Name: construction of cyclic cell-penetrating peptides for enhanced penetration of biological barriers
Uploaded: 2022-09-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Construction of Cyclic Cell-Penetrating Peptides for Enhanced Penetration of Biological Barriers at JoVE.com

يتم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الطبيعية الصينية (21708031) ، ومؤسسة علوم ما بعد الدكتوراه الصينية (BX20180264 ، 2018M643519) ، وصناديق البحوث الأساسية للجامعات المركزية (2682021ZTPY075).

1. إعداد المعدات
ملاحظة: نفذ جميع الإجراءات في غطاء دخان التشغيل باستخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة.
<ol><li>قم بتجميع جهاز تخليق الببتيد اليدوي في غطاء الدخان (الشكل 1). ضع محبس ثلاثي الاتجاهات (انظر جدول المواد) على مشعب الفراغ (انظر جدول الم?...

<ol>
	<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-targeted+dual+site-selective+functionalized+poly(&#946;-amino+esters)+delivery+platform+for+nerve+regeneration.">Brain-targeted dual site-selective functionalized poly(&#946;-amino esters) delivery platform for nerve regeneration.</a> Nano Letters. 21 (7), 3007-3015 (2021).</li><li>Park, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+BBB+permeability+of+osmotically+active+poly(mannitol-co-PEI)+modified+with+rabies+virus+glycoprotein+via+selective+stimulation+of+caveolar+endocytosis+for+RNAi+therapeutics+in+Alzheimer's+disease.">Enhanced BBB permeability of osmotically active poly(mannitol-co-PEI) modified with rabies virus glycoprotein via selective stimulation of caveolar endocytosis for RNAi therapeutics in Alzheimer's disease.</a> Biomaterials. 38, 61-71 (2015).</li><li>Bian, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+cell-based+intercellular+delivery+of+transcription+factor+GATA4+on+ischemic+cardiomyopathy.">Effect of cell-based intercellular delivery of transcription factor GATA4 on ischemic cardiomyopathy.</a> Circulation Research. 100 (11), 1626-1633 (2007).</li><li>He, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+low+molecular+weight+protamine+chemical+chimera+to+enhance+monomeric+insulin+intestinal+absorption.">The use of low molecular weight protamine chemical chimera to enhance monomeric insulin intestinal absorption.</a> Biomaterials. 34 (31), 7733-7743 (2013).</li><li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+specific+STAT3-binding+peptide+exerts+antiproliferative+effects+and+antitumor+activity+by+inhibiting+STAT3+phosphorylation+and+signaling.">A specific STAT3-binding peptide exerts antiproliferative effects and antitumor activity by inhibiting STAT3 phosphorylation and signaling.</a> Cancer Research. 74 (8), 2144-2151 (2014).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEGylated+liposomes+with+NGR+ligand+and+heat-activable+cell-penetrating+peptide-doxorubicin+conjugate+for+tumor-specific+therapy.">PEGylated liposomes with NGR ligand and heat-activable cell-penetrating peptide-doxorubicin conjugate for tumor-specific therapy.</a> Biomaterials. 35 (14), 4368-4381 (2014).</li><li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+paclitaxel+delivery+facilitated+by+a+dual-functional+CPP+with+a+hydrophobic+hairpin+tail.">Intracellular paclitaxel delivery facilitated by a dual-functional CPP with a hydrophobic hairpin tail.</a> ACS Applied Materials and Interfaces. 13 (4), 4853-4860 (2021).</li><li>Vasan, N., Baselga, J., Hyman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+view+on+drug+resistance+in+cancer.">A view on drug resistance in cancer.</a> Nature. 575 (7782), 299-309 (2019).</li><li>Cong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironment-induced+in+situ+self-assembly+of+polymer-peptide+conjugates+that+attack+solid+tumors+deeply.">Microenvironment-induced in situ self-assembly of polymer-peptide conjugates that attack solid tumors deeply.</a> Angewandte Chemie International Edition. 131 (14), 4680-4685 (2019).</li><li>Blanco, E., Shen, H., Ferrari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+nanoparticle+design+for+overcoming+biological+barriers+to+drug+delivery.">Principles of nanoparticle design for overcoming biological barriers to drug delivery.</a> Nature Biotechnology. 33 (9), 941-951 (2015).</li><li>Tian, Y., Zhou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+cell-penetrating+peptides+and+their+functionalization+of+polymeric+nanoplatforms+for+drug+delivery.">Advances in cell-penetrating peptides and their functionalization of polymeric nanoplatforms for drug delivery.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. Nanomedicine and Nanobiotechnology. 13 (2), 1-12 (2021).</li><li>Milletti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-penetrating+peptides:+Classes,+origin,+and+current+landscape.">Cell-penetrating peptides: Classes, origin, and current landscape.</a> Drug Discovery Today. 17 (15-16), 850-860 (2012).</li><li>Turner, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-penetrating+peptide+conjugates+of+peptide+nucleic+acids+(PNA)+as+inhibitors+of+HIV-1+Tat-dependent+trans-activation+in+cells.">Cell-penetrating peptide conjugates of peptide nucleic acids (PNA) as inhibitors of HIV-1 Tat-dependent trans-activation in cells.</a> Nucleic Acids Research. 33 (21), 6837-6849 (2005).