Name: construction of cyclic cell-penetrating peptides for enhanced penetration of biological barriers
Uploaded: 2022-09-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Construction of Cyclic Cell-Penetrating Peptides for Enhanced Penetration of Biological Barriers at JoVE.com

Dette arbejde støttes af Natural Science Foundation of China (21708031), China Postdoctoral Science Foundation (BX20180264, 2018M643519) og Fundamental Research Funds for the Central Universities (2682021ZTPY075).

1. Forberedelse af udstyr
BEMÆRK: Udfør alle procedurer i en fungerende stinkhætte med passende personlige værnemidler.
<ol><li>Det manuelle peptidsynteseapparat samles i stinkhætten (figur 1). Trevejs stophanerne (se Materialetabel) anbringes på vakuummanifolden (se Materialetabel) og forbindes til nitrogenet (N2). Sørg for at begrænse de ubrugte indtag.</li>
	<li>Fastgør en 10 ml polypropyl...

<ol>
	<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-targeted+dual+site-selective+functionalized+poly(&#946;-amino+esters)+delivery+platform+for+nerve+regeneration.">Brain-targeted dual site-selective functionalized poly(&#946;-amino esters) delivery platform for nerve regeneration.</a> Nano Letters. 21 (7), 3007-3015 (2021).</li><li>Park, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+BBB+permeability+of+osmotically+active+poly(mannitol-co-PEI)+modified+with+rabies+virus+glycoprotein+via+selective+stimulation+of+caveolar+endocytosis+for+RNAi+therapeutics+in+Alzheimer's+disease.">Enhanced BBB permeability of osmotically active poly(mannitol-co-PEI) modified with rabies virus glycoprotein via selective stimulation of caveolar endocytosis for RNAi therapeutics in Alzheimer's disease.</a> Biomaterials. 38, 61-71 (2015).</li><li>Bian, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+cell-based+intercellular+delivery+of+transcription+factor+GATA4+on+ischemic+cardiomyopathy.">Effect of cell-based intercellular delivery of transcription factor GATA4 on ischemic cardiomyopathy.</a> Circulation Research. 100 (11), 1626-1633 (2007).</li><li>He, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+low+molecular+weight+protamine+chemical+chimera+to+enhance+monomeric+insulin+intestinal+absorption.">The use of low molecular weight protamine chemical chimera to enhance monomeric insulin intestinal absorption.</a> Biomaterials. 34 (31), 7733-7743 (2013).</li><li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+specific+STAT3-binding+peptide+exerts+antiproliferative+effects+and+antitumor+activity+by+inhibiting+STAT3+phosphorylation+and+signaling.">A specific STAT3-binding peptide exerts antiproliferative effects and antitumor activity by inhibiting STAT3 phosphorylation and signaling.</a> Cancer Research. 74 (8), 2144-2151 (2014).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEGylated+liposomes+with+NGR+ligand+and+heat-activable+cell-penetrating+peptide-doxorubicin+conjugate+for+tumor-specific+therapy.">PEGylated liposomes with NGR ligand and heat-activable cell-penetrating peptide-doxorubicin conjugate for tumor-specific therapy.</a> Biomaterials. 35 (14), 4368-4381 (2014).</li><li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+paclitaxel+delivery+facilitated+by+a+dual-functional+CPP+with+a+hydrophobic+hairpin+tail.">Intracellular paclitaxel delivery facilitated by a dual-functional CPP with a hydrophobic hairpin tail.</a> ACS Applied Materials and Interfaces. 13 (4), 4853-4860 (2021).</li><li>Vasan, N., Baselga, J., Hyman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+view+on+drug+resistance+in+cancer.">A view on drug resistance in cancer.</a> Nature. 575 (7782), 299-309 (2019).</li><li>Cong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironment-induced+in+situ+self-assembly+of+polymer-peptide+conjugates+that+attack+solid+tumors+deeply.">Microenvironment-induced in situ self-assembly of polymer-peptide conjugates that attack solid tumors deeply.</a> Angewandte Chemie International Edition. 131 (14), 4680-4685 (2019).</li><li>Blanco, E., Shen, H., Ferrari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+nanoparticle+design+for+overcoming+biological+barriers+to+drug+delivery.">Principles of nanoparticle design for overcoming biological barriers to drug delivery.</a> Nature Biotechnology. 33 (9), 941-951 (2015).</li><li>Tian, Y., Zhou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+cell-penetrating+peptides+and+their+functionalization+of+polymeric+nanoplatforms+for+drug+delivery.">Advances in cell-penetrating peptides and their functionalization of polymeric nanoplatforms for drug delivery.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. Nanomedicine and Nanobiotechnology. 13 (2), 1-12 (2021).</li><li>Milletti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-penetrating+peptides:+Classes,+origin,+and+current+landscape.">Cell-penetrating peptides: Classes, origin, and current landscape.</a> Drug Discovery Today. 17 (15-16), 850-860 (2012).</li><li>Turner, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-penetrating+peptide+conjugates+of+peptide+nucleic+acids+(PNA)+as+inhibitors+of+HIV-1+Tat-dependent+trans-activation+in+cells.">Cell-penetrating peptide conjugates of peptide nucleic acids (PNA) as inhibitors of HIV-1 Tat-dependent trans-activation in cells.</a> Nucleic Acids Research. 33 (21), 6837-6849 (2005).