Name: in vitro cellular activity evaluation of the nanoemulsion vaccine adjuvant ophiopogonin d
Uploaded: 2022-12-09T13:35:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Cellular Activity Evaluation of the Nanoemulsion Vaccine Adjuvant Ophiopogonin D at JoVE.com

Denna studie stöddes av bidrag nr 2021YFC2302603 från Kinas nationella nyckelforsknings- och utvecklingsprogram, bidrag nr 31670938, 32070924, 82041045 och 32000651 från National Natural Science Foundation Program of China, bidrag nr 2014jcyjA0107 och nr 2019jcyjA-msxmx0159 från Natural Science Foundation Project Program of Chongqing, bidrag nr CYS21519 för forskarutbildningsprojektet i Chongqing, bidrag nr 2020XBK24 från Army Medical University Special-projekt och bidrag nr 202090031021 för National Innovation and Entrepreneurship Program för studenter.

Alla cellexperiment utfördes i ett celltekniskt laboratorium utrustat med grundläggande operationssalar, buffertrum, sterila odlingsrum och identifierings- och analysrum. Arbetsmiljön och förhållandena var fria från mikrobiell kontaminering och andra skadliga faktorer. Djurförsöken utfördes utifrån riktlinjerna för vård och användning av försöksdjur och godkändes av laboratoriedjurens djurskydds- och etikkommitté vid det tredje militärmedicinska universitetet.
1. Autokl...

