Name: construction of cyclic cell-penetrating peptides for enhanced penetration of biological barriers
Uploaded: 2022-09-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Construction of Cyclic Cell-Penetrating Peptides for Enhanced Penetration of Biological Barriers at JoVE.com

Dit werk wordt ondersteund door de Natural Science Foundation of China (21708031), China Postdoctoral Science Foundation (BX20180264, 2018M643519) en de Fundamental Research Funds for the Central Universities (2682021ZTPY075).

1. Voorbereiding van de apparatuur
OPMERKING: Voer alle procedures uit in een werkende zuurkast met geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen.
<ol><li>Monteer het handmatige peptidesyntheseapparaat in de zuurkast (figuur 1). Plaats de driewegkranen (zie materiaaltabel) op het vacuümspruitstuk (zie materiaaltabel) en sluit aan op de stikstof (N2). Zorg ervoor dat u de ongebruikte inlaten afsluit.</l...

<ol>
	<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-targeted+dual+site-selective+functionalized+poly(&#946;-amino+esters)+delivery+platform+for+nerve+regeneration.">Brain-targeted dual site-selective functionalized poly(&#946;-amino esters) delivery platform for nerve regeneration.</a> Nano Letters. 21 (7), 3007-3015 (2021).</li><li>Park, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+BBB+permeability+of+osmotically+active+poly(mannitol-co-PEI)+modified+with+rabies+virus+glycoprotein+via+selective+stimulation+of+caveolar+endocytosis+for+RNAi+therapeutics+in+Alzheimer's+disease.">Enhanced BBB permeability of osmotically active poly(mannitol-co-PEI) modified with rabies virus glycoprotein via selective stimulation of caveolar endocytosis for RNAi therapeutics in Alzheimer's disease.</a> Biomaterials. 38, 61-71 (2015).</li><li>Bian, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+cell-based+intercellular+delivery+of+transcription+factor+GATA4+on+ischemic+cardiomyopathy.">Effect of cell-based intercellular delivery of transcription factor GATA4 on ischemic cardiomyopathy.</a> Circulation Research. 100 (11), 1626-1633 (2007).</li><li>He, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+low+molecular+weight+protamine+chemical+chimera+to+enhance+monomeric+insulin+intestinal+absorption.">The use of low molecular weight protamine chemical chimera to enhance monomeric insulin intestinal absorption.</a> Biomaterials. 34 (31), 7733-7743 (2013).</li><li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+specific+STAT3-binding+peptide+exerts+antiproliferative+effects+and+antitumor+activity+by+inhibiting+STAT3+phosphorylation+and+signaling.">A specific STAT3-binding peptide exerts antiproliferative effects and antitumor activity by inhibiting STAT3 phosphorylation and signaling.</a> Cancer Research. 74 (8), 2144-2151 (2014).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEGylated+liposomes+with+NGR+ligand+and+heat-activable+cell-penetrating+peptide-doxorubicin+conjugate+for+tumor-specific+therapy.">PEGylated liposomes with NGR ligand and heat-activable cell-penetrating peptide-doxorubicin conjugate for tumor-specific therapy.</a> Biomaterials. 35 (14), 4368-4381 (2014).</li><li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+paclitaxel+delivery+facilitated+by+a+dual-functional+CPP+with+a+hydrophobic+hairpin+tail.">Intracellular paclitaxel delivery facilitated by a dual-functional CPP with a hydrophobic hairpin tail.</a> ACS Applied Materials and Interfaces. 13 (4), 4853-4860 (2021).</li><li>Vasan, N., Baselga, J., Hyman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+view+on+drug+resistance+in+cancer.">A view on drug resistance in cancer.</a> Nature. 575 (7782), 299-309 (2019).</li><li>Cong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironment-induced+in+situ+self-assembly+of+polymer-peptide+conjugates+that+attack+solid+tumors+deeply.">Microenvironment-induced in situ self-assembly of polymer-peptide conjugates that attack solid tumors deeply.</a> Angewandte Chemie International Edition. 131 (14), 4680-4685 (2019).</li><li>Blanco, E., Shen, H., Ferrari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+nanoparticle+design+for+overcoming+biological+barriers+to+drug+delivery.">Principles of nanoparticle design for overcoming biological barriers to drug delivery.</a> Nature Biotechnology. 33 (9), 941-951 (2015).</li><li>Tian, Y., Zhou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+cell-penetrating+peptides+and+their+functionalization+of+polymeric+nanoplatforms+for+drug+delivery.">Advances in cell-penetrating peptides and their functionalization of polymeric nanoplatforms for drug delivery.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. Nanomedicine and Nanobiotechnology. 13 (2), 1-12 (2021).</li><li>Milletti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-penetrating+peptides:+Classes,+origin,+and+current+landscape.">Cell-penetrating peptides: Classes, origin, and current landscape.</a> Drug Discovery Today. 17 (15-16), 850-860 (2012).</li><li>Turner, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-penetrating+peptide+conjugates+of+peptide+nucleic+acids+(PNA)+as+inhibitors+of+HIV-1+Tat-dependent+trans-activation+in+cells.">Cell-penetrating peptide conjugates of peptide nucleic acids (PNA) as inhibitors of HIV-1 Tat-dependent trans-activation in cells.</a> Nucleic Acids Research. 33 (21), 6837-6849 (2005).