Name: in vitro cellular activity evaluation of the nanoemulsion vaccine adjuvant ophiopogonin d
Uploaded: 2022-12-09T13:35:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Cellular Activity Evaluation of the Nanoemulsion Vaccine Adjuvant Ophiopogonin D at JoVE.com

Bu çalışma, Çin Ulusal Anahtar Araştırma ve Geliştirme Programı'nın 2021YFC2302603 numaralı hibesi, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Programı'nın 31670938, 32070924, 82041045 ve 32000651 No'lu hibeleri, Chongqing Doğa Bilimleri Vakfı Proje Programı'nın 2014jcyjA0107 ve 2019jcyjA-msxmx0159 no'lu hibeleri, Chongqing'in Lisansüstü Araştırma ve İnovasyon Projesi'nin CYS21519 no'lu hibesi, Ordu Tıp Üniversitesi Özel projelerinin 2020XBK24 numaralı hibesi ve üniversite öğrencileri için Ulusal İnovasyon ve Girişimcilik Programı'nın 202090031021 numaralı hibe.

Tüm hücre deneyleri, temel ameliyathaneler, tampon odalar, steril kültür odaları, tanımlama ve analiz odaları ile donatılmış bir hücre mühendisliği laboratuvarında gerçekleştirildi. Çalışma ortamı ve koşulları mikrobiyal kontaminasyon ve diğer zararlı faktörlerden arındırılmıştır. Hayvan deneyleri, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için Kılavuz'a dayanarak yürütülmüş ve Üçüncü Askeri Tıp Üniversitesi Laboratuvar Hayvanları Refahı ve Etik Kurulu tarafından o...