<ol>
	<li>Cao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+of+graphene+oxide+as+a+potential+vaccine+carrier+and+adjuvant.">Recent progress of graphene oxide as a potential vaccine carrier and adjuvant.</a> Acta Biomaterials. 112, 14-28 (2020).</li><li>Ko, E. J., Kang, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunology+and+efficacy+of+MF59-adjuvanted+vaccines.">Immunology and efficacy of MF59-adjuvanted vaccines.</a> Human Vaccines &amp; Immunotherapeutics. 14 (12), 3041-3045 (2018).</li><li>Shi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccine+adjuvants:+Understanding+the+structure+and+mechanism+of+adjuvanticity.">Vaccine adjuvants: Understanding the structure and mechanism of adjuvanticity.</a> Vaccine. 37 (24), 3167-3178 (2019).</li><li>Kuo, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+CpG-adjuvanted+stable+prefusion+SARS-CoV-2+spike+antigen+as+a+subunit+vaccine+against+COVID-19.">Development of CpG-adjuvanted stable prefusion SARS-CoV-2 spike antigen as a subunit vaccine against COVID-19.</a> Scientific Reports. 10, 20085 (2020).</li><li>Twentyman, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interim+recommendation+of+the+Advisory+Committee+on+Immunization+Practices+for+use+of+the+Novavax+COVID-19+vaccine+in+persons+aged+&gt;/=18+years+-+United+States,+July+2022.">Interim recommendation of the Advisory Committee on Immunization Practices for use of the Novavax COVID-19 vaccine in persons aged &gt;/=18 years - United States, July 2022.</a> MMWR Morbidity and Mortality Weekly Report. 71 (31), 988-992 (2022).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+aluminum+adjuvants+eliciting+stronger+immune+response+when+mixed+with+hepatitis+B+virus+surface+antigens.">Improved aluminum adjuvants eliciting stronger immune response when mixed with hepatitis B virus surface antigens.</a> ACS Omega. 7 (38), 34528-34537 (2022).</li><li>Wang, N., Chen, M., Wang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomes+used+as+a+vaccine+adjuvant-delivery+system:+From+basics+to+clinical+immunization.">Liposomes used as a vaccine adjuvant-delivery system: From basics to clinical immunization.</a> Journal of Controlled Release. 303, 130-150 (2019).</li><li>Akin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+safety+and+efficacy+of+Advax(TM)+as+an+adjuvant:+A+systematic+review+and+meta-analysis.">Evaluation of the safety and efficacy of Advax(TM) as an adjuvant: A systematic review and meta-analysis.</a> Advances in Medical Sciences. 67 (1), 10-17 (2022).</li><li>Lacaille-Dubois, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Updated+insights+into+the+mechanism+of+action+and+clinical+profile+of+the+immunoadjuvant+QS-21:+A+review.">Updated insights into the mechanism of action and clinical profile of the immunoadjuvant QS-21: A review.</a> Phytomedicine. 60, 152905 (2019).</li><li>Marty-Roix, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+QS-21+as+an+inflammasome-activating+molecular+component+of+saponin+adjuvants.">Identification of QS-21 as an inflammasome-activating molecular component of saponin adjuvants.</a> The Journal of Biological Chemistry. 291 (3), 1123-1136 (2016).</li><li>Zhang, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ophiopogonin+D+attenuates+doxorubicin-induced+autophagic+cell+death+by+relieving+mitochondrial+damage+in+vitro+and+in+vivo.">Ophiopogonin D attenuates doxorubicin-induced autophagic cell death by relieving mitochondrial damage in vitro and in vivo.</a> The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 352 (1), 166-174 (2015).</li><li>An, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ophiopogonin+D+ameliorates+DNCB-induced+atopic+dermatitis-like+lesions+in+BALB/c+mice+and+TNF-alpha-+inflamed+HaCaT+cell.">Ophiopogonin D ameliorates DNCB-induced atopic dermatitis-like lesions in BALB/c mice and TNF-alpha- inflamed HaCaT cell.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 522 (1), 40-46 (2020).</li><li>Song, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+polysaccharide+from+Ophiopogon+japonicus+on+immune+response+to+Newcastle+disease+vaccine+in+chicken.">Effects of polysaccharide from Ophiopogon japonicus on immune response to Newcastle disease vaccine in chicken.</a> Pesquisa Veterin&#225;ria Brasileira. 36 (12), 1155-1159 (2016).