</li><li>Tunnemann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+analysis+of+cell+penetration+ability+and+toxicity+of+oligo-arginines.">Live-cell analysis of cell penetration ability and toxicity of oligo-arginines.</a> Journal of Peptide Science. 14 (4), 469-476 (2008).</li><li>Shi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stapling+of+short+cell-penetrating+peptides+for+enhanced+tumor+cell-and-tissue+dual-penetration.">Stapling of short cell-penetrating peptides for enhanced tumor cell-and-tissue dual-penetration.</a> Chemical Communications. 58 (14), 2299-2302 (2022).</li><li>Komin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+peptide+for+transcellular+cargo+delivery:+Structure-function+relationship+and+mechanism+of+action.">A peptide for transcellular cargo delivery: Structure-function relationship and mechanism of action.</a> Journal of Controlled Release. 324, 633-643 (2020).</li><li>Dietrich, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+permeable+stapled+peptide+inhibitor+of+Wnt+signaling+that+targets+&#946;-catenin+protein-protein+interactions.">Cell permeable stapled peptide inhibitor of Wnt signaling that targets &#946;-catenin protein-protein interactions.</a> Cell Chemical Biology. 24 (8), 958-968 (2017).</li><li>Tian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stapling+of+unprotected+helical+peptides+via+photo-induced+intramolecular+thiol-yne+hydrothiolation.">Stapling of unprotected helical peptides via photo-induced intramolecular thiol-yne hydrothiolation.</a> Chemical Science. 7 (5), 3325-3330 (2016).</li><li>De Araujo, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+&#945;-helicity+of+cyclic+pentapeptides+in+water.">Comparative &#945;-helicity of cyclic pentapeptides in water.</a> Angewandte Chemie International Edition. 53 (27), 6965-6969 (2014).</li><li>Chu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+understanding+cell+penetration+by+stapled+peptides.">Towards understanding cell penetration by stapled peptides.</a> Medicinal Chemistry Communications. 6 (1), 111-119 (2015).</li><li>Bock, J. E., Gavenonis, J., Kritzer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+in+shape:+Controlling+peptide+bioactivity+and+bioavailability+using+conformational+constraints.">Getting in shape: Controlling peptide bioactivity and bioavailability using conformational constraints.</a> ACS Chemical Biology. 8 (3), 488-499 (2013).</li><li>Tian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+stapling+architecture+on+physiochemical+properties+and+cell+permeability+of+stapled+&#945;-helical+peptides:+A+comparative+study.">Effect of stapling architecture on physiochemical properties and cell permeability of stapled &#945;-helical peptides: A comparative study.</a> ChemBioChem. 18 (21), 2087-2093 (2017).</li><li>White, C. J., Yudin, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contemporary+strategies+for+peptide+macrocyclization.">Contemporary strategies for peptide macrocyclization.</a> Nature Chemistry. 3 (7), 509-524 (2011).</li><li>Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalization+of+tumor+vasculature:+An+emerging+concept+in+antiangiogenic+therapy.">Normalization of tumor vasculature: An emerging concept in antiangiogenic therapy.</a> Science. 307 (5706), 58-62 (2005).</li><li>Patgiri, A., Menzenski, M. Z., Mahon, A. B., Arora, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-phase+synthesis+of+short+&#945;-helices+stabilized+by+the+hydrogen+bond+surrogate+approach.">Solid-phase synthesis of short &#945;-helices stabilized by the hydrogen bond surrogate approach.</a> Nature Protocols. 5 (11), 1857-1865 (2010).</li><li>Baek, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+stapled+p53+peptide+bound+to+Mdm2.">Structure of the stapled p53 peptide bound to Mdm2.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (1), 103-106 (2012).</li><li>Traboulsi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrocyclic+cell+penetrating+peptides:+A+study+of+structure-penetration+properties.">Macrocyclic cell penetrating peptides: A study of structure-penetration properties.</a> Bioconjugate Chemistry. 26 (3), 405-411 (2015).</li><li>Tian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proline-derived+transannular+N-cap+for+nucleation+of+short+&#945;-helical+peptides.">A proline-derived transannular N-cap for nucleation of short &#945;-helical peptides.</a> Chemical Communications. 52 (59), 9275-9278 (2016).</li><li>Muppidi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+proteolytically+stable,+cell-permeable+peptide-based+selective+Mcl-1+inhibitors.">Rational design of proteolytically stable, cell-permeable peptide-based selective Mcl-1 inhibitors.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (36), 14734-14737 (2012).</li><li>Wiradharma, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+cationic+amphiphilic+&#945;-helical+peptides+as+antimicrobial+agents.">Synthetic cationic amphiphilic &#945;-helical peptides as antimicrobial agents.</a> Biomaterials. 32 (8), 2204-2212 (2011).</li><li>Jones, A. T., Sayers, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+entry+of+cell+penetrating+peptides:+Tales+of+tails+wagging+dogs.">Cell entry of cell penetrating peptides: Tales of tails wagging dogs.</a> Journal of Controlled Release. 161 (2), 582-591 (2012).</li></ol>