<ol>
	<li>Cao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+of+graphene+oxide+as+a+potential+vaccine+carrier+and+adjuvant.">Recent progress of graphene oxide as a potential vaccine carrier and adjuvant.</a> Acta Biomaterials. 112, 14-28 (2020).</li><li>Ko, E. J., Kang, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunology+and+efficacy+of+MF59-adjuvanted+vaccines.">Immunology and efficacy of MF59-adjuvanted vaccines.</a> Human Vaccines &amp; Immunotherapeutics. 14 (12), 3041-3045 (2018).</li><li>Shi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccine+adjuvants:+Understanding+the+structure+and+mechanism+of+adjuvanticity.">Vaccine adjuvants: Understanding the structure and mechanism of adjuvanticity.</a> Vaccine. 37 (24), 3167-3178 (2019).</li><li>Kuo, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+CpG-adjuvanted+stable+prefusion+SARS-CoV-2+spike+antigen+as+a+subunit+vaccine+against+COVID-19.">Development of CpG-adjuvanted stable prefusion SARS-CoV-2 spike antigen as a subunit vaccine against COVID-19.</a> Scientific Reports. 10, 20085 (2020).</li><li>Twentyman, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interim+recommendation+of+the+Advisory+Committee+on+Immunization+Practices+for+use+of+the+Novavax+COVID-19+vaccine+in+persons+aged+&gt;/=18+years+-+United+States,+July+2022.">Interim recommendation of the Advisory Committee on Immunization Practices for use of the Novavax COVID-19 vaccine in persons aged &gt;/=18 years - United States, July 2022.</a> MMWR Morbidity and Mortality Weekly Report. 71 (31), 988-992 (2022).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+aluminum+adjuvants+eliciting+stronger+immune+response+when+mixed+with+hepatitis+B+virus+surface+antigens.">Improved aluminum adjuvants eliciting stronger immune response when mixed with hepatitis B virus surface antigens.</a> ACS Omega. 7 (38), 34528-34537 (2022).</li><li>Wang, N., Chen, M., Wang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomes+used+as+a+vaccine+adjuvant-delivery+system:+From+basics+to+clinical+immunization.">Liposomes used as a vaccine adjuvant-delivery system: From basics to clinical immunization.</a> Journal of Controlled Release. 303, 130-150 (2019).</li><li>Akin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+safety+and+efficacy+of+Advax(TM)+as+an+adjuvant:+A+systematic+review+and+meta-analysis.">Evaluation of the safety and efficacy of Advax(TM) as an adjuvant: A systematic review and meta-analysis.</a> Advances in Medical Sciences. 67 (1), 10-17 (2022).</li><li>Lacaille-Dubois, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Updated+insights+into+the+mechanism+of+action+and+clinical+profile+of+the+immunoadjuvant+QS-21:+A+review.">Updated insights into the mechanism of action and clinical profile of the immunoadjuvant QS-21: A review.</a> Phytomedicine. 60, 152905 (2019).</li><li>Marty-Roix, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+QS-21+as+an+inflammasome-activating+molecular+component+of+saponin+adjuvants.">Identification of QS-21 as an inflammasome-activating molecular component of saponin adjuvants.</a> The Journal of Biological Chemistry. 291 (3), 1123-1136 (2016).</li><li>Zhang, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ophiopogonin+D+attenuates+doxorubicin-induced+autophagic+cell+death+by+relieving+mitochondrial+damage+in+vitro+and+in+vivo.">Ophiopogonin D attenuates doxorubicin-induced autophagic cell death by relieving mitochondrial damage in vitro and in vivo.</a> The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 352 (1), 166-174 (2015).</li><li>An, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ophiopogonin+D+ameliorates+DNCB-induced+atopic+dermatitis-like+lesions+in+BALB/c+mice+and+TNF-alpha-+inflamed+HaCaT+cell.">Ophiopogonin D ameliorates DNCB-induced atopic dermatitis-like lesions in BALB/c mice and TNF-alpha- inflamed HaCaT cell.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 522 (1), 40-46 (2020).</li><li>Song, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+polysaccharide+from+Ophiopogon+japonicus+on+immune+response+to+Newcastle+disease+vaccine+in+chicken.">Effects of polysaccharide from Ophiopogon japonicus on immune response to Newcastle disease vaccine in chicken.</a> Pesquisa Veterin&#225;ria Brasileira. 36 (12), 1155-1159 (2016).</li><li>Tong, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immunopotentiator,+ophiopogonin+D,+encapsulated+in+a+nanoemulsion+as+a+robust+adjuvant+to+improve+vaccine+efficacy.">An immunopotentiator, ophiopogonin D, encapsulated in a nanoemulsion as a robust adjuvant to improve vaccine efficacy.</a> Acta Biomaterialia. 77, 255-267 (2018).</li><li>Lin, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronic+acid-glycine-cholesterol+conjugate-based+nanoemulsion+as+a+potent+vaccine+adjuvant+for+T+cell-mediated+immunity.">Hyaluronic acid-glycine-cholesterol conjugate-based nanoemulsion as a potent vaccine adjuvant for T cell-mediated immunity.</a> Pharmaceutics. 13 (10), 1569 (2021).</li><li>Xu, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+metabolomic+and+lipidomic+analysis+reveals+the+potential+mechanisms+of+hemolysis+effect+of+ophiopogonin+D+and+ophiopogonin+D'+in+vivo.">Global metabolomic and lipidomic analysis reveals the potential mechanisms of hemolysis effect of ophiopogonin D and ophiopogonin D' in vivo.</a> Chinese Medicine. 16 (1), 3 (2021).</li><li>Drane, D., Gittleson, C., Boyle, J., Maraskovsky, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISCOMATRIX+adjuvant+for+prophylactic+and+therapeutic+vaccines.">ISCOMATRIX adjuvant for prophylactic and therapeutic vaccines.</a> Expert Review of Vaccines. 6 (5), 761-772 (2007).</li><li>Rudolf, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microstructure+characterisation+and+identification+of+the+mechanical+and+functional+properties+of+a+new+PMMA-ZnO+composite.">Microstructure characterisation and identification of the mechanical and functional properties of a new PMMA-ZnO composite.</a> Materials. 13 (12), 2717 (2020).</li><li>Cannella, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxicity+evaluation+of+endodontic+pins+on+L929+cell+line.">Cytotoxicity evaluation of endodontic pins on L929 cell line.</a> BioMed Research International. 2019, 3469525 (2019).</li><li>Jiao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+MTT+and+CCK-8+assay+for+evaluation+of+graphene+cytotoxicity.">Limitations of MTT and CCK-8 assay for evaluation of graphene cytotoxicity.</a> RSC Advances. 5 (66), 53240-53244 (2015).</li><li>Ghasemi, M., Turnbull, T., Sebastian, S., Kempson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MTT+assay:+Utility,+limitations,+pitfalls,+and+interpretation+in+bulk+and+single-cell+analysis.">The MTT assay: Utility, limitations, pitfalls, and interpretation in bulk and single-cell analysis.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 12827 (2021).</li><li>Li, W., Zhou, J., Xu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+the+in+vitro+cytotoxicity+testing+of+medical+devices.">Study of the in vitro cytotoxicity testing of medical devices.</a> Biomedical Reports. 3 (5), 617-620 (2015).</li><li>Wu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+elevated+inflammatory+cytokines+of+spleen+and+spleen+index+in+acute+spinal+cord+injury.">Correlation between elevated inflammatory cytokines of spleen and spleen index in acute spinal cord injury.</a> Journal of Neuroimmunology. 344, 577264 (2020).</li><li>Lewis, S. M., Williams, A., Eisenbarth, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+the+immune+system+in+the+spleen.">Structure and function of the immune system in the spleen.</a> Science Immunology. 4 (33), (2019).</li><li>Cox, J. H., Ferrari, G., Janetzki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+cytokine+release+at+the+single+cell+level+using+the+ELISPOT+assay.">Measurement of cytokine release at the single cell level using the ELISPOT assay.</a> Methods. 38 (4), 274-282 (2006).</li><li>Elliott, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+microscopy:+Principles+and+modern+practices.">Confocal microscopy: Principles and modern practices.</a> Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68 (2020).</li><li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4(+)+T+cell+activation+and+inflammation+in+NASH-related+fibrosis.">CD4(+) T cell activation and inflammation in NASH-related fibrosis.</a> Frontiers in Immunology. 13, 967410 (2022).</li><li>Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+activation+and+polarization.">Macrophage activation and polarization.</a> Frontiers in Bioscience. 13, 453-461 (2008).</li><li>Quesniaux, V., Erard, F., Ryffel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adjuvant+activity+on+murine+and+human+macrophages.">Adjuvant activity on murine and human macrophages.</a> Methods in Molecular Biology. 626, 117-130 (2010).</li></ol>