</li><li>Tunnemann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+analysis+of+cell+penetration+ability+and+toxicity+of+oligo-arginines.">Live-cell analysis of cell penetration ability and toxicity of oligo-arginines.</a> Journal of Peptide Science. 14 (4), 469-476 (2008).</li><li>Shi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stapling+of+short+cell-penetrating+peptides+for+enhanced+tumor+cell-and-tissue+dual-penetration.">Stapling of short cell-penetrating peptides for enhanced tumor cell-and-tissue dual-penetration.</a> Chemical Communications. 58 (14), 2299-2302 (2022).</li><li>Komin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+peptide+for+transcellular+cargo+delivery:+Structure-function+relationship+and+mechanism+of+action.">A peptide for transcellular cargo delivery: Structure-function relationship and mechanism of action.</a> Journal of Controlled Release. 324, 633-643 (2020).</li><li>Dietrich, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+permeable+stapled+peptide+inhibitor+of+Wnt+signaling+that+targets+&#946;-catenin+protein-protein+interactions.">Cell permeable stapled peptide inhibitor of Wnt signaling that targets &#946;-catenin protein-protein interactions.</a> Cell Chemical Biology. 24 (8), 958-968 (2017).</li><li>Tian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stapling+of+unprotected+helical+peptides+via+photo-induced+intramolecular+thiol-yne+hydrothiolation.">Stapling of unprotected helical peptides via photo-induced intramolecular thiol-yne hydrothiolation.</a> Chemical Science. 7 (5), 3325-3330 (2016).</li><li>De Araujo, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+&#945;-helicity+of+cyclic+pentapeptides+in+water.">Comparative &#945;-helicity of cyclic pentapeptides in water.</a> Angewandte Chemie International Edition. 53 (27), 6965-6969 (2014).</li><li>Chu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+understanding+cell+penetration+by+stapled+peptides.">Towards understanding cell penetration by stapled peptides.</a> Medicinal Chemistry Communications. 6 (1), 111-119 (2015).</li><li>Bock, J. E., Gavenonis, J., Kritzer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+in+shape:+Controlling+peptide+bioactivity+and+bioavailability+using+conformational+constraints.">Getting in shape: Controlling peptide bioactivity and bioavailability using conformational constraints.</a> ACS Chemical Biology. 8 (3), 488-499 (2013).</li><li>Tian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+stapling+architecture+on+physiochemical+properties+and+cell+permeability+of+stapled+&#945;-helical+peptides:+A+comparative+study.">Effect of stapling architecture on physiochemical properties and cell permeability of stapled &#945;-helical peptides: A comparative study.</a> ChemBioChem. 18 (21), 2087-2093 (2017).</li><li>White, C. J., Yudin, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contemporary+strategies+for+peptide+macrocyclization.">Contemporary strategies for peptide macrocyclization.</a> Nature Chemistry. 3 (7), 509-524 (2011).</li><li>Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalization+of+tumor+vasculature:+An+emerging+concept+in+antiangiogenic+therapy.">Normalization of tumor vasculature: An emerging concept in antiangiogenic therapy.</a> Science. 307 (5706), 58-62 (2005).</li><li>Patgiri, A., Menzenski, M. Z., Mahon, A. B., Arora, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-phase+synthesis+of+short+&#945;-helices+stabilized+by+the+hydrogen+bond+surrogate+approach.">Solid-phase synthesis of short &#945;-helices stabilized by the hydrogen bond surrogate approach.</a> Nature Protocols. 5 (11), 1857-1865 (2010).</li><li>Baek, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+stapled+p53+peptide+bound+to+Mdm2.">Structure of the stapled p53 peptide bound to Mdm2.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (1), 103-106 (2012).</li><li>Traboulsi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrocyclic+cell+penetrating+peptides:+A+study+of+structure-penetration+properties.">Macrocyclic cell penetrating peptides: A study of structure-penetration properties.</a> Bioconjugate Chemistry. 26 (3), 405-411 (2015).</li><li>Tian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proline-derived+transannular+N-cap+for+nucleation+of+short+&#945;-helical+peptides.">A proline-derived transannular N-cap for nucleation of short &#945;-helical peptides.</a> Chemical Communications. 52 (59), 9275-9278 (2016).</li><li>Muppidi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+proteolytically+stable,+cell-permeable+peptide-based+selective+Mcl-1+inhibitors.">Rational design of proteolytically stable, cell-permeable peptide-based selective Mcl-1 inhibitors.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (36), 14734-14737 (2012).</li><li>Wiradharma, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+cationic+amphiphilic+&#945;-helical+peptides+as+antimicrobial+agents.">Synthetic cationic amphiphilic &#945;-helical peptides as antimicrobial agents.</a> Biomaterials. 32 (8), 2204-2212 (2011).</li><li>Jones, A. T., Sayers, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+entry+of+cell+penetrating+peptides:+Tales+of+tails+wagging+dogs.">Cell entry of cell penetrating peptides: Tales of tails wagging dogs.</a> Journal of Controlled Release. 161 (2), 582-591 (2012).</li></ol>