Den kemiske stabilisering af peptider ved at inkorporere konformationelle begrænsninger har vist sig at være en effektiv strategi til forbedring af peptidets stabilitet og cellepermeabilitet26. I denne protokol beskrives en trinvis procedure for syntese af cykliske CPP'er med aromatiske tværbindinger og evaluering af deres permeabilitet på tværs af biologiske barrierer. Sammenlignet med de hydrofile lactam- eller triazol-tværbindinger22,27...

De sidste par årtier har været vidne til hurtige fremskridt i udviklingen af cellepenetrerende peptider (CPP'er) til lægemiddelafgivelse. CPP'er er blevet anvendt i vid udstrækning som molekylære transportører til behandling af en række livstruende sygdomme, herunder neurologiske lidelser1,2, hjertesygdomme3, diabetes4, dermatose5 og kræft 6,7. Kræft er fortsat en global sundhedsbyrde ledsaget af en høj sygelighed og dødelighed på trods af en omfattende forskningsindsats8. En alvorlig hindring for behandling af kræft er den begrænsede adgang til terapi til dybere tumorceller på grund af fysiologiske barrierer såsom kompakt ekstracellulær matrix (ECM), unormal tumorvaskulatur, flere membranbarrierer og højt interstitielt væsketryk (IFP)9. Udvikling af nye CPP'er med overlegen evne til at levere last på tværs af biologiske barrierer betragtes således som en væsentlig strategi for kræftbehandling10,11.
CPP'er kan kategoriseres i kationiske, amfipatiske og hydrofobe CPP'er med hensyn til deres fysisk-kemiske egenskaber12. Blandt disse er det positivt ladede HIV-TAT-peptid og det syntetiske polyarginin af stor betydning i biomedicinsk forskning og er blevet grundigt undersøgt for at lette intracellulær lægemiddelafgivelse13. Tunnemann et al. rapporterede, at en minimumslængde på otte argininer er afgørende for effektiv cellepenetration af de syntetiske polyargininpeptider, baseret på en cellepermeabilitetsundersøgelse udført under anvendelse af R3 til R12 peptider14. Imidlertid har disse CPP'er generelt korte plasmahalveringstider på grund af deres hurtige hydrolyse in vivo. Derudover er der lidt kendt om optimering af den kemiske struktur af CPP'er for at øge deres transbarriereevne, da det er udfordrende at trænge ind i flere cellemembraner15. Udviklingen af nye molekylære transportører, der er i stand til at trænge igennem biologiske barrierer, er således stærkt ønsket for at forbedre lægemiddelleveringseffektiviteten. I 2020 opdagede Komin et al.16 en CPP kaldet CL-peptid, som indeholder et helixmotiv (RLLRLLR) og en polyargininhale (R7) til krydsning af epitelmonolaget. Et sæt CL-peptidvarianter blev også syntetiseret ved at ændre det spiralformede mønster. Denne undersøgelse kunne være en vigtig rettesnor for udviklingen af nye CPP'er til levering af last på tværs af biologiske barrierer. Desuden optimerede Dietrich et al. cellepermeabiliteten af StAX-peptidet og hæmmede Wnt/β-catenin-signalvejen ved at øge peptidernes samlede hydrofobicitet17.
Konformationsbegrænsning af ustrukturerede lineære peptider ved cyklisering er en effektiv måde at forbedre deres proteolytiske stabilitet og permeabilitet18,19,20. Den strukturelle forstærkning øger proteaseresistensen af cykliske peptider, hvilket gør dem mere stabile in vivo sammenlignet med deres lineære modstykker. Derudover kan cykliseringen af peptider potentielt maskere den polære peptidrygrad ved at fremme intramolekylær hydrogenbinding og dermed øge peptidernes membranpermeabilitet21. I de sidste to årtier er kemoselektive cykliseringsmetoder blevet effektive strategier til konstruktion af cykliske peptider med forskellige arkitekturer, såsom carbonhydrid, lactam, triazol, m-xylen, perfluoraryl og andre tværbindinger22,23. Den biologiske barriere, der pålægges af det sofistikerede tumormikromiljø, kan reducere penetrationen af lægemidler i faste tumorer24. Vi har tidligere fundet, at de cykliske CPP'er viste overlegen modstand mod enzymatisk fordøjelse i forhold til deres lineære modstykker20. Desuden er peptidernes samlede hydrofobicitet afgørende for deres forbedrede cellepermeabilitet22. Baseret på de ovenfor diskuterede undersøgelser kan kombinationen af et positivt ladet mønster, forhøjet samlet hydrofobicitet og forbedret proteolysestabilitet antages at øge permeabiliteten af CPP'er på tværs af biologiske barrierer. I en nylig undersøgelse identificerede vi to cykliske CPP'er med aromatiske tværbindinger på positionerne i og i + 7, der udviser forbedret permeabilitet i tumorceller og væv sammenlignet med deres lineære modstykker15. Her præsenteres en kortfattet syntetisk protokol til syntese af fluorescerende mærkede cykliske CPP'er og de vigtigste trin til at undersøge deres permeabilitet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-ethanedithiol</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>K1722093</td>