</li><li>Tong, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immunopotentiator,+ophiopogonin+D,+encapsulated+in+a+nanoemulsion+as+a+robust+adjuvant+to+improve+vaccine+efficacy.">An immunopotentiator, ophiopogonin D, encapsulated in a nanoemulsion as a robust adjuvant to improve vaccine efficacy.</a> Acta Biomaterialia. 77, 255-267 (2018).</li><li>Lin, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronic+acid-glycine-cholesterol+conjugate-based+nanoemulsion+as+a+potent+vaccine+adjuvant+for+T+cell-mediated+immunity.">Hyaluronic acid-glycine-cholesterol conjugate-based nanoemulsion as a potent vaccine adjuvant for T cell-mediated immunity.</a> Pharmaceutics. 13 (10), 1569 (2021).</li><li>Xu, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+metabolomic+and+lipidomic+analysis+reveals+the+potential+mechanisms+of+hemolysis+effect+of+ophiopogonin+D+and+ophiopogonin+D'+in+vivo.">Global metabolomic and lipidomic analysis reveals the potential mechanisms of hemolysis effect of ophiopogonin D and ophiopogonin D' in vivo.</a> Chinese Medicine. 16 (1), 3 (2021).</li><li>Drane, D., Gittleson, C., Boyle, J., Maraskovsky, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISCOMATRIX+adjuvant+for+prophylactic+and+therapeutic+vaccines.">ISCOMATRIX adjuvant for prophylactic and therapeutic vaccines.</a> Expert Review of Vaccines. 6 (5), 761-772 (2007).</li><li>Rudolf, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microstructure+characterisation+and+identification+of+the+mechanical+and+functional+properties+of+a+new+PMMA-ZnO+composite.">Microstructure characterisation and identification of the mechanical and functional properties of a new PMMA-ZnO composite.</a> Materials. 13 (12), 2717 (2020).</li><li>Cannella, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxicity+evaluation+of+endodontic+pins+on+L929+cell+line.">Cytotoxicity evaluation of endodontic pins on L929 cell line.</a> BioMed Research International. 2019, 3469525 (2019).</li><li>Jiao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+MTT+and+CCK-8+assay+for+evaluation+of+graphene+cytotoxicity.">Limitations of MTT and CCK-8 assay for evaluation of graphene cytotoxicity.</a> RSC Advances. 5 (66), 53240-53244 (2015).</li><li>Ghasemi, M., Turnbull, T., Sebastian, S., Kempson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MTT+assay:+Utility,+limitations,+pitfalls,+and+interpretation+in+bulk+and+single-cell+analysis.">The MTT assay: Utility, limitations, pitfalls, and interpretation in bulk and single-cell analysis.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 12827 (2021).</li><li>Li, W., Zhou, J., Xu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+the+in+vitro+cytotoxicity+testing+of+medical+devices.">Study of the in vitro cytotoxicity testing of medical devices.</a> Biomedical Reports. 3 (5), 617-620 (2015).</li><li>Wu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+elevated+inflammatory+cytokines+of+spleen+and+spleen+index+in+acute+spinal+cord+injury.">Correlation between elevated inflammatory cytokines of spleen and spleen index in acute spinal cord injury.</a> Journal of Neuroimmunology. 344, 577264 (2020).</li><li>Lewis, S. M., Williams, A., Eisenbarth, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+the+immune+system+in+the+spleen.">Structure and function of the immune system in the spleen.</a> Science Immunology. 4 (33), (2019).</li><li>Cox, J. H., Ferrari, G., Janetzki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+cytokine+release+at+the+single+cell+level+using+the+ELISPOT+assay.">Measurement of cytokine release at the single cell level using the ELISPOT assay.</a> Methods. 38 (4), 274-282 (2006).</li><li>Elliott, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+microscopy:+Principles+and+modern+practices.">Confocal microscopy: Principles and modern practices.</a> Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68 (2020).</li><li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4(+)+T+cell+activation+and+inflammation+in+NASH-related+fibrosis.">CD4(+) T cell activation and inflammation in NASH-related fibrosis.</a> Frontiers in Immunology. 13, 967410 (2022).</li><li>Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+activation+and+polarization.">Macrophage activation and polarization.</a> Frontiers in Bioscience. 13, 453-461 (2008).</li><li>Quesniaux, V., Erard, F., Ryffel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adjuvant+activity+on+murine+and+human+macrophages.">Adjuvant activity on murine and human macrophages.</a> Methods in Molecular Biology. 626, 117-130 (2010).</li></ol>