أثبت التثبيت الكيميائي للببتيدات من خلال دمج القيود المطابقة أنه استراتيجية فعالة لتحسين استقرار ونفاذية الخلية للببتيد26. في هذا البروتوكول ، يتم وصف إجراء خطوة بخطوة لتخليق CPPs الدورية مع الروابط المتقاطعة العطرية وتقييم نفاذيتها عبر الحواجز البيولوجية. بالمقارنة مع الروا...

شهدت العقود القليلة الماضية تقدما سريعا في تطوير الببتيدات المخترقة للخلايا (CPPs) لتوصيل الأدوية. تم استخدام CPPs على نطاق واسع كناقلات جزيئية لعلاج مجموعة من الأمراض التي تهدد الحياة ، بما في ذلك الاضطرابات العصبية1,2 ، وأمراض القلب3 ، والسكري4 ، والتهاب الجلد5 ، والسرطان 6,7. لا يزال السرطان يشكل عبئا صحيا عالميا مصحوبا بمعدل مرتفع من المراضة والوفيات على الرغم من الجهود البحثية واسعة النطاق8. تتمثل إحدى العقبات الخطيرة أمام علاج السرطان في محدودية وصول العلاجات إلى الخلايا السرطانية العميقة بسبب الحواجز الفسيولوجية مثل المصفوفة المدمجة خارج الخلية (ECM) ، والأوعية الدموية غير الطبيعية للورم ، وحواجز الأغشية المتعددة ، وارتفاع ضغط السائل الخلالي (IFP) 9. وبالتالي ، فإن تطوير CPPs جديدة ذات قدرة فائقة على توصيل الشحنات عبر الحواجز البيولوجية يعتبر استراتيجية أساسية لعلاج السرطان10,11.
يمكن تصنيف CPPs إلى CPPs الموجبة والبرمائية والكارهة للماء من حيث خصائصها الفيزيائية والكيميائية12. من بين هذه ، الببتيد HIV-TAT المشحون إيجابيا والبوليارجينين الاصطناعي لهما أهمية كبيرة في البحوث الطبية الحيوية وقد تمت دراستهما على نطاق واسع لتسهيل توصيل الدواء داخل الخلايا13. أفاد Tunnemann et al. أن الحد الأدنى لطول ثمانية أرجينين ضروري لاختراق الخلايا بكفاءة لببتيدات البولي أرجينين الاصطناعية ، بناء على دراسة نفاذية الخلية التي أجريت باستخدام الببتيدات R3 إلى R1214. ومع ذلك ، فإن هذه CPPs عموما لها نصف عمر بلازما قصير بسبب التحلل المائي السريع في الجسم الحي. بالإضافة إلى ذلك ، لا يعرف سوى القليل فيما يتعلق بتحسين التركيب الكيميائي ل CPPs لزيادة قدرتها على عبور الحاجز لأنه من الصعب اختراق أغشية خلايا متعددة15. وبالتالي ، فإن تطوير ناقلات جزيئية جديدة قادرة على اختراق الحواجز البيولوجية أمر مرغوب فيه بشدة لتعزيز كفاءة توصيل الدواء. في عام 2020 ، اكتشف Komin et al.16 CPP يسمى CL peptide ، والذي يحتوي على شكل حلزوني (RLLRLLR) وذيل بولي أرجينين (R7) لعبور الطبقة الأحادية الظهارية. كما تم تصنيع مجموعة من متغيرات الببتيد CL عن طريق تغيير النمط الحلزوني. يمكن أن يكون هذا الاستكشاف دليلا مهما لتطوير CPPs جديدة لتسليم الشحنات عبر الحواجز البيولوجية. علاوة على ذلك ، قام Dietrich et al. بتحسين نفاذية الخلية لببتيد StAX ، مما أدى إلى تثبيط مسار إشارات Wnt / β-catenin عن طريق زيادة الكارهة للماء الكلية للببتيدات17.
يعد التقييد المطابق للببتيدات الخطية غير المنظمة عن طريق التدوير طريقة فعالة لتعزيز استقرارها المحلل للبروتين ونفاذيتها18،19،20. يزيد التعزيز الهيكلي من مقاومة الأنزيم البروتيني للببتيدات الحلقية ، مما يجعلها أكثر استقرارا في الجسم الحي مقارنة بنظيراتها الخطية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يؤدي تدوير الببتيدات إلى إخفاء العمود الفقري للببتيد القطبي من خلال تعزيز الترابط الهيدروجيني داخل الجزيئات ، وبالتالي زيادة نفاذية الغشاء للببتيدات21. في العقدين الماضيين ، أصبحت طرق التدوير الكيميائي الانتقائي استراتيجيات فعالة لبناء الببتيدات الحلقية ذات البنى المختلفة ، مثل جميع الهيدروكربونات ، واللاكتام ، والتريازول ، و m-xylene ، والبيرفلورواريل ، وغيرها من الروابط المتقاطعة22,23. يمكن للحاجز البيولوجي الذي تفرضه البيئة المكروية المتطورة للورم أن يقلل من تغلغل الأدوية في الأورام الصلبة24. لقد وجدنا سابقا أن CPPs الدورية أظهرت مقاومة فائقة للهضم الأنزيمي على نظيراتهاالخطية 20. علاوة على ذلك ، فإن الكارهة للماء الكلية للببتيدات أمر بالغ الأهمية لتعزيز نفاذية الخلية22. بناء على الدراسات التي نوقشت أعلاه ، يمكن افتراض الجمع بين نمط موجب الشحنة ، وارتفاع الكارهة للماء بشكل عام ، وتعزيز استقرار التحلل البروتيني لزيادة نفاذية CPPs عبر الحواجز البيولوجية. في دراسة حديثة ، حددنا اثنين من CPPs الدورية مع وصلات متقاطعة عطرية في المواضع i و i + 7 التي تظهر نفاذية محسنة في الخلايا والأنسجة السرطانية مقارنة بنظيراتها الخطية15. هنا ، يتم تقديم بروتوكول اصطناعي موجز لتوليف CPPs الدورية ذات العلامات الفلورية والخطوات الرئيسية للتحقق من نفاذيتها.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-ethanedithiol</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>K1722093</td>
			<td>stench</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(7-Azobenzotriazole)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU)</td>