Alt ünite aşılar mükemmel güvenlik sağlar, ancak immünojenisitesi zayıftır. İmmünojeniteyi arttırmanın ana stratejisi, antijenleri adjuvanlarla fiziksel olarak adsorbe etmek veya eşleştirmek ve DC'ler tarafından alımını ve sunumunu teşvik etmek için bunları ilaç dağıtım sistemlerine dahil etmektir. quillaia saponin ve türevleri gibi doğal bitki saponinleri oldukça toksiktir ve insan aşılarının geliştirilmesi için uygun değildir17. Bu nedenle, aşıların veya ad...

Aşılar, bulaşıcı ve bulaşıcı olmayan hastalıkların önlenmesi ve tedavisinde önemli bir araçtır. Aşı formülasyonlarına adjuvanların ve dağıtım araçlarının uygun şekilde eklenmesi, antijenlerin immünojenitesini arttırmak ve uzun süreli immün yanıtlar oluşturmak için faydalıdır1. Klasik adjuvan şaplara (alüminyum tuzu) ek olarak, şu anda pazarlanan aşılar için altı çeşit adjuvan vardır: MF592,3, AS04 3, AS03 3, AS01 3, CpG10184 ve Matrix-M5. Genel olarak, insan vücudu viral bir saldırıyla karşılaştığında, birinci ve ikinci savunma hatları (cilt, mukoza ve makrofajlar) virüsün temizlenmesinde öncülük eder ve son olarak, bağışıklık organlarını ve bağışıklık hücrelerini içeren üçüncü savunma hattı aktive edilir. Alüminyum ve alüminyum tuzları, 1920'lerin başından beri insan aşıları için en yaygın kullanılan adjuvanlar olmuştur ve etkili bir doğuştan gelen bağışıklık tepkisi ortaya çıkarmıştır6. Bununla birlikte, antijen sunan hücrelerin (APC'ler) klasik adjuvanlar tarafından aktivasyonunun, immün hücreleri spesifik sitokin ve kemokin setleri üretmeye teşvik eden, adjuvanların çalıştığı mekanizma olduğu ve adjuvanların spesifik immün yanıtlar üzerinde sadece geçici etkiler göstermesinin nedenlerinden biri olabileceği öne sürülmüştür7. İnsan kullanımı için sınırlı lisanslı adjuvanların varlığı, etkili bağışıklık tepkilerini ortaya çıkaran aşıların geliştirilmesinde kısıtlayıcı bir faktördür8.
Şu anda, artan sayıda adjuvan çalışma, farelerde güçlü bir hücresel bağışıklık tepkisi indükleme yeteneğini göstermektedir. QS-21'in dengeli bir T-helper 1 (Th1) ve T-helper 2 (Th2) immün yanıtını indüklediği, daha yüksek seviyelerde antikor titreleri ürettiği ve bir adjuvan olarak korumayı uzattığı gösterilmiştir, ancak güçlü toksisitesi ve hemolitik özellikleri, bağımsız bir klinik adjuvan 9,10 olarak gelişimini sınırlar. OP-D (ruscogenin-O-α-L-rhamnopyranosy1-(1→2)-β-D-xylopyranosyl-(1→3)-β-D-fucopyranoside), Çin şifalı bitkisi Ophiopogon japonicas4'ün kökünden izole edilen steroidal saponinlerden biridir. Ek olarak, Radix Ophiopogonis'te bulunan baş farmakolojik olarak aktif bileşendir (Shen Mai San) ve bazı farmakolojik özelliklere sahip olduğu bilinmektedir11. Ayrıca, Liliaceae ailesinin bir üyesidir ve hücresel inflamasyon ve miyokard hasarında inhibitör ve koruyucu etkileri için yaygın olarak kullanılmaktadır. Örneğin, OP-D, BALB / C farelerde DNCB ile indüklenen atopik dermatit benzeri lezyonları ve tümör nekroz faktörü alfa (TNF-α) inflamatuar HaCaT hücrelerini iyileştirir12. Önemli olarak, OP-D, kardiyovasküler sistemin antioksidatif korumasını teşvik eder ve hem reaktif oksijen türlerinin üretimini azaltarak hem de mitokondriyal membran hasarını bozarak kalbi doksorubisin kaynaklı otofajik hasara karşı korur. Deneyler, OP-D'yi mono-desmosid ile almanın bağışıklık sağlığını artırmaya, beyaz kan hücresi sayımlarını ve DNA sentezini artırmaya ve antikorların daha uzun süre dayanmasına yardımcı olduğunu göstermiştir13. Daha önce OP-D'nin adjuvan etkisi olduğu bulunmuştur14.
Nanoemülsiyonlar, yüzey aktif maddeler, yağ, kosürfaktanlar ve su12,15'in bir kombinasyonundan oluşan su içinde yağ nanoformülasyonlarıdır. Bu nanoaşı tasarımları, immün stimülasyonu arttırmak, antijenleri korumak ve dendritik hücre (DC) olgunlaşmasını teşvik etmek için antijenlerin ve adjuvanların birlikte kapsüllenmesine izin verir16. Taramadan elde edilen bu yeni adjuvanların gelişimi için, hücresel yanıt yeteneklerini değerlendirmek için uygun yöntemler bulmak önemlidir.
Bu protokolün amacı, adjuvanların fagositozu ve immün hücrelerin in vitro hücre kültüründeki ekspresyonunu artırıp artıramayacağını sistematik olarak değerlendirmek ve ana deneysel yöntemleri detaylandırmaktır. Deney dört alt bölüme ayrılmıştır: (1) OP-D ve NOD'nin L929 hücrelerine toksisitesi, hücre sayma kit-8 (CCK-8) testi ile belirlenir; (2) endokrin IFN-γ ve IL-17A'nın sitokin seviyeleri ve immünize farelerde karşılık gelen hücre sayıları splenosit stimülasyonu ve ELISpot testleri ile tespit edilir; (3) Adjuvan stimülasyondan sonra DC'lerin antijen sunum kabiliyeti konfokal mikroskopi kullanılarak gözlenir; ve (4) adjuvanlarla birlikte kültürlenmiş normal farelerde periton makrofajlarından (PM'ler) elde edilen süpernatantlarda üç çeşit sitokin, IL-1β, IL-6 ve TNF-α tespit edilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA (1x)</td>