Subenhetsvacciner ger utmärkt säkerhet men dålig immunogenicitet. Huvudstrategin för att förbättra immunogeniciteten är att fysiskt adsorbera eller koppla antigener med adjuvanser och införliva dem i läkemedelsleveranssystemen för att främja upptag och presentation av DCs. Naturliga växtsaponiner som quillaia saponin och dess derivat är mycket giftiga och är inte lämpliga för utveckling av humanvacciner17. Därför är studien av de toxiska effekterna av vacciner eller adjuvanser p...

Vacciner är ett viktigt sätt att förebygga och behandla smittsamma och icke-överförbara sjukdomar. Lämplig tillsats av adjuvanser och leveransfordon till vaccinformuleringar är fördelaktigt för att förbättra antigenernas immunogenicitet och generera långvariga immunsvar1. Förutom den klassiska adjuvansalun (aluminiumsalt) finns det sex typer av adjuvanser för vacciner som för närvarande marknadsförs: MF592,3, AS04 3, AS03 3, AS01 3, CpG10184 och Matrix-M5. I allmänhet, när människokroppen stöter på en viral attack, tar den första och andra försvarslinjen (hud, slemhinna och makrofager) ledningen för att rensa viruset, och slutligen aktiveras den tredje försvarslinjen, som involverar immunorganen och immuncellerna. Aluminium- och aluminiumsalter har varit de mest använda adjuvanserna för humana vacciner sedan början av 1920-talet, vilket framkallar ett effektivt medfött immunsvar6. Det har emellertid föreslagits att aktiveringen av antigenpresenterande celler (APC) av klassiska adjuvanser, som stimulerar immuncellerna att generera specifika uppsättningar cytokiner och kemokiner, är den mekanism genom vilken adjuvanser fungerar och kan vara en av anledningarna till att adjuvanser endast utövar övergående effekter på specifika immunsvar7. Förekomsten av begränsade licensierade adjuvanser för humant bruk är en begränsande faktor för att utveckla vacciner som framkallar effektiva immunsvar8.
För närvarande visar ett ökande antal adjuvansstudier förmågan att inducera ett starkt cellulärt immunsvar hos möss. QS-21 har visat sig inducera ett balanserat T-hjälparsvar 1 (Th1) och T-hjälpare 2 (Th2), producera högre nivåer av antikroppstitrar och förlänga skyddet som ett adjuvans, men dess starka toxicitet och hemolytiska egenskaper begränsar dess utveckling som ett fristående kliniskt adjuvans 9,10. OP-D (ruscogenin-O-α-L-rhamnopyranosy1-(1→2)-β-D-xylopyranosyl-(1→3)-β-D-fucopyranoside) är en av de steroida saponinerna isolerade från roten till den kinesiska medicinalväxten Ophiopogon japonicas4. Dessutom är det den främsta farmakologiskt aktiva komponenten (Shen Mai San) som finns i Radix Ophiopogonis och är känd för att ha vissa farmakologiska egenskaper11. Dessutom är det en medlem av familjen Liliaceae och används i stor utsträckning för dess hämmande och skyddande effekter vid cellulär inflammation och hjärtskada. Till exempel förbättrar OP-D DNCB-inducerade atopiska dermatitliknande lesioner och tumörnekrosfaktor alfa (TNF-α) inflammatoriska HaCaT-celler i BALB / c-möss12. Viktigt är att OP-D främjar det antioxidativa skyddet av hjärt-kärlsystemet och skyddar hjärtat mot doxorubicininducerad autofagisk skada genom att minska både reaktiv syreartgenerering och störa mitokondriell membranskada. Experiment har visat att intag av OP-D med mono-desmoside hjälper till att öka immunförsvaret, öka antalet vita blodkroppar och DNA-syntesen och få antikroppar att hålla längre13. Det har tidigare visat sig att OP-D har en adjuvanseffekt14.
Nanoemulsioner är olja-i-vatten-nanoformuleringar som består av en kombination av ytaktiva ämnen, olja, samsurfakter och vatten12,15. Dessa nanovaccindesigner gör att antigener och adjuvanser kan kapslas in tillsammans för att förbättra immunstimulering, skydda antigenerna och främja mognad av dendritiska celler (DC)16. För utveckling av dessa nya adjuvanser erhållna från screening är det viktigt att hitta lämpliga metoder för att utvärdera deras cellulära svarsförmåga.
Syftet med detta protokoll är att systematiskt utvärdera om adjuvanser kan förbättra fagocytos och uttrycket av immunceller i in vitro-cellodling och att utarbeta de viktigaste experimentella metoderna. Experimentet är indelat i fyra underavsnitt: (1) toxiciteten hos OP-D och NOD för L929-celler bestäms av cellräkningssats-8 (CCK-8) -analysen; (2) cytokinnivåerna av endokrina IFN-γ och IL-17A och motsvarande cellnummer hos immuniserade möss detekteras genom splenocytstimulering och ELISpot-analyser; (3) DCs antigenpresentationsförmåga efter adjuvansstimulering observeras med konfokalmikroskopi; och (4) de tre typerna av cytokiner, IL-1β, IL-6 och TNF-α, i supernatanterna erhållna från peritoneala makrofager (PM) hos normala möss som odlas med adjuvanser detekteras.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA (1x)</td>
			<td>GIBCO, USA</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well filter plates</td>
			<td>Millipore. Billerica, MA</td>
			<td>CLS3922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlPO4</td>
			<td>General Chemical Company, USA</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated Cell Counter</td>
			<td>Countstar, China</td>
			<td>IC1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/c mice and C57BL/6 mice</td>
			<td>Beijing HFK Bioscience Co. Ltd</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>caprylic/capric triglyceride (GTCC)</td>
			<td>Beijing Fengli Pharmaceutical Co. Ltd., Beijing, China</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCK-8 kits</td>
			<td>Dojindo, Japan</td>
			<td>CK04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counting Plate</td>
			<td>Costar, Corning, USA</td>
			<td>CO010101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Sieve</td>
			<td>biosharp, China</td>
			<td>BS-70-CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810 R</td>
			<td>Eppendorf, Germany&#160;</td>
			<td>5811000398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM basic(1x) medium</td>
			<td>GIBCO, USA</td>
			<td>C11885500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSZ5000X Inverted Microscope</td>
			<td>Nikon,Japan</td>
			<td>DSZ5000X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EL-35 (Cremophor-35)</td>
			<td>Mumbai, India</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISpot classic</td>
			<td>AID, Germany</td>
			<td>ELR06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>GIBCO, USA</td>
			<td>10099141C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Full-function Microplate Reader</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>VL0000D2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>P42212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Granulocyte Macrophage Colony-Stimulating Factor</td>
			<td>GM-CSF, R&#38;D Systems, USA</td>
			<td>315-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>15630106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HF 90/240 Incubator</td>
			<td>Heal Force, Switzerland</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-4</td>
			<td>PeproTech, USA</td>
			<td>042149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L929 cell line</td>
			<td>FENGHUISHENGWU, China</td>
			<td>&#160;NCTC clone 929 (RRID:CVCL_0462)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Scanning Confocal Microscopy</td>
			<td>Zeiss, Germany</td>
			<td>LSM 980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MONTANE 85 PPI</td>
			<td>SEPPIC, France</td>
			<td>L12910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MONTANOX 80 PPI</td>
			<td>SEPPIC, France</td>
			<td>36372K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IFN-&#947; ELISA kit</td>
			<td>Dakewe, China</td>
			<td>1210002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IFN-&#947; precoated ELISPOT kit</td>
			<td>Dakewe, China</td>
			<td>DKW22-2000-096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-17A ELISA kit</td>
			<td>Dakewe, China</td>
			<td>1211702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-17A ELISpotPLUS Kit</td>
			<td>ebiosciences, USA</td>
			<td>3521-4HPW-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-1&#946; ELISA kit</td>
			<td>Dakewe, China</td>
			<td>1210122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-6 ELISA kit</td>
			<td>Dakewe, China</td>
			<td>1210602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse TNF-&#945; ELISA kit</td>
			<td>Dakewe, China</td>
			<td>1217202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids(100x)</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophiopogonin-D</td>
			<td>Chengdu Purui Technology Co. Ltd</td>
			<td>945619-74-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin</td>
			<td>Solarbio, China</td>
			<td>CA1620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>ZSGB-BIO, China</td>
			<td>ZLI-9062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td>Solarbio, China</td>
			<td>R1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium</td>
			<td>Hyclone (Life Technology), USA</td>
			<td>SH30809.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate(100 mM)</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Squalene</td>
			<td>Sigma, USA</td>
			<td>S3626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;- Mercaptoethanol</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro cellular activity evaluation of the nanoemulsion vaccine adjuvant ophiopogonin d