			<td>HEOWNS</td>
			<td>A-0443697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4,4&#39;-bis(bromomethyl)biphenyl</td>
			<td>TCI</td>
			<td>B1921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4T1 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>4T1 cells were cultured in DMEM medium supplemented with 10% FBS (Hyclone) in a 37 &#176;C humidified incubator containing 5% CO2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile&#160;</td>
			<td>Adamas</td>
			<td>1484971</td>
			<td>toxicity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Energy</td>
			<td>W330229</td>
			<td>skin harmful</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl ether</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>673811</td>
			<td>flammable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST038</td>
			<td>skin harmful</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrospray Ionization Mass Spectrometer</td>
			<td>Waters</td>
			<td>G2-S Tof</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA)</td>
			<td>BioFroxx</td>
			<td>1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>CytoFLEX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein isothiocyanate isomer (FITC)</td>
			<td>Energy</td>
			<td>E0801812500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Axio Observer 7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fmoc-Arg(Pbf)-OH</td>
			<td>HEOWNS</td>
			<td>F-81070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fmoc-Cys(Trt)-OH</td>
			<td>GL Biochem</td>
			<td>GLS201115-35202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fmoc-&#946;Ala-OH</td>
			<td>Adamas</td>
			<td>51341C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>HeLa cells were cultured in DMEM supplemented with 10% FBS (Hyclone) in a 37 &#176;C humidified incubator containing 5% CO2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Performance Liquid Chromatography</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Agilent 1260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Performance Liquid Chromatography column</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Poroshell EC-C18 120, 4.6 &#215; 150 mm (pore size 120 &#197;, particle size 4 &#956;m)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer</td>
			<td>SP Scientific</td>
			<td>Vir Tis</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>9758</td>
			<td>toxicity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtiter plate</td>
			<td>Thermo &#956;drop plate</td>
			<td>N12391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Morpholine</td>
			<td>HEOWNS</td>
			<td>M99040</td>
			<td>irritant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-technology microplate reader</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>VARIOSKAN LUX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-Diisopropylethylamine</td>
			<td>HEOWNS</td>
			<td>E-81416</td>
			<td>irritant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-Dimethyl formamide</td>
			<td>Energy</td>
			<td>B020051</td>
			<td>harmful to skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-Prep column</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7321010</td>
			<td>polypropylene chromatography columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rink Amide MBHA resin (0.572 mmol/g)</td>
			<td>GL Biochem</td>
			<td>GLS180301-49101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Three-way stopcocks</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7328107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plate insert</td>
			<td>LABSELECT</td>
			<td>14211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>HEOWNS</td>
			<td>T63278</td>
			<td>corrosive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triisopropylsilane</td>
			<td>HEOWNS</td>
			<td>T-0284475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>BioFroxx</td>
			<td>1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum manifold</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A7231</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

construction of cyclic cell-penetrating peptides for enhanced penetration of biological barriers

لقد كان السرطان تحديا كبيرا في مجال الصحة العالمية. ومع ذلك ، فإن البيئة المكروية المعقدة للورم تحد عموما من وصول العلاجات إلى الخلايا السرطانية العميقة ، مما يؤدي إلى تكرار الورم. للتغلب على الاختراق المحدود للحواجز البيولوجية ، تم اكتشاف الببتيدات المخترقة للخلايا (CPPs) بقدرة ممتازة على نقل الغشاء وظهرت كناقلات جزيئية مفيدة لتوصيل الشحنات المختلفة إلى الخلايا. ومع ذلك ، تظهر CPPs الخطية التقليدية عموما استقرارا محللا للبروتين ، مما يحد من نفاذيتها عبر الحواجز البيولوجية. وبالتالي ، فإن تطوير ناقلات جزيئية جديدة يمكنها اختراق الحواجز البيولوجية وإظهار استقرار محسن للبروتين أمر مرغوب فيه للغاية لتعزيز كفاءة توصيل الأدوية في التطبيقات الطبية الحيوية. لقد قمنا سابقا بتجميع لوحة من CPPs الدورية القصيرة مع روابط متقاطعة عطرية ، والتي أظهرت نفاذية فائقة في الخلايا والأنسجة السرطانية مقارنة بنظيراتها الخطية. هنا ، يتم وصف بروتوكول موجز لتوليف الببتيد البولي أرجينين R8 الدوري المسمى بالفلورسنت ونظيره الخطي ، بالإضافة إلى الخطوات الرئيسية للتحقيق في نفاذية الخلية.

في هذا البروتوكول ، تم تقديم إجراء اصطناعي لتقييد البوليارجينين الخطي R8 في شكله الدوري. تم إجراء SPPS يدويا باستخدام جهاز بسيط (الشكل 1). يظهر الشكل 2 العملية التركيبية التفصيلية ل SPPS. لفترة وجيزة ، تضخم الراتنج بما فيه الكفاية ، تليها إزالة الحماية م?...

Watch this Scientific Journal Video about Construction of Cyclic Cell-Penetrating Peptides for Enhanced Penetration of Biological Barriers at JoVE.com

Construction of Cyclic Cell-Penetrating Peptides for Enhanced Penetration of Biological Barriers

يصف هذا البروتوكول تخليق الببتيدات المخترقة للخلايا الحلقية مع الروابط المتقاطعة العطرية وتقييم نفاذيتها عبر الحواجز البيولوجية.

بناء الببتيدات الحلقية المخترقة للخلايا لتعزيز اختراق الحواجز البيولوجية

Cancer has been a grand challenge in global health. However, the complex tumor microenvironment generally limits the access of therapeutics to deeper ...