</li><li>Tunnemann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+analysis+of+cell+penetration+ability+and+toxicity+of+oligo-arginines.">Live-cell analysis of cell penetration ability and toxicity of oligo-arginines.</a> Journal of Peptide Science. 14 (4), 469-476 (2008).</li><li>Shi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stapling+of+short+cell-penetrating+peptides+for+enhanced+tumor+cell-and-tissue+dual-penetration.">Stapling of short cell-penetrating peptides for enhanced tumor cell-and-tissue dual-penetration.</a> Chemical Communications. 58 (14), 2299-2302 (2022).</li><li>Komin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+peptide+for+transcellular+cargo+delivery:+Structure-function+relationship+and+mechanism+of+action.">A peptide for transcellular cargo delivery: Structure-function relationship and mechanism of action.</a> Journal of Controlled Release. 324, 633-643 (2020).</li><li>Dietrich, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+permeable+stapled+peptide+inhibitor+of+Wnt+signaling+that+targets+&#946;-catenin+protein-protein+interactions.">Cell permeable stapled peptide inhibitor of Wnt signaling that targets &#946;-catenin protein-protein interactions.</a> Cell Chemical Biology. 24 (8), 958-968 (2017).</li><li>Tian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stapling+of+unprotected+helical+peptides+via+photo-induced+intramolecular+thiol-yne+hydrothiolation.">Stapling of unprotected helical peptides via photo-induced intramolecular thiol-yne hydrothiolation.</a> Chemical Science. 7 (5), 3325-3330 (2016).</li><li>De Araujo, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+&#945;-helicity+of+cyclic+pentapeptides+in+water.">Comparative &#945;-helicity of cyclic pentapeptides in water.</a> Angewandte Chemie International Edition. 53 (27), 6965-6969 (2014).</li><li>Chu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+understanding+cell+penetration+by+stapled+peptides.">Towards understanding cell penetration by stapled peptides.</a> Medicinal Chemistry Communications. 6 (1), 111-119 (2015).</li><li>Bock, J. E., Gavenonis, J., Kritzer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+in+shape:+Controlling+peptide+bioactivity+and+bioavailability+using+conformational+constraints.">Getting in shape: Controlling peptide bioactivity and bioavailability using conformational constraints.</a> ACS Chemical Biology. 8 (3), 488-499 (2013).</li><li>Tian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+stapling+architecture+on+physiochemical+properties+and+cell+permeability+of+stapled+&#945;-helical+peptides:+A+comparative+study.">Effect of stapling architecture on physiochemical properties and cell permeability of stapled &#945;-helical peptides: A comparative study.</a> ChemBioChem. 18 (21), 2087-2093 (2017).</li><li>White, C. J., Yudin, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contemporary+strategies+for+peptide+macrocyclization.">Contemporary strategies for peptide macrocyclization.</a> Nature Chemistry. 3 (7), 509-524 (2011).</li><li>Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalization+of+tumor+vasculature:+An+emerging+concept+in+antiangiogenic+therapy.">Normalization of tumor vasculature: An emerging concept in antiangiogenic therapy.</a> Science. 307 (5706), 58-62 (2005).</li><li>Patgiri, A., Menzenski, M. Z., Mahon, A. B., Arora, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-phase+synthesis+of+short+&#945;-helices+stabilized+by+the+hydrogen+bond+surrogate+approach.">Solid-phase synthesis of short &#945;-helices stabilized by the hydrogen bond surrogate approach.</a> Nature Protocols. 5 (11), 1857-1865 (2010).</li><li>Baek, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+stapled+p53+peptide+bound+to+Mdm2.">Structure of the stapled p53 peptide bound to Mdm2.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (1), 103-106 (2012).</li><li>Traboulsi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrocyclic+cell+penetrating+peptides:+A+study+of+structure-penetration+properties.">Macrocyclic cell penetrating peptides: A study of structure-penetration properties.</a> Bioconjugate Chemistry. 26 (3), 405-411 (2015).</li><li>Tian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proline-derived+transannular+N-cap+for+nucleation+of+short+&#945;-helical+peptides.">A proline-derived transannular N-cap for nucleation of short &#945;-helical peptides.</a> Chemical Communications. 52 (59), 9275-9278 (2016).</li><li>Muppidi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+proteolytically+stable,+cell-permeable+peptide-based+selective+Mcl-1+inhibitors.">Rational design of proteolytically stable, cell-permeable peptide-based selective Mcl-1 inhibitors.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (36), 14734-14737 (2012).</li><li>Wiradharma, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+cationic+amphiphilic+&#945;-helical+peptides+as+antimicrobial+agents.">Synthetic cationic amphiphilic &#945;-helical peptides as antimicrobial agents.</a> Biomaterials. 32 (8), 2204-2212 (2011).</li><li>Jones, A. T., Sayers, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+entry+of+cell+penetrating+peptides:+Tales+of+tails+wagging+dogs.">Cell entry of cell penetrating peptides: Tales of tails wagging dogs.</a> Journal of Controlled Release. 161 (2), 582-591 (2012).</li></ol>