Som en huvudingrediens i vacciner kan adjuvanser direkt inducera eller förbättra de kraftfulla, utbredda, medfödda och adaptiva immunsvaren associerade med antigener. Ophiopogonin D (OP-D), en renad komponent extraherad från växten Ophiopogon japonicus, har visat sig vara användbar som ett vaccinadjuvans. Problemen med den låga lösligheten och toxiciteten hos OP-D kan effektivt övervinnas genom att använda en lågenergiemulgeringsmetod för att framställa nanoemulsionophiopogonin D (NOD). I den här artikeln undersöks en serie in vitro-protokoll för utvärdering av cellulär aktivitet. De cytotoxiska effekterna av L929 bestämdes med hjälp av en cellräkningssats-8-analys. Därefter detekterades de utsöndrade cytokinnivåerna och motsvarande immuncellnummer efter stimulering och odling av splenocyter från immuniserade möss med ELISA- och ELISpot-metoder. Dessutom observerades antigenupptagningsförmågan i benmärgsderiverade dendritiska celler (BMDC), som isolerades från C57BL/6-möss och mognade efter inkubation med GM-CSF plus IL-4, genom laserskanningskonfokalmikroskopi (CLSM). Viktigt är att makrofagaktivering bekräftades genom att mäta nivåerna av IL-1β, IL-6 och tumörnekrosfaktor alfa (TNF-α) cytokiner av ELISA-kit efter kokulturering av peritoneala makrofager (PM) från tomma möss med adjuvansen i 24 timmar. Förhoppningen är att detta protokoll kommer att ge andra forskare direkta och effektiva experimentella metoder för att utvärdera cellulära svarseffektiviteter hos nya vaccinadjuvanser.

Den cellulära aktivitetsutvärderingen av adjuvanserna OP-D och NOD slutfördes in vitro enligt protokollet. L929 fibroblaster är en användbar screeningmodell för in vitro-toxicitetstestning av NOD (figur 1). Kvantifieringen av inflammatoriska cytokinnivåer i mjälten kan hjälpa forskare att bättre förstå immunsvaret (figur 2). Övervakning av CTL med ELISpot är guldstandarden för bedömning av antigenspecifik T-cellsimmunitet i klin...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Cellular Activity Evaluation of the Nanoemulsion Vaccine Adjuvant Ophiopogonin D at JoVE.com

In Vitro Cellular Activity Evaluation of the Nanoemulsion Vaccine Adjuvant Ophiopogonin D

Protokollet presenterar detaljerade metoder för att utvärdera om nanoemulsionen ophiopogonin D-adjuvans främjar effektiva cellulära immunsvar.