تتمثل إحدى العقبات الخطيرة أمام علاج السرطان في محدودية وصول العلاجات إلى الخلايا السرطانية العميقة بسبب الحواجز الفسيولوجية. وبالتالي ، فإن تطوير ناقلات جزيئية جديدة قادرة على معالجة الحواجز البيولوجية أمر مرغوب فيه بشدة لتعزيز كفاءة توصيل الدواء. الغرض من هذا الإجراء هو توليف الببتيدات الحلقية المخترقة للخلايا لتعزيز الاختراق من خلية إلى خلية.ميزة هذه الطريقة هي أنه يمكن تحقيق تدوير الببتيد بسهولة من خلال تفاعلات الاستبدال مع السيستين والراتنج دون الحاجة إلى أي محفزات معدنية. يؤدي دمج الروابط المتقاطعة العطرية إلى تحسين الكارهة للماء بشكل عام للببتيدات مقارنة بالوصلات المتقاطعة المحبة للماء أو التريازول ، وبالتالي تعزيز نفاذيتها. للبدء ، قم بتجميع جهاز تخليق الببتيد اليدوي في غطاء الدخان.ضع المحبس ثلاثي الاتجاهات على مشعب الفراغ وقم بتوصيله بالنيتروجين. تأكد من تغطية المداخل غير المستخدمة. قم بتوصيل عمود بولي بروبيلين سعة 10 ملليلتر على محبس ثلاثي الاتجاهات واستنزاف خليط التفاعل أو المذيبات من عمود البولي بروبلين باستخدام لمبة ماصة مطاطية أو فراغ عبر مصيدة نفايات.لتحضير الراتنج لتخليق الببتيد ، أضف 4 إلى 5 ملليلتر من DMF إلى الكمية المطلوبة من الراتنج وانقله إلى عمود البولي بروبلين مع فقاعات النيتروجين اللطيفة لمدة 30 دقيقة لتضخم الراتنج بشكل كاف. صفي DMF وأضيفي 4 إلى 5 ملليلتر من 50٪ مورفولين / DMF إلى الراتنج. ضع النيتروجين برفق لمدة 30 دقيقة لإزالة مجموعة Fmoc N-terminal ، ثم صفي الخليط.اغسل الراتنج جيدا ثلاث مرات عن طريق إضافة 4 إلى 5 ملليلتر من DMF إلى العمود والفقاعات بالنيتروجين لمدة 1 دقيقة على الأقل في كل مرة. بنفس الطريقة ، اغسل الراتنج بثنائي كلورو الميثان ثلاث مرات و DMF ثلاث مرات. بعد ذلك ، قم بإذابة 648.8 ملليغرام من الأرجينين المحمي من Fmoc و PBF و 372.6 ملليغرام من HATU في 5 ملليلتر من DMF في أنبوب طرد مركزي.أضف 348.4 ميكرولترا من DIPEA لتنشيط تفاعل الاقتران ، وانقل خليط التفاعل إلى عمود البولي بروبلين مع الراتنج. حرك الخليط برفق مع فقاعات النيتروجين لمدة 1-2 ساعة ، ثم كرر تفاعل الاقتران مرة واحدة. صفي خليط التفاعل واغسل الراتنج بالتتابع باستخدام DMF و dichlorromethane و DMF مرة أخرى ثلاث مرات لكل منهما لمدة 1 دقيقة على الأقل في كل مرة.قم بإزالة مجموعة حماية Fmoc واغسل الراتنج باتباع الإجراء الموضح سابقا قبل الشروع في إقران الحمض الأميني التالي. بعد ذلك ، قم بإقران بيتا ألانين كفاصل لوضع العلامات FITC باستخدام نفس العملية الموضحة لاقتران الأحماض الأمينية ، ثم أضف مزيجا من FITC و DIPEA و DMF إلى عمود البولي بروبلين في الظلام لأداء وضع علامات FITC على الببتيدات على الراتنج. سيستغرق رد الفعل حوالي 8 ساعات.لأداء تدوير الببتيد الخطي ، أضف مزيجا من حمض ثلاثي فلورو أسيتيك ، ثلاثي الأيزوبروبيل سيلان ، وثنائي كلورو ميثان إلى عمود البولي بروبلين لمدة 2 دقيقة لإزالة مجموعة السيستين التي تحمي الترتيل بشكل انتقائي. صفي الخليط وكرر الإجراء حتى يصبح المحلول المصفر عديم اللون لإزالة مجموعة حماية التريتيل تماما. قم بإجراء عمليات غسل متسلسلة للراتنج باستخدام DMF وثنائي كلورو الميثان ثلاث مرات على الأقل وقم بإذابة 4 ، 4'bis-bromomethyl-biphenyl في DMF مع DIPEA.أضف الحل إلى العمود وتفاعل لمدة 4 ساعات. اغسل الراتنج ب 4 إلى 5 ملليلتر من الميثانول مرتين لمدة خمس دقائق لكل منهما ، وجففه بتدفق مستمر من النيتروجين. بالنسبة للببتيدات التي تحتوي على السيستين ، عالج الراتنج بكوكتيل انشقاق فعال من حمض ثلاثي فلورو أسيتيك ، ثلاثي أيزوبروبيل سيلان ، والماء أو حمض ثلاثي فلورو أسيتيك ، ثلاثي أيزوبروبيل سيلان ، 1 ، 2-إيثانديثيول ، والماء.