			<td>stench</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(7-Azobenzotriazole)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU)</td>
			<td>HEOWNS</td>
			<td>A-0443697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4,4&#39;-bis(bromomethyl)biphenyl</td>
			<td>TCI</td>
			<td>B1921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4T1 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>4T1 cells were cultured in DMEM medium supplemented with 10% FBS (Hyclone) in a 37 &#176;C humidified incubator containing 5% CO2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile&#160;</td>
			<td>Adamas</td>
			<td>1484971</td>
			<td>toxicity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Energy</td>
			<td>W330229</td>
			<td>skin harmful</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl ether</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>673811</td>
			<td>flammable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST038</td>
			<td>skin harmful</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrospray Ionization Mass Spectrometer</td>
			<td>Waters</td>
			<td>G2-S Tof</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA)</td>
			<td>BioFroxx</td>
			<td>1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>CytoFLEX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein isothiocyanate isomer (FITC)</td>
			<td>Energy</td>
			<td>E0801812500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Axio Observer 7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fmoc-Arg(Pbf)-OH</td>
			<td>HEOWNS</td>
			<td>F-81070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fmoc-Cys(Trt)-OH</td>
			<td>GL Biochem</td>
			<td>GLS201115-35202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fmoc-&#946;Ala-OH</td>
			<td>Adamas</td>
			<td>51341C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>HeLa cells were cultured in DMEM supplemented with 10% FBS (Hyclone) in a 37 &#176;C humidified incubator containing 5% CO2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Performance Liquid Chromatography</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Agilent 1260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Performance Liquid Chromatography column</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Poroshell EC-C18 120, 4.6 &#215; 150 mm (pore size 120 &#197;, particle size 4 &#956;m)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer</td>
			<td>SP Scientific</td>
			<td>Vir Tis</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>9758</td>
			<td>toxicity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtiter plate</td>
			<td>Thermo &#956;drop plate</td>
			<td>N12391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Morpholine</td>
			<td>HEOWNS</td>
			<td>M99040</td>
			<td>irritant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-technology microplate reader</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>VARIOSKAN LUX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-Diisopropylethylamine</td>
			<td>HEOWNS</td>
			<td>E-81416</td>
			<td>irritant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-Dimethyl formamide</td>
			<td>Energy</td>
			<td>B020051</td>
			<td>harmful to skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-Prep column</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7321010</td>
			<td>polypropylene chromatography columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rink Amide MBHA resin (0.572 mmol/g)</td>
			<td>GL Biochem</td>
			<td>GLS180301-49101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Three-way stopcocks</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7328107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plate insert</td>
			<td>LABSELECT</td>
			<td>14211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>HEOWNS</td>
			<td>T63278</td>
			<td>corrosive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triisopropylsilane</td>
			<td>HEOWNS</td>
			<td>T-0284475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>BioFroxx</td>
			<td>1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum manifold</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A7231</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