In vitro Cellulär aktivitetsutvärdering av nanoemulsionsvaccinets adjuvans ophiopogonin D

As a principal ingredient of vaccines, adjuvants can directly induce or enhance the powerful, widespread, innate, and adaptive immune responses associated ...

Detta protokoll kan ge andra forskare direkta och effektiva experimentella tillvägagångssätt och detaljstegen för att utvärdera cellulära svarseffektiviteter hos nya vaccinadjuvanser. Det kan inte bara ge forskare specifika cellulära utvärderingsmetoder för adjuvanser, utan kan också bryta ner extraktionsmetoder som BM-sjukdom. Detta protokoll visar inte bara ingen toxicitet och hög cellulär leverans, men ger också detaljerade förfaranden för adjuvans utvärderingsfält.För att börja, sätt på vattenbadet och justera temperaturen till 37 grader Celsius. Sedan efter att ha samlat ett rör med frysta L929-celler från flytande kväve, tina snabbt i vattenbadet. Efter pipettering av cellerna i ett 15 ml sterilt centrifugrör, tillsätt två milliliter DMEM och blanda väl.Centrifugera proverna vid 129 x g i fem minuter. Och efter att ha kastat supernatanten, tillsätt två milliliter DMEM för att återsuspendera cellerna. Centrifugera proverna igen.Och efter att ha kasserat supernatanten, tillsätt sex milliliter DMEM komplett medium för resuspension och överföras till en T25 centimeter kvadratisk odlingskolv i en 37 grader Celsius inkubator med 5% koldioxid till odling i 48 timmar. På dag 24 efter den primära immuniseringen, ta bort mössen från djurrummet, lägg den i en glasskål och blötlägg i 75% alkohol i fem minuter. Placera centrifugrören på ett centrifugrörsställ, numrerade engångsformerna petriskålar och tillsätt fem milliliter PBS till varje petriskål med en 10 ml pipett.Gör ett snitt på sex till åtta centimeter med sax i mitten av musens vänstra ventrala sida. Riv upp huden för att exponera bukväggen och lokalisera den långa röda remsan av mjälten. Lyft sedan bukhinnan på den underlägsna sidan av mjälten med pincett.Skär upp den och vrid den uppåt för att exponera mjälten. Lyft mjälten med pincett. Separera bindväven under mjälten med ögonsax och ta bort mjälten.Placera mjälten i en petriskål som innehåller fem milliliter PBS och fräs med en sikt och sprutkolv. Efter slipning överför vätskan till ett 15 ml centrifugrör med en pipett i enlighet med numreringen. Centrifugera sedan vätskan vid 453 x g i fem minuter.Och efter att ha kastat supernatanten, tillsätt tre milliliter röd blodkroppslysbuffert till varje rör. Återsuspendera cellerna och lysera vid rumstemperatur i 10 minuter. Tillsätt sedan 10 till 12 ml PBS till varje rör.Och efter blandning och centrifugering vid 453 x g i fem minuter, kassera supernatanten och tillsätt 10 ml PBS till varje centrifugrör och återsuspendera cellerna. Ta 20 mikroliter av varje prov i en brunn på cellräkningsplattan och registrera antalet levande celler med hjälp av en automatiserad cellräknare. Centrifugera sedan proverna vid 453 x g i fem minuter.Och efter att ha kastat supernatanten, späd till 2,5 x 10 till de sjätte cellerna per milliliter med RF10-medium och tillsätt till en 96-brunnsplatta vid 100 mikroliter per brunn. Skär ett snitt på sex till åtta centimeter under musens buk med sax och kläm fast de två ändarna av öppningen för att separera den i olika riktningar och exponera musens ben. Separera musens lårben från muskroppen och skenbenet från leden.Och håll benen intakta i båda ändar. Ta sedan bort restvävnaden och brosket från ledlederna i båda ändarna av lårbenet med sax och pincett. Blötlägg lårbenen i 75% alkohol i fem minuter och blötlägg sedan i en steril PBS-lösning för att tvätta bort ytalkoholen.Skär sedan av ändarna på lårbenen med sax och skölj benmärgen i en steril petriskål med steril PBS-lösning, följt av aspiration med en milliliter spruta. Upprepa tvätten tre till fem gånger. Därefter filtreras du efter en cellsikt och samlar benmärgshärledda dendritiska celler i ett 15 ml centrifugrör.Efter centrifugering av proverna vid 290 x g i fem minuter, kassera supernatanten och tillsätt fyra ml lysbuffert för röda blodkroppar, återsuspendera och lysera vid rumstemperatur i fem minuter. Tillsätt sedan 10 ml steril PBS-lösning för att neutralisera lysatet och kassera supernatanten efter centrifugering vid 290 x g i fem minuter. Återsuspendera cellerna i en milliliter DMEM innehållande 1% penicillin-streptomycinlösning och 10% fetalt bovint serum och räkna.Tillsätt sedan granulocytmakrofagkolonistimulerande faktor plus interleukin-4 till mediet. Justera cellkoncentrationen till 5 x 10 till den femte per milliliter och inokulera cellerna på täckglidningar. Efter tillsats av cellsuspensionen till en sexbrunnsplatta vid två milliliter per brunn, placera plattan i en fuktad inkubator vid 37 grader Celsius med 5% koldioxid i 48 timmar.Byt mediet helt efter två dagar och byt hälften av mediet efter fyra dagar. Sänk ner mössen i 75% alkohol efter eutanasi och placera dem med framsidan uppåt i en petriskål i glas i numrerad ordning. För mössen genom överföringsfönstret in i det sterila operationsrummet och placera dem på operationsbordet i fem minuter.Använd sprutan aspirera 10 ml saltlösning. Luta mössen nedåt i cirka 45 grader och injicera i mitten av bukhålan. Dra cirka fem milliliter cellsuspension i ett 15 ml centrifugrör för varje 10 ml och upprepa injektionen tre gånger.Centrifugera cellsuspensionen vid 129 x g i fem minuter för att erhålla musens peritoneala primära makrofager. L929 fibroblaster är en användbar screeningmodell för in vitro-toxicitetstestning av NOD. Kvantifieringen av inflammatoriska cytokinnivåer i mjälten kan hjälpa forskare att bättre förstå immunsvaret.Övervakning av cytotoxiska T-lymfocyter med enzymbunden immunspot är guldstandarden för bedömning av antigenspecifik T-cellsimmunitet i kliniska prövningar och för screening av vaccinkandidater. Det ökade upptaget av ett antigen av dendritiska celler kan framkalla förbättrade adaptiva immunsvar. Makrofager spelar en viktig roll för att presentera antigener för T-celler, liksom att inducera andra antigenpresenterande celler för att uttrycka samstimulerande molekyler och därigenom initiera adaptiva immunsvar.Isoleringen av celler under förhållandet mellan läkemedel och cellverkan är av yttersta vikt.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vitro Cellular Activity Evaluation of the Nanoemulsion Vaccine Adjuvant Ophiopogonin D