عالج الراتنج المرتبط بالببتيد لمدة 2 إلى 3 ساعات لشق الببتيد ، ثم قم بإزالة حمض ثلاثي فلورو أسيتيك بعناية باستخدام تيار من النيتروجين. للحصول على الببتيدات الخام ، أضف 4 إلى 5 ملليلتر من ثنائي إيثيل الأثير إلى تحضير الببتيد المشقوق لترسيب الببتيدات الخام ، وأجهزة الطرد المركزي عند 10،000 × جم لمدة 4 دقائق. تخلص بعناية من المادة الطافية وجفف الببتيد في الهواء لمدة 3 دقائق في غطاء دخان فعال.قم بإذابة الببتيد الخام صغير الحجم في 800 ميكرولتر من الأسيتونيتريل ، ثم قم بتحليله باستخدام كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء ذات طور عكسي وقياس الطيف الكتلي للكروماتوغرافيا السائلة. تلقيح 100،000 خلية هيلا في 2 ملليلتر من DMEM في غرفة ذات 12 بئرا مع إدخال لوحة زراعة الأنسجة ، واحتضانها لمدة 24 ساعة في حاضنة مرطبة 37 درجة مئوية تحتوي على 5٪ ثاني أكسيد الكربون. قم بإزالة الوسط واحتضان الخلايا في الغرف باستخدام 1 ملليلتر من 10 ميكرومولار FITC-R8 أو FITC-sR8-4 في DMEM الخالي من FBS لمدة ساعة واحدة.بعد ذلك ، قم بإزالة الوسط الذي يحتوي على الببتيدات وغسل الخلايا ثلاث مرات مع 1 ملليلتر من برنامج تلفزيوني. أضف 1 ملليلتر من DMEM الطازج الخالي من FBS إلى الغرف ، ثم شارك في احتضان خلايا HeLa في الغرفة مع إدخال لوحة زراعة الأنسجة ، مع خلايا HeLa على أغطية مستديرة في الأسفل لمدة 2 ساعة. ثبت خلايا HeLa على أغطية مستديرة بنسبة 2.5٪ جلوتارالدهيد لمدة 15 دقيقة ، ثم قم بتلطيخ الخلايا باستخدام DAPI لمدة 15 دقيقة.أخيرا ، راقب خلايا HeLa الموجودة على أغطية الغلاف تحت مجهر مضان. يتم تقديم رسم تخطيطي لتوليف الببتيد الخطي R8 المسمى FITC والببتيد R8 المسمى FITC هنا. يظهر في هذا الشكل أطياف HPLC و MS للببتيد الخطي R8 والببتيد R8 المدبس.كان وقت الاحتفاظ بالببتيد المدبس أطول بكثير من وقت التناظرية الخطية ، مما يشير إلى تعزيز الكارهة للماء بشكل عام للببتيد بعد الدوران باستخدام الوصلة المتقاطعة الكارهة للماء. تمثل هذه الصورة الرسومية استقرار الببتيد الخطي والببتيد المدبس في وجود 25٪ FBS. يظل R8 الدوري سليما بنسبة 77.3٪ بعد الحضانة مع FBS لمدة 4 ساعات ، في حين أن نظيره الخطي قد تدهور في الغالب ، مما يشير إلى تعزيز الاستقرار المحلل للبروتين للببتيد R8 الدوري.يتم عرض صور مجهرية مضان الخلية الحية لخلايا HeLa وخلايا 4T1 بعد حضانة لمدة ساعة واحدة مع 3 ميكرومولار من الببتيد الخطي R8 المسمى FITC وببتيد R8 المسمى FITC. يمكن ملاحظة أن الخلايا المعالجة ب R8 الدوري مع الارتباط المتقاطع العطري أظهرت مضانا داخل الخلايا أعلى من تلك التي عولجت بنظيرتها الخطية. تم الحصول على نتائج مماثلة مع تحليل التدفق الخلوي.لمزيد من التحقيق فيما إذا كان R8 الدوري يمنح اختراقا معززا من خلية إلى أخرى ، تم استخدام نماذج transwell لمحاكاة نفاذية حاجز الببتيدات من طبقة خلية إلى أخرى. أظهر R8 الدوري بوضوح تغلغلا أعلى عبر الحاجز من الببتيد الخطي R8 ، كما يتضح من الزيادة الكبيرة في التألق داخل الخلايا. يعد إزالة الحماية الكاملة لمجموعة trityl من السيستين والراتنج أمرا مهما لخطوة التدوير التالية.إلى جانب ذلك ، تعتمد كفاءة التدوير أيضا على التسلسلات المحددة وأطوال الببتيدات بسبب التأثيرات الستيرية. في مثل هذه الحالة ، سيكون من المفيد استخدام راتنج ذو قدرة تحميل أقل أو تدوير الببتيدات تحت تركيزات مخففة في مرحلة المحلول. أظهرت هذه الببتيدات الحلقية نفاذية محسنة من خلية إلى خلية مقارنة بنظيراتها الخطية.نعتقد أنها تحمل وعدا كبيرا للتغلب على الحواجز البيولوجية وسيتم استخدامها كجزيئي لمزيد من التطبيقات في مجال توصيل الأدوية.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Microwave-assisted Functionalization of Poly(ethylene glycol) and On-resin Peptides for Use in Chain Polymerizations and Hydrogel Formation