			<td>GIBCO, USA</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well filter plates</td>
			<td>Millipore. Billerica, MA</td>
			<td>CLS3922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlPO4</td>
			<td>General Chemical Company, USA</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated Cell Counter</td>
			<td>Countstar, China</td>
			<td>IC1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/c mice and C57BL/6 mice</td>
			<td>Beijing HFK Bioscience Co. Ltd</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>caprylic/capric triglyceride (GTCC)</td>
			<td>Beijing Fengli Pharmaceutical Co. Ltd., Beijing, China</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCK-8 kits</td>
			<td>Dojindo, Japan</td>
			<td>CK04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counting Plate</td>
			<td>Costar, Corning, USA</td>
			<td>CO010101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Sieve</td>
			<td>biosharp, China</td>
			<td>BS-70-CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810 R</td>
			<td>Eppendorf, Germany&#160;</td>
			<td>5811000398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM basic(1x) medium</td>
			<td>GIBCO, USA</td>
			<td>C11885500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSZ5000X Inverted Microscope</td>
			<td>Nikon,Japan</td>
			<td>DSZ5000X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EL-35 (Cremophor-35)</td>
			<td>Mumbai, India</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISpot classic</td>
			<td>AID, Germany</td>
			<td>ELR06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>GIBCO, USA</td>
			<td>10099141C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Full-function Microplate Reader</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>VL0000D2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>P42212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Granulocyte Macrophage Colony-Stimulating Factor</td>
			<td>GM-CSF, R&#38;D Systems, USA</td>
			<td>315-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>15630106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HF 90/240 Incubator</td>
			<td>Heal Force, Switzerland</td>
			<td>null</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-4</td>
			<td>PeproTech, USA</td>
			<td>042149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L929 cell line</td>
			<td>FENGHUISHENGWU, China</td>
			<td>&#160;NCTC clone 929 (RRID:CVCL_0462)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Scanning Confocal Microscopy</td>
			<td>Zeiss, Germany</td>
			<td>LSM 980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MONTANE 85 PPI</td>
			<td>SEPPIC, France</td>
			<td>L12910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MONTANOX 80 PPI</td>
			<td>SEPPIC, France</td>
			<td>36372K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IFN-&#947; ELISA kit</td>
			<td>Dakewe, China</td>
			<td>1210002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IFN-&#947; precoated ELISPOT kit</td>
			<td>Dakewe, China</td>
			<td>DKW22-2000-096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-17A ELISA kit</td>
			<td>Dakewe, China</td>
			<td>1211702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-17A ELISpotPLUS Kit</td>
			<td>ebiosciences, USA</td>
			<td>3521-4HPW-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-1&#946; ELISA kit</td>
			<td>Dakewe, China</td>
			<td>1210122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-6 ELISA kit</td>
			<td>Dakewe, China</td>
			<td>1210602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse TNF-&#945; ELISA kit</td>
			<td>Dakewe, China</td>
			<td>1217202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids(100x)</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophiopogonin-D</td>
			<td>Chengdu Purui Technology Co. Ltd</td>
			<td>945619-74-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin</td>
			<td>Solarbio, China</td>
			<td>CA1620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>ZSGB-BIO, China</td>
			<td>ZLI-9062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td>Solarbio, China</td>
			<td>R1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium</td>
			<td>Hyclone (Life Technology), USA</td>
			<td>SH30809.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate(100 mM)</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Squalene</td>
			<td>Sigma, USA</td>
			<td>S3626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;- Mercaptoethanol</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro cellular activity evaluation of the nanoemulsion vaccine adjuvant ophiopogonin d