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Humana T-lymfocyter Isolering, Kultur och analys av migration In Vitro</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Kvantitativa analyser av alla influensa typ A Viral Hemagglutinins och neuroaminidaser använda Universal antikroppar i enkla mätmetoder Slot Blot

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

Generering av Rekombinant arenavirus för Vaccine utveckling i FDA-godkända Vero celler

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Total Protein Extraction och 2-D-gelelektrofores Metoder för<em&gt; Burkholderia</em&gt; Arter

The investigation of  the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to  understanding the pathogenic mechanisms of diseases ...

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Cell-baserade flödescytometri analys för att mäta cytotoxisk aktivitet

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

Ett restriktionsenzym Based Kloning metod för att bedöma<em&gt; In vitro</em&gt; Replikering Kapacitet på HIV-1 subtyp C Gag-MJ4 Chimära virus

The protective effect of many HLA class I alleles on HIV-1 pathogenesis and disease progression is, in part, attributed to their ability to target ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In vitro Analys av MyD88-medierad cellulärt immunsvar till West Nile-virus mutant stam Infektion

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Utvärdering av värd-patogen svaren och vaccinets effekt hos möss

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

In Vitro ELISA Test för att utvärdera rabiesvaccin potens

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...

Intranasal Immunization and Milk Collection in Studies of Maternal Immunization in New Zealand White Rabbits (Oryctolagus cuniculus)

Intranasal Immunization and Milk Collection in Studies of Maternal Immunization in New Zealand White Rabbits Oryctolagus cuniculus

Intranasal immunisering och mjölksamling i studier av moderns immunisering i Nya Zeeland Vita Kaniner (Oryctolagus cuniculus)

Due to similarities in placentation and antibody transfer with humans, rabbits are an excellent model of maternal immunization. Additional advantages of ...