construction of cyclic cell-penetrating peptides for enhanced penetration of biological barriers

Kræft har været en stor udfordring i den globale sundhed. Imidlertid begrænser det komplekse tumormikromiljø generelt adgangen til terapi til dybere tumorceller, hvilket fører til tumorgentagelse. For at overvinde den begrænsede penetration af biologiske barrierer er cellepenetrerende peptider (CPP'er) blevet opdaget med fremragende membrantranslokationsevne og har vist sig som nyttige molekylære transportører til levering af forskellige laster i celler. Imidlertid viser konventionelle lineære CPP'er generelt kompromitteret proteolytisk stabilitet, hvilket begrænser deres permeabilitet på tværs af biologiske barrierer. Udviklingen af nye molekylære transportører, der kan trænge igennem biologiske barrierer og udvise forbedret proteolytisk stabilitet, er således meget ønsket for at fremme lægemiddelleveringseffektivitet i biomedicinske applikationer. Vi har tidligere syntetiseret et panel af korte cykliske CPP'er med aromatiske tværbindinger, som udviste overlegen permeabilitet i kræftceller og væv sammenlignet med deres lineære modstykker. Her beskrives en kortfattet protokol til syntese af det fluorescerende mærkede cykliske polyarginin R8-peptid og dets lineære modstykke samt nøgletrin til undersøgelse af deres cellepermeabilitet.

I denne protokol blev en syntetisk procedure til at begrænse den lineære polyarginin R8 til sin cykliske form præsenteret. SPPS blev udført manuelt ved hjælp af et simpelt apparat (figur 1). Den detaljerede syntetiske proces af SPPS er vist i figur 2. Kort fortalt var harpiksen tilstrækkeligt opsvulmet, efterfulgt af debeskyttelse af N α-Fmoc beskyttelsesgruppen. Derefter blev den N α-Fmoc-beskyttede aminosyre forankret på ha...