De chemische stabilisatie van peptiden door conformationele beperkingen op te nemen, is een effectieve strategie gebleken voor het verbeteren van de stabiliteit en celdoorlaatbaarheid van het peptide26. In dit protocol wordt een stapsgewijze procedure beschreven voor de synthese van cyclische CPP's met aromatische dwarsverbanden en de evaluatie van hun permeabiliteit over biologische barrières heen. Vergeleken met de hydrofiele lactam- of triazoolkruisverbindingen22,27, ve...

De afgelopen decennia zijn getuige geweest van snelle vooruitgang in de ontwikkeling van celdoordringende peptiden (CPP's) voor medicijnafgifte. CPP's zijn op grote schaal gebruikt als moleculaire transporters voor de behandeling van een reeks levensbedreigende ziekten, waaronder neurologische aandoeningen1,2, hartaandoeningen3, diabetes4, dermatose5 en kanker 6,7. Kanker blijft een wereldwijde gezondheidslast die gepaard gaat met een hoge mate van morbiditeit en mortaliteit, ondanks wijdverspreide onderzoeksinspanningen8. Een ernstig obstakel voor de behandeling van kanker is de beperkte toegang van therapeutica tot diepere tumorcellen als gevolg van fysiologische barrières zoals compacte extracellulaire matrix (ECM), abnormale tumorvasculatuur, meerdere membraanbarrières en hoge interstitiële vloeistofdruk (IFP)9. Daarom wordt het ontwikkelen van nieuwe CPP's met een superieur vermogen om ladingen over biologische barrières te leveren beschouwd als een essentiële strategie voor de behandeling van kanker10,11.
CPP's kunnen worden onderverdeeld in kationische, amfipathische en hydrofobe CPP's in termen van hun fysisch-chemische eigenschappen12. Onder deze, de positief geladen HIV-TAT peptide en de synthetische polyarginine zijn van aanzienlijk belang in biomedisch onderzoek en zijn uitgebreid bestudeerd om intracellulaire drug deliveryte vergemakkelijken 13. Tunnemann et al. rapporteerden dat een minimale lengte van acht arginines essentieel is voor efficiënte celpenetratie van de synthetische polyargininepeptiden, gebaseerd op een celpermeabiliteitsstudie uitgevoerd met R3 tot R12-peptiden14. Deze CPP's hebben echter over het algemeen een korte plasmahalfwaardetijd vanwege hun snelle hydrolyse in vivo. Bovendien is er weinig bekend over de optimalisatie van de chemische structuur van CPP's om hun transbarrièrevermogen te vergroten, omdat het een uitdaging is om meerdere celmembranen te penetreren15. Daarom is de ontwikkeling van nieuwe moleculaire transporters die in staat zijn om biologische barrières te penetreren sterk gewenst om de efficiëntie van de medicijnafgifte te verbeteren. In 2020 ontdekten Komin et al.16 een CPP genaamd CL-peptide, dat een helixmotief (RLLRLLR) en een polyargininestaart (R7) bevat voor het kruisen van de epitheliale monolaag. Een reeks CL-peptidevarianten werd ook gesynthetiseerd door het spiraalvormige patroon te veranderen. Deze verkenning zou een belangrijke leidraad kunnen zijn voor de ontwikkeling van nieuwe CPP's voor de levering van ladingen over biologische barrières. Bovendien optimaliseerden Dietrich et al. de celdoorlaatbaarheid van het StAX-peptide, waardoor de Wnt/β-catenine-signaleringsroute werd geremd door de algehele hydrofobiciteit van de peptiden te verhogen17.
Conformatiebeperking van ongestructureerde lineaire peptiden door cyclisatie is een effectieve manier om hun proteolytische stabiliteit en permeabliteit te verbeteren18,19,20. De structurele versterking verhoogt de proteaseweerstand van cyclische peptiden, waardoor ze in vivo stabieler zijn in vergelijking met hun lineaire tegenhangers. Bovendien kan de cyclisatie van peptiden mogelijk de polaire peptide-ruggengraat maskeren door intramoleculaire waterstofbinding te bevorderen, waardoor de membraandoorlaatbaarheid van de peptiden wordt verhoogd21. In de afgelopen twee decennia zijn chemoselectieve cyclisatiemethoden effectieve strategieën geworden voor de constructie van cyclische peptiden met verschillende architecturen, zoals all-hydrocarbon, lactam, triazole, m-xyleen, perfluoroaryl en andere cross-links22,23. De biologische barrière opgelegd door de geavanceerde tumormicro-omgeving zou de penetratie van geneesmiddelen in solide tumoren kunnen verminderen24. We hebben eerder ontdekt dat de cyclische CPP's een superieure weerstand tegen enzymatische spijsvertering vertoonden ten opzichte van hun lineaire tegenhangers20. Bovendien is de algehele hydrofobiciteit van de peptiden van cruciaal belang voor hun verbeterde celdoorlaatbaarheid22. Op basis van de hierboven besproken studies kan de combinatie van een positief geladen patroon, verhoogde algehele hydrofobiciteit en verbeterde proteolysestabiliteit worden verondersteld om de permeabiliteit van CPP's over biologische barrières heen te vergroten. In een recente studie identificeerden we twee cyclische CPP's met aromatische crosslinks op posities i en i + 7 die een verbeterde permeabiliteit in tumorcellen en weefsels vertonen in vergelijking met hun lineaire tegenhangers15. Hier wordt een beknopt synthetisch protocol gepresenteerd voor de synthese van fluorescerend gelabelde cyclische CPP's en de belangrijkste stappen om hun permeabiliteit te onderzoeken.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-ethanedithiol</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>K1722093</td>
			<td>stench</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(7-Azobenzotriazole)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU)</td>
			<td>HEOWNS</td>
			<td>A-0443697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4,4&#39;-bis(bromomethyl)biphenyl</td>
			<td>TCI</td>
			<td>B1921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4T1 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>4T1 cells were cultured in DMEM medium supplemented with 10% FBS (Hyclone) in a 37 &#176;C humidified incubator containing 5% CO2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile&#160;</td>
			<td>Adamas</td>
			<td>1484971</td>
			<td>toxicity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Energy</td>
			<td>W330229</td>
			<td>skin harmful</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl ether</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>673811</td>
			<td>flammable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST038</td>
			<td>skin harmful</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrospray Ionization Mass Spectrometer</td>
			<td>Waters</td>
			<td>G2-S Tof</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA)</td>
			<td>BioFroxx</td>
			<td>1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>CytoFLEX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein isothiocyanate isomer (FITC)</td>
			<td>Energy</td>
			<td>E0801812500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Axio Observer 7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fmoc-Arg(Pbf)-OH</td>
			<td>HEOWNS</td>
			<td>F-81070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fmoc-Cys(Trt)-OH</td>
			<td>GL Biochem</td>
			<td>GLS201115-35202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fmoc-&#946;Ala-OH</td>
			<td>Adamas</td>
			<td>51341C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>HeLa cells were cultured in DMEM supplemented with 10% FBS (Hyclone) in a 37 &#176;C humidified incubator containing 5% CO2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Performance Liquid Chromatography</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Agilent 1260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Performance Liquid Chromatography column</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Poroshell EC-C18 120, 4.6 &#215; 150 mm (pore size 120 &#197;, particle size 4 &#956;m)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer</td>
			<td>SP Scientific</td>
			<td>Vir Tis</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>9758</td>
			<td>toxicity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtiter plate</td>
			<td>Thermo &#956;drop plate</td>
			<td>N12391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Morpholine</td>
			<td>HEOWNS</td>
			<td>M99040</td>
			<td>irritant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-technology microplate reader</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>VARIOSKAN LUX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-Diisopropylethylamine</td>
			<td>HEOWNS</td>
			<td>E-81416</td>
			<td>irritant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-Dimethyl formamide</td>
			<td>Energy</td>
			<td>B020051</td>
			<td>harmful to skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-Prep column</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7321010</td>
			<td>polypropylene chromatography columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rink Amide MBHA resin (0.572 mmol/g)</td>
			<td>GL Biochem</td>
			<td>GLS180301-49101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Three-way stopcocks</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7328107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plate insert</td>
			<td>LABSELECT</td>
			<td>14211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>HEOWNS</td>
			<td>T63278</td>
			<td>corrosive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triisopropylsilane</td>
			<td>HEOWNS</td>
			<td>T-0284475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>BioFroxx</td>
			<td>1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum manifold</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A7231</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

construction of cyclic cell-penetrating peptides for enhanced penetration of biological barriers

Kanker is een grote uitdaging geweest in de wereldwijde gezondheid. De complexe micro-omgeving van de tumor beperkt echter over het algemeen de toegang van therapeutica tot diepere tumorcellