, China</td>
			<td>1210602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse TNF-&#945; ELISA kit</td>
			<td>Dakewe, China</td>
			<td>1217202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids(100x)</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophiopogonin-D</td>
			<td>Chengdu Purui Technology Co. Ltd</td>
			<td>945619-74-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin</td>
			<td>Solarbio, China</td>
			<td>CA1620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>ZSGB-BIO, China</td>
			<td>ZLI-9062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td>Solarbio, China</td>
			<td>R1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium</td>
			<td>Hyclone (Life Technology), USA</td>
			<td>SH30809.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate(100 mM)</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Squalene</td>
			<td>Sigma, USA</td>
			<td>S3626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;- Mercaptoethanol</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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in vitro cellular activity evaluation of the nanoemulsion vaccine adjuvant ophiopogonin d

Como ingrediente principal de las vacunas, los adyuvantes pueden inducir o mejorar directamente las respuestas inmunes potentes, generalizadas, innatas y adaptativas asociadas con los antígenos. Se ha encontrado que la ofiopogonina D (OP-D), un componente purificado extraído de la planta Ophiopogon japonicus, es útil como adyuvante de la vacuna. Los problemas de la baja solubilidad y toxicidad de OP-D se pueden superar eficazmente mediante el uso de un método de emulsificación de baja energía para preparar la nanoemulsión de ofiopogonina D (NOD). En este artículo, se examinan una serie de protocolos in vitro para la evaluación de la actividad celular. Los efectos citotóxicos de L929 se determinaron mediante un ensayo de kit de conteo celular-8. Luego, los niveles de citoquinas secretadas y el número de células inmunes correspondientes después de la estimulación y el cultivo de esplenocitos de ratones inmunizados se detectaron mediante métodos ELISA y ELISpot. Además, la capacidad de absorción de antígenos en células dendríticas derivadas de médula ósea (BMDC), que se aislaron de ratones C57BL / 6 y maduraron después de la incubación con GM-CSF más IL-4, se observó mediante microscopía confocal de barrido láser (CLSM). Es importante destacar que la activación de los macrófagos se confirmó midiendo los niveles de IL-1β, IL-6 y citoquinas del factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) mediante kits ELISA después de cocultivar macrófagos peritoneales (PM) de ratones en blanco con el adyuvante durante 24 h. Se espera que este protocolo proporcione a otros investigadores enfoques experimentales directos y efectivos para evaluar la eficacia de la respuesta celular de los nuevos adyuvantes de vacunas.

La evaluación de la actividad celular de los adyuvantes OP-D y NOD se completó in vitro de acuerdo con el protocolo. Los fibroblastos L929 son un modelo de cribado útil para los ensayos de toxicidad in vitro de la NOD (Figura 1). La cuantificación de los niveles de citoquinas inflamatorias en el bazo puede ayudar a los investigadores a comprender mejor la respuesta inmune (Figura 2). La monitorización de CTL con ELISpot es el estándar de ...

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In Vitro Cellular Activity Evaluation of the Nanoemulsion Vaccine Adjuvant Ophiopogonin D

El protocolo presenta métodos detallados para evaluar si el adyuvante de bioemulsión ofiopogonina D promueve respuestas inmunes celulares efectivas.

In vitro Evaluación de la actividad celular del adyuvante de la vacuna de nanoemulsión Ophiopogonin D

As a principal ingredient of vaccines, adjuvants can directly induce or enhance the powerful, widespread, innate, and adaptive immune responses associated ...

Este protocolo puede proporcionar a otros investigadores enfoques experimentales directos y efectivos y los pasos detallados para evaluar la eficacia de la respuesta celular de los nuevos adyuvantes de vacunas. No solo puede proporcionar a los investigadores métodos específicos de evaluación celular para adyuvantes, sino que también puede descomponer métodos de extracción como la enfermedad BM. Estos protocolos no solo demuestran que no hay toxicidad y una alta entrega celular, sino que también proporcionan procedimientos detallados para el campo de evaluación adyuvante.Para comenzar, encienda el baño de agua y ajuste la temperatura a 37 grados centígrados. Luego, después de recolectar un tubo de células L929 congeladas de nitrógeno líquido, descongele rápidamente en el baño de agua. Después de pipetear las células en un tubo de centrífuga estéril de 15 mililitros, agregue dos mililitros de DMEM y mezcle bien.Centrifugar las muestras a 129 x g durante cinco minutos. Y después de desechar el sobrenadante, agregue dos mililitros de DMEM para resuspender las células. Centrifugar las muestras de nuevo.Y después de desechar el sobrenadante, agregue seis mililitros de medio completo DMEM para la resuspensión, y transfiera a un matraz de cultivo de T25 centímetros cuadrados en una incubadora de 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono para cultivar durante 48 horas. El día 24 después de la inmunización primaria, retire los ratones de la habitación del animal, colóquelos en un plato de vidrio y sumérjalos en alcohol al 75% durante cinco minutos. Coloque los tubos de la centrífuga en una rejilla para tubos de centrífuga, numere las placas de Petri desechables y agregue cinco mililitros de PBS a cada placa de Petri con una pipeta de 10 mililitros.Haga una incisión de seis a ocho centímetros con tijeras en el centro del lado ventral izquierdo del ratón. Abra la piel para exponer la pared abdominal y localizar la larga franja roja del bazo. Luego, levante el peritoneo en el lado inferior del bazo con fórceps.Ábrelo y gíralo hacia arriba para exponer el bazo. Levante el bazo con fórceps. Separe el tejido conectivo debajo del bazo con tijeras oftálmicas y retire el bazo.Coloque el bazo en una placa de Petri que contenga cinco mililitros de PBS y muele con un tamiz y un émbolo de jeringa. Después de moler, transfiera el líquido a un tubo de centrífuga de 15 mililitros con una pipeta de acuerdo con la numeración. A continuación, centrifugar el líquido a 453 x g durante cinco minutos.Y después de desechar el sobrenadante, agregue tres mililitros de tampón de lisis de glóbulos rojos a cada tubo. Resuspender las células y lisar a temperatura ambiente durante 10 minutos. Luego agregue de 10 a 12 mililitros de PBS a cada tubo.Y después de mezclar y centrifugar a 453 x g durante cinco minutos, deseche el sobrenadante y agregue 10 mililitros de PBS a cada tubo de centrífuga y resuspenda las celdas. Tome 20 microlitros de cada muestra en un pocillo de la placa de conteo de células y registre el número de células vivas utilizando un contador de células automatizado. A continuación, centrifugar las muestras a 453 x g durante cinco minutos.Y después de desechar el sobrenadante, diluir a 2.5 x 10 a la sexta celdas por mililitro con medio RF10 y agregar a una placa de 96 pocillos a 100 microlitros por pozo. Corte una incisión de seis a ocho centímetros debajo del abdomen del ratón con tijeras y sujete los dos extremos de la abertura para separarla en diferentes direcciones y exponer las patas del ratón. Separe el fémur del ratón del cuerpo del ratón y la tibia de la articulación.Y mantenga los huesos intactos en ambos extremos. A continuación, retire el tejido residual y el cartílago de las articulaciones articulares en ambos extremos del fémur con tijeras y fórceps. Remoje los fémures en alcohol al 75% durante cinco minutos y luego sumerja en una solución estéril de PBS para lavar el alcohol de la superficie.Luego corte los extremos de los fémures con tijeras y enjuague la médula ósea en una placa de Petri estéril con solución estéril de PBS, seguida de aspiración con una jeringa de un mililitro. Repita el lavado de tres a cinco veces. A continuación, filtre mediante un tamiz celular y recoja las células dendríticas derivadas de la médula ósea en un tubo de centrífuga de 15 mililitros.Después de centrifugar las muestras a 290 x g durante cinco minutos, deseche el sobrenadante y agregue cuatro mililitros de tampón de lisis de glóbulos rojos, resuspenda y lise a temperatura ambiente durante cinco minutos. A continuación, agregue 10 mililitros de solución estéril de PBS para neutralizar el lisado, y después de centrifugar a 290 x g durante cinco minutos, deseche el sobrenadante. Resuspender las células en un mililitro de DMEM que contenga 1% de solución de penicilina-estreptomicina y 10% de suero bovino fetal y recuento.Luego agregue el factor estimulante de colonias de granulocitos macrófagos más interleucina-4 al medio. Ajuste la concentración celular a 5 x 10 al quinto por mililitro e inocule las células en cubreobjetos. Después de agregar la suspensión celular a una placa de seis pocillos a dos mililitros por pozo, coloque la placa en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono durante 48 horas.Cambie el medio completamente después de dos días y cambie la mitad del medio después de cuatro días. Sumerja los ratones en alcohol al 75% después de la eutanasia y colóquelos boca arriba en una placa de Petri de vidrio en orden numerado. Pase los ratones a través de la ventana de transferencia a la sala de operaciones estéril y colóquelos en la mesa de operaciones durante cinco minutos.Usando la jeringa, aspire 10 mililitros de solución salina. Incline los ratones hacia abajo a aproximadamente 45 grados e inyecte en el centro de la cavidad abdominal. Extraiga aproximadamente cinco mililitros de suspensión celular en un tubo de centrífuga de 15 mililitros por cada 10 mililitros y repita la inyección tres veces.Centrifugar la suspensión celular a 129 x g durante cinco minutos para obtener macrófagos primarios peritoneales de ratón. Los fibroblastos L929 son un modelo de cribado útil para las pruebas de toxicidad in vitro de NOD. La cuantificación de los niveles de citoquinas inflamatorias en el bazo puede ayudar a los investigadores a comprender mejor la respuesta inmune.La monitorización de linfocitos T citotóxicos con inmunospot ligado a enzimas es el estándar de oro para evaluar la inmunidad de las células T específicas del antígeno en ensayos clínicos y para detectar vacunas candidatas. El aumento de la captación de un antígeno por las células dendríticas puede provocar respuestas inmunes adaptativas mejoradas. Los macrófagos desempeñan un papel importante en la presentación de antígenos a las células T, así como en la inducción de otras células presentadoras de antígenos para expresar moléculas coestimuladoras, iniciando así respuestas inmunes adaptativas.El aislamiento de las células bajo la proporción de fármaco a la acción celular es de suma importancia.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vitro Cellular Activity Evaluation of the Nanoemulsion Vaccine Adjuvant Ophiopogonin D

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Aislamiento de linfocitos T humanos, cultura y análisis de la migración In Vitro</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

Investigación

Inmunología e Infección

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

El análisis cuantitativo de todos Influenza Tipo A Hemaglutininas viral y neuraminidasas el uso de anticuerpos Universal en simples ensayos Slot Blot

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

Generación de Arenavirus recombinante para el Desarrollo de Vacunas de la FDA aprobados células Vero

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

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Extracción de proteínas totales y 2-D Métodos gel de electroforesis para<em&gt; Burkholderia</em&gt; Especies

The investigation of  the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to  understanding the pathogenic mechanisms of diseases ...

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A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

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Una enzima de restricción método basado clonación para evaluar la<em&gt; In vitro</em&gt; Capacidad de replicación del VIH-1 subtipo C Gag-MJ4 quiméricos virus

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In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

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Intranasal Immunization and Milk Collection in Studies of Maternal Immunization in New Zealand White Rabbits (Oryctolagus cuniculus)

Intranasal Immunization and Milk Collection in Studies of Maternal Immunization in New Zealand White Rabbits Oryctolagus cuniculus

Inmunización intranasal y recolección de leche en estudios de inmunización materna en conejos blancos de Nueva Zelanda (Oryctolagus cuniculus)

Due to similarities in placentation and antibody transfer with humans, rabbits are an excellent model of maternal immunization. Additional advantages of ...