Watch this Scientific Journal Video about Construction of Cyclic Cell-Penetrating Peptides for Enhanced Penetration of Biological Barriers at JoVE.com

Construction of Cyclic Cell-Penetrating Peptides for Enhanced Penetration of Biological Barriers

Denne protokol beskriver syntesen af cykliske cellepenetrerende peptider med aromatiske tværbindinger og evalueringen af deres permeabilitet på tværs af biologiske barrierer.

Konstruktion af cykliske cellepenetrerende peptider til forbedret penetration af biologiske barrierer

Cancer has been a grand challenge in global health. However, the complex tumor microenvironment generally limits the access of therapeutics to deeper ...

En alvorlig hindring for kræftbehandling er den begrænsede adgang til terapi til dybere tumorceller på grund af fysiologiske barrierer. Udviklingen af nye molekylære transportører, der er i stand til at behandle biologiske barrierer, er således stærkt ønsket for at forbedre lægemiddelleveringseffektiviteten. Formålet med denne procedure er at syntetisere de cykliske cellepenetrerende peptider til forbedret celle-til-celle-penetration.Fordelen ved denne metode er, at peptidcykliseringen let kan opnås gennem substitutionsreaktioner med cysteiner og harpiks uden at kræve metalkatalysatorer. Inkorporeringen af aromatiske tværbindinger forbedrer peptidernes samlede hydrofobicitet sammenlignet med de hydrofile lactam- eller triazol-tværbindinger og forbedrer derved deres permeabilitet. Til at begynde med samles det manuelle peptidsynteseapparat i damphætten.Placer trevejs stophanerne på vakuummanifolden, og tilslut dem til nitrogen. Sørg for at begrænse de ubrugte indtag. Fastgør en 10 ml polypropylensøjle på trevejsstophanerne, og dræn reaktionsblandingen eller opløsningsmidlerne fra polypropylensøjlen ved hjælp af en gummipipettepære eller et vakuum via en affaldsfælde.For at forberede harpiksen til peptidsyntese tilsættes 4 til 5 ml DMF til den krævede mængde harpiks og overføres til polypropylensøjlen med blid nitrogenboblende i 30 minutter for at svulme harpiksen tilstrækkeligt. Tøm DMF og tilsæt 4 til 5 ml 50% morpholin / DMF til harpiksen. Boble forsigtigt nitrogen i 30 minutter for at fjerne den N-terminale Fmoc-gruppe, og tøm derefter blandingen.Vask harpiksen grundigt tre gange ved at tilsætte 4 til 5 ml DMF til søjlen og boble med nitrogen i mindst 1 minut hver gang. På samme måde vaskes harpiksen med dichlormethan tre gange og DMF tre gange. Derefter opløses 648,8 milligram Fmoc og PBF-beskyttet arginin og 372,6 milligram HATU i 5 ml DMF i et centrifugerør.Tilsæt 348,4 mikroliter DIPEA for at aktivere koblingsreaktionen, og overfør reaktionsblandingen til polypropylensøjlen med harpiks. Omrør forsigtigt blandingen med nitrogenboblende i 1 til 2 timer, og gentag derefter koblingsreaktionen en gang. Tøm reaktionsblandingen og vask harpiksen sekventielt med DMF, dichlormethan og igen DMF tre gange hver i mindst 1 minut hver gang.Fjern den Fmoc-beskyttende gruppe og vask harpiksen efter proceduren vist tidligere, før du fortsætter med at parre den næste aminosyre. Derefter parres beta-alanin som afstandsstykke til FITC-mærkning ved hjælp af den samme proces, der er vist for aminosyrekobling, og tilsæt derefter en blanding af FITC, DIPEA og DMF til polypropylensøjlen i mørke for at udføre FITC-mærkning af peptider på harpiksen. Reaktionen ville tage næsten 8 timer.For at udføre cykliseringen af det lineære peptid tilsættes en blanding af trifluoreddikesyre, triisopropylsilan og dichlormethan til polypropylensøjlen i 2 minutter for selektivt at fjerne den tritylbeskyttende gruppe af cystein. Tøm blandingen og gentag proceduren, indtil den gullige opløsning bliver farveløs for helt at fjerne den tritylbeskyttende gruppe. Udfør sekventielle skylninger af harpiksen med DMF og dichlormethan mindst tre gange, og opløs 4, 4'bis-brommethylbiphenyl i DMF med DIPEA.Tilsæt opløsningen til kolonnen og reager i 4 timer. Vask harpiksen med 4 til 5 ml methanol to gange i fem minutter hver, og tør den med en kontinuerlig strøm af nitrogen. For peptider indeholdende cysteiner behandles harpiksen med en effektiv spaltningscocktail af trifluoreddikesyre, triisopropylsilan og vand eller trifluoreddikesyre, triisopropylsilan, 1, 2-ethanedithiol og vand.Behandl den peptidbundne harpiks i 2 til 3 timer for at spalte peptidet, og fjern derefter trifluoreddikesyren forsigtigt med en nitrogenstrøm. For at opnå de rå peptider tilsættes 4 til 5 ml diethylether til det spaltede peptidpræparat for at udfælde de rå peptider og centrifugeres ved 10.000 x g i 4 minutter. Supernatanten kasseres forsigtigt, og peptidet lufttørres i 3 minutter i en effektiv stinkhætte.Opløs det lille rå peptid i 800 mikroliter acetonitril, og analyser det derefter ved hjælp af omvendt fase højtydende væskekromatografi og væskekromatografi-massespektrometri. Inokulere 100.000 HeLa-celler i 2 ml DMEM i et 12-brøndkammer med en vævskulturpladeindsats og inkubere i 24 timer i en 37 grader Celsius befugtet inkubator indeholdende 5% kuldioxid. Fjern mediet og inkuber cellerne i kamrene med 1 ml 10 mikromolær FITC-R8 eller FITC-sR8-4 i FBS-fri DMEM i 1 time.Derefter fjernes mediet indeholdende peptiderne og vaskes cellerne tre gange med 1 ml PBS. Tilsæt 1 milliliter frisk FBS-fri DMEM til kamrene, og inkuber derefter HeLa-cellerne i kammeret med vævskulturpladeindsatsen, med HeLa-cellerne på de runde dæksedler i bunden i 2 timer. Fastgør HeLa-cellerne på de runde dæksler med 2,5% glutaraldehyd i 15 minutter, og pletter derefter cellerne med DAPI i 15 minutter.Endelig skal du observere HeLa-cellerne på dæksedlerne under et fluorescensmikroskop. Et skematisk diagram over syntesen af FITC-mærket lineært R8-peptid og FITC-mærket hæftet R8-peptid præsenteres her. HPLC- og MS-spektrene for det lineære R8-peptid og det hæftede R8-peptid er vist i denne figur.Retentionstiden for det hæftede peptid var væsentligt længere end for den lineære analog, hvilket indikerer en forbedret samlet hydrofobicitet af peptidet efter cyklisering med den hydrofobe tværbinding. Dette grafiske billede repræsenterer stabiliteten af det lineære peptid og det hæftede peptid i nærværelse af 25%FBS. Den cykliske R8 forbliver 77,3% intakt efter inkubation med FBS i 4 timer, mens dens lineære modstykke for det meste blev nedbrudt, hvilket tyder på forbedret proteolytisk stabilitet af det cykliske R8-peptid.Live-celle fluorescens mikroskopi billeder af HeLa celler og 4T1 celler efter 1 times inkubation med 3 mikromolære FITC-mærkede lineære R8 peptid og FITC-mærket hæftet R8 peptid er vist her. Det kan ses, at cellerne behandlet med cyklisk R8 med aromatisk tværbinding udviste højere intracellulær fluorescens end dem, der blev behandlet med deres lineære modstykke. Lignende resultater blev opnået med flowcytometrianalyse.For yderligere at undersøge, om cyklisk R8 giver forbedret celle-til-celle-penetration, blev transwell-modeller brugt til at simulere peptidernes barrierepermeabilitet fra et cellelag til et andet. Den cykliske R8 udviste klart højere transbarrierepenetration end det lineære R8-peptid, hvilket indikeres af en signifikant stigning i intracellulær fluorescens. Fuldstændig debeskyttelse af tritylgruppen af cystein og harpiks er vigtig for det følgende cykliseringstrin.Desuden afhænger cykliseringseffektiviteten også af de specifikke sekvenser og længden af peptiderne på grund af steriske virkninger. I et sådant tilfælde ville det være nyttigt at anvende en harpiks med lavere belastningskapacitet eller cyklisering peptiderne under fortyndede koncentrationer i opløsningsfasen. Disse cykliske peptider viste en forbedret celle-til-celle-permeabilitet sammenlignet med deres lineære modstykker.Vi mener, at de har et stort løfte om at overvinde biologiske barrierer og vil blive brugt til et molekylært stof til yderligere anvendelser inden for lægemiddellevering.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Microwave-assisted Functionalization of Poly(ethylene glycol) and On-resin Peptides for Use in Chain Polymerizations and Hydrogel Formation