Microwave-assisted Functionalization of Polyethylene glycol and On-resin Peptides for Use in Chain Polymerizations and Hydrogel Formation

Functionalization بمساعدة الميكروويف بولي (جلايكول الإثيلين) وعلى الراتنج الببتيدات للاستخدام في سلسلة Polymerizations وتشكيل هيدروجيل

One of the main benefits to using poly(ethylene glycol) (PEG) macromers in hydrogel formation is synthetic versatility. The ability to draw from a large ...

Formation of Ordered Biomolecular Structures by the Self-assembly of Short Peptides

تشكيل الهياكل الجزيئية البيولوجية أمرت قبل التجميع الذاتي من الببتيدات قصير

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control ...

Preparation of Hydrophobic Metal-Organic Frameworks via Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition of Perfluoroalkanes for the Removal of Ammonia

إعداد أطر مسعور المعدنية العضوية عبر البلازما المحسن ترسيب الأبخرة الكيميائية من Perfluoroalkanes لإزالة الأمونيا

Plasma enhanced chemical vapor deposition (PECVD) of perfluoroalkanes has long been studied for tuning the wetting properties of surfaces. For high ...

Preparation of Highly Porous Coordination Polymer Coatings on Macroporous Polymer Monoliths for Enhanced Enrichment of Phosphopeptides

إعداد التنسيق المسامية العالية البوليمر طلاء البوليمر على ماكروبوروس كتل لتعزيز إثراء Phosphopeptides

We describe a protocol for the preparation of hybrid materials based on highly porous coordination polymer coatings on the internal surface of macroporous ...

A Filter-based Surface Enhanced Raman Spectroscopic Assay for Rapid Detection of Chemical Contaminants

تعليق السطح القائم على تصفية المحسن رامان الطيفي الفحص للكشف السريع من الملوثات الكيميائية

We demonstrate a method to fabricate highly sensitive surface-enhanced Raman spectroscopic (SERS) substrates using a filter syringe system that can be ...

Construction of Models for Nondestructive Prediction of Ingredient Contents in Blueberries by Near-infrared Spectroscopy Based on HPLC Measurements

بناء نماذج التنبؤ تدميري من مكونات المحتويات في العنب البري بواسطة التحليل الطيفي القريبة من الأشعة تحت الحمراء بناء على قياسات HPLC

Nondestructive prediction of ingredient contents of farm products is useful to ship and sell the products with guaranteed qualities. Here, near-infrared ...

Synthesis of Cyclic Polymers and Characterization of Their Diffusive Motion in the Melt State at the Single Molecule Level

توليف دوري البوليمرات وتوصيف تلك الحركة ناشر في الدولة تذوب في واحدة جزيء مستوى

We demonstrate a method for the synthesis of cyclic polymers and a protocol for characterizing their diffusive motion in a melt state at the single ...

Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy

نظرة ثاقبة لتفاعلات الأحماض الأمينية والببتيدات مع المواد غير العضوية عن طريق جزيء واحدة قوة التحليل الطيفي

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals ...

Observation and Analysis of Blinking Surface-enhanced Raman Scattering

المراقبة والتحليل من تطرف تشتت رامان المزودة بسطح

From a single molecule at a silver nanoaggregate junction, blinking surface-enhanced Raman scattering (SERS) is observed. Here, a protocol is presented on ...