Aşıların temel bir bileşeni olarak, adjuvanlar antijenlerle ilişkili güçlü, yaygın, doğuştan gelen ve adaptif immün yanıtları doğrudan indükleyebilir veya artırabilir. Ophiopogon japonicus bitkisinden ekstrakte edilen saflaştırılmış bir bileşen olan Ophiopogonin D (OP-D), bir aşı adjuvanı olarak yararlı bulunmuştur. OP-D'nin düşük çözünürlüğü ve toksisitesi sorunları, nanoemülsiyon ofiyopogonin D (NOD) hazırlamak için düşük enerjili bir emülsifikasyon yöntemi kullanılarak etkili bir şekilde üstesinden gelinebilir. Bu makalede, hücresel aktivitenin değerlendirilmesi için bir dizi in vitro protokol incelenmiştir. L929'un sitotoksik etkileri, hücre sayma kit-8 testi kullanılarak belirlendi. Daha sonra, immünize farelerden splenositlerin stimülasyonu ve kültürü sonrasında salgılanan sitokin düzeyleri ve buna karşılık gelen immün hücre sayıları ELISA ve ELISpot yöntemleri ile tespit edildi. Ek olarak, C57BL / 6 farelerden izole edilen ve GM-CSF artı IL-4 ile inkübasyondan sonra olgunlaşan kemik iliği kaynaklı dendritik hücrelerde (BMDC'ler) antijen alım yeteneği, lazer taramalı konfokal mikroskopi (CLSM) ile gözlenmiştir. Önemli olarak, makrofaj aktivasyonu, IL-1β, IL-6 ve tümör nekroz faktörü alfa (TNF-α) sitokinlerinin seviyelerinin, boş farelerden peritoneal makrofajların (PM'ler) adjuvanla 24 saat boyunca birlikte kültürlenmesinden sonra ELISA kitleri ile ölçülmesiyle doğrulandı. Bu protokolün, diğer araştırmacılara yeni aşı adjuvanlarının hücresel yanıt etkinliklerini değerlendirmek için doğrudan ve etkili deneysel yaklaşımlar sağlayacağı umulmaktadır.

OP-D ve NOD adjuvanlarının hücresel aktivite değerlendirmesi protokole göre in vitro olarak tamamlandı. L929 fibroblastları, NOD'nin in vitro toksisite testi için yararlı bir tarama modelidir (Şekil 1). Dalaktaki inflamatuar sitokin seviyelerinin miktarı, araştırmacıların bağışıklık tepkisini daha iyi anlamalarına yardımcı olabilir (Şekil 2). CTL'lerin ELISpot ile izlenmesi, klinik çalışmalarda antijene özgü T hücr...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Cellular Activity Evaluation of the Nanoemulsion Vaccine Adjuvant Ophiopogonin D at JoVE.com

In Vitro Cellular Activity Evaluation of the Nanoemulsion Vaccine Adjuvant Ophiopogonin D

Protokol, nanoemülsiyon ofiyopogonin D adjuvanının etkili hücresel immün yanıtları destekleyip desteklemediğini değerlendirmek için ayrıntılı yöntemler sunar.

İn Vitro Nanoemülsiyon Aşısı Adjuvan Ophiopogonin D'nin Hücresel Aktivitesinin Değerlendirilmesi

As a principal ingredient of vaccines, adjuvants can directly induce or enhance the powerful, widespread, innate, and adaptive immune responses associated ...

Bu protokol, diğer araştırmacılara doğrudan ve etkili deneysel yaklaşımlar ve yeni aşı adjuvanlarının hücresel yanıt etkinliklerini değerlendirmek için ayrıntılı adımlar sağlayabilir. Araştırmacılara sadece adjuvanlar için spesifik hücresel değerlendirme yöntemleri sağlamakla kalmaz, aynı zamanda BM hastalığı gibi ekstraksiyon yöntemlerini de parçalayabilir. Bu protokoller sadece toksisite ve yüksek hücresel doğum göstermemekle kalmaz, aynı zamanda adjuvan değerlendirme alanı için ayrıntılı prosedürler sağlar.Başlamak için su banyosunu açın ve sıcaklığı 37 santigrat dereceye ayarlayın. Daha sonra sıvı azottan bir tüp dondurulmuş L929 hücresi topladıktan sonra, su banyosunda hızla çözülür. Hücreleri 15 mililitrelik steril bir santrifüj tüpüne pipetledikten sonra, iki mililitre DMEM ekleyin ve iyice karıştırın.Numuneleri beş dakika boyunca 129 x g'de santrifüj yapın. Süpernatanı attıktan sonra, hücreleri yeniden askıya almak için iki mililitre DMEM ekleyin. Numuneleri tekrar santrifüj yapın.Süpernatanı attıktan sonra, yeniden süspansiyon için altı mililitre DMEM tam ortamı ekleyin ve 48 saat boyunca% 5 karbondioksit içeren 37 santigrat derecelik bir inkübatörde T25 santimetrekare kültür şişesine aktarın. Birincil aşılamadan sonraki 24. günde, fareleri hayvan odasından çıkarın, bir cam kaba koyun ve beş dakika boyunca% 75 alkole batırın. Santrifüj tüplerini bir santrifüj tüp rafına yerleştirin, tek kullanımlık Petri kaplarını numaralandırın ve 10 mililitrelik bir pipetle her Petri kabına beş mililitre PBS ekleyin.Farenin sol ventral tarafının ortasında makasla altı ila sekiz santimetrelik bir kesi yapın. Karın duvarını açığa çıkarmak ve dalağın uzun kırmızı şeridini bulmak için cildi yırtın. Daha sonra, dalağın alt tarafındaki peritonu, forseps ile kaldırın.Dalağı ortaya çıkarmak için kesin ve yukarı doğru çevirin. Dalağı forseps ile kaldırın. Dalağın altındaki bağ dokusunu oftalmik makasla ayırın ve dalağı çıkarın.Dalağı beş mililitre PBS içeren bir Petri kabına yerleştirin ve bir elek ve şırınga pistonu ile öğütün. Taşlamadan sonra, sıvıyı numaralandırmaya uygun olarak pipetli 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Daha sonra, sıvıyı beş dakika boyunca 453 x g'de santrifüj edin.Süpernatanı attıktan sonra, her tüpe üç mililitre kırmızı kan hücresi lizis tamponu ekleyin. Hücreleri tekrar askıya alın ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca lize edin. Daha sonra her tüpe 10 ila 12 mililitre PBS ekleyin.Ve beş dakika boyunca 453 x g'de karıştırıp santrifüj yaptıktan sonra, süpernatantı atın ve her santrifüj tüpüne 10 mililitre PBS ekleyin ve hücreleri yeniden askıya alın. Hücre sayma plakasının bir kuyucuğuna her numunenin 20 mikrolitresini alın ve otomatik bir hücre sayacı kullanarak canlı hücre sayısını kaydedin. Daha sonra, numuneleri beş dakika boyunca 453 x g'de santrifüj yapın.Süpernatanı attıktan sonra, RF10 ortamı ile mililitre başına altıncı hücrelere 2,5 x 10 oranında seyreltin ve kuyu başına 100 mikrolitrede 96 delikli bir plakaya ekleyin. Farenin karnının altında altı ila sekiz santimetrelik bir kesiyi makasla kesin ve farklı yönlerde ayırmak ve farenin bacaklarını ortaya çıkarmak için açıklığın iki ucunu kelepçeleyin. Fare femurunu fare gövdesinden ve tibiası eklemden ayırın.Ve kemikleri her iki ucunda da sağlam tutun. Daha sonra, femur her iki ucundaki eklem eklemlerinden kalan doku ve kıkırdağı makas ve forseps ile çıkarın. Femurları beş dakika boyunca% 75 alkole batırın ve ardından yüzey alkolünü yıkamak için steril bir PBS çözeltisine batırın.Daha sonra femurların uçlarını makasla kesin ve kemik iliğini steril PBS çözeltisi ile steril bir Petri kabında durulayın, ardından bir mililitrelik bir şırınga ile aspirasyon yapın. Yıkamayı üç ila beş kez tekrarlayın. Daha sonra, bir hücre eleği ile filtreleyin ve kemik iliği kaynaklı dendritik hücreleri 15 mililitrelik bir santrifüj tüpünde toplayın.Numuneleri beş dakika boyunca 290 x g'de santrifüj ettikten sonra, süpernatantı atın ve dört mililitre kırmızı kan hücresi lizis tamponu ekleyin, beş dakika boyunca oda sıcaklığında yeniden askıya alın ve lize edin. Daha sonra, lizatı nötralize etmek için 10 mililitre steril PBS çözeltisi ekleyin ve beş dakika boyunca 290 x g'de santrifüj yaptıktan sonra, süpernatanı atın. Hücreleri% 1 penisilin-streptomisin çözeltisi ve% 10 fetal sığır serumu içeren bir mililitre DMEM'de yeniden askıya alın ve sayın.Daha sonra ortama granülosit makrofaj kolonisi uyarıcı faktör artı interlökin-4 ekleyin. Hücre konsantrasyonunu mililitre başına 5 x 10 ila beşinciye ayarlayın ve hücreleri kapak fişlerine aşılayın. Hücre süspansiyonunu kuyu başına iki mililitrede altı kuyucuklu bir plakaya ekledikten sonra, plakayı 48 saat boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede nemlendirilmiş bir inkübatöre yerleştirin.İki gün sonra ortamı tamamen değiştirin ve dört gün sonra ortamın yarısını değiştirin. Fareleri% 75'e batırınötenaziden sonra alkolün ve yüzüstü bir cam Petri kabına numaralandırılmış sırayla yerleştirin. Fareleri transfer penceresinden steril ameliyathaneye geçirin ve beş dakika boyunca ameliyat masasına yerleştirin.Şırıngayı kullanarak, 10 mililitre salin aspire edin. Fareleri yaklaşık 45 derecede aşağı doğru eğin ve karın boşluğunun ortasına enjekte edin. Her 10 mililitre için 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne yaklaşık beş mililitre hücre süspansiyonu çekin ve enjeksiyonu üç kez tekrarlayın.Fare periton primer makrofajlarını elde etmek için hücre süspansiyonunu beş dakika boyunca 129 x g'de santrifüj yapın. L929 fibroblastları, NOD'nin in vitro toksisite testi için yararlı bir tarama modelidir. Dalaktaki enflamatuar sitokin seviyelerinin miktarı, araştırmacıların bağışıklık tepkisini daha iyi anlamalarına yardımcı olabilir.Sitotoksik T lenfositlerin enzime bağlı immünospot ile izlenmesi, klinik çalışmalarda antijene özgü T hücresi bağışıklığının değerlendirilmesinde ve aşı adaylarının taranmasında altın standarttır. Bir antijenin dendritik hücreler tarafından artan alımı, gelişmiş adaptif immün yanıtlar ortaya çıkarabilir. Makrofajlar, antijenlerin T hücrelerine sunulmasında ve diğer antijen sunan hücrelerin ko-uyarıcı molekülleri eksprese etmelerini ve böylece adaptif immün tepkilerin başlatılmasında önemli bir rol oynamaktadır.Hücrelerin ilacın hücre etkisine oranı altında izole edilmesi son derece önemlidir.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vitro Cellular Activity Evaluation of the Nanoemulsion Vaccine Adjuvant Ophiopogonin D

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Göç İnsan T Lenfosit İzolasyon, Kültür ve Analiz In Vitro</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Tüm Influenza Kantitatif Analiz Basit Slot Blot Tahliller Evrensel Antikorlar kullanarak Viral Hemagglutinins ve nöraminidaz yazın

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

FDA onaylı Vero hücrelerinde Aşı Geliştirme için bir araya getiren Arenavirus üretimi

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Toplam Protein Ekstraksiyon ve 2-D Jel Elektroforez Yöntemleri<em&gt; Burkholderia</em&gt; Türler

The investigation of  the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to  understanding the pathogenic mechanisms of diseases ...

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

Bir Kısıtlama Enzim Temelli Klonlama Yöntemi değerlendirin<em&gt; In vitro</em&gt; HIV-1 Tipi C Gag-MJ4 Kimerik Virüslerin Çoğaltma Kapasitesi

The protective effect of many HLA class I alleles on HIV-1 pathogenesis and disease progression is, in part, attributed to their ability to target ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

Batı Nil Virüsü Mutant Soy Enfeksiyon MyD88-aracılı Hücresel Bağışıklık Tepki Vitro Analizi

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Ana bilgisayar-patojen yanıt ve aşı etkinliği farelerde değerlendirilmesi

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

In Vitro ELISA Testi Kuduz Aşısı Potens Değerlendirmek için

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...

Intranasal Immunization and Milk Collection in Studies of Maternal Immunization in New Zealand White Rabbits (Oryctolagus cuniculus)

Intranasal Immunization and Milk Collection in Studies of Maternal Immunization in New Zealand White Rabbits Oryctolagus cuniculus

Yeni Zelanda Beyaz Tavşanlarında Anne Bağışıklama Çalışmalarında İntranazal Bağışıklama ve Süt Toplama (Oryctolagus cuniculus)

Due to similarities in placentation and antibody transfer with humans, rabbits are an excellent model of maternal immunization. Additional advantages of ...