Microwave-assisted Functionalization of Polyethylene glycol and On-resin Peptides for Use in Chain Polymerizations and Hydrogel Formation

Microwave-assisteret Funktionalisering af poly (ethylenglycol) og On-harpiks peptider til i Chain Polymeriseringer og Hydrogel Dannelse

One of the main benefits to using poly(ethylene glycol) (PEG) macromers in hydrogel formation is synthetic versatility. The ability to draw from a large ...

Formation of Ordered Biomolecular Structures by the Self-assembly of Short Peptides

Dannelse af Bestilte Biomolekylær Strukturer af Self-samling af korte peptider

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control ...

Preparation of Hydrophobic Metal-Organic Frameworks via Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition of Perfluoroalkanes for the Removal of Ammonia

Udarbejdelse af Hydrofobe Metal-Organic Frameworks via Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition af perfluoralkaner til fjernelse af ammoniak

Plasma enhanced chemical vapor deposition (PECVD) of perfluoroalkanes has long been studied for tuning the wetting properties of surfaces. For high ...

Preparation of Highly Porous Coordination Polymer Coatings on Macroporous Polymer Monoliths for Enhanced Enrichment of Phosphopeptides

Udarbejdelse af meget porøse Koordinering Polymer Belægninger på Makroporøse Polymer Monoliths for styrkede Berigelse af phosphopeptider

We describe a protocol for the preparation of hybrid materials based on highly porous coordination polymer coatings on the internal surface of macroporous ...

A Filter-based Surface Enhanced Raman Spectroscopic Assay for Rapid Detection of Chemical Contaminants

En Filter-baserede Surface Enhanced Raman Spektroskopiske Assay til Rapid detektering af kemiske forureninger

We demonstrate a method to fabricate highly sensitive surface-enhanced Raman spectroscopic (SERS) substrates using a filter syringe system that can be ...

Construction of Models for Nondestructive Prediction of Ingredient Contents in Blueberries by Near-infrared Spectroscopy Based on HPLC Measurements

Konstruktion af Modeller for destruktiv Forudsigelse af indholdsstof Indhold i Blåbær ved Near-infrarød spektroskopi Baseret på HPLC Målinger

Nondestructive prediction of ingredient contents of farm products is useful to ship and sell the products with guaranteed qualities. Here, near-infrared ...

Synthesis of Cyclic Polymers and Characterization of Their Diffusive Motion in the Melt State at the Single Molecule Level

Syntese af cycliske polymere og karakterisering af deres diffusive Motion i Melt stat på det indre Molecule Level

We demonstrate a method for the synthesis of cyclic polymers and a protocol for characterizing their diffusive motion in a melt state at the single ...

Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy

Indsigt i samspillet mellem aminosyrer og peptider med uorganiske materialer Brug Single-Molecule force spektroskopi

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals ...

Observation and Analysis of Blinking Surface-enhanced Raman Scattering

Observation og analyse af blinkende overflade-forstærket Raman spredning

From a single molecule at a silver nanoaggregate junction, blinking surface-enhanced Raman scattering (SERS) is observed. Here, a protocol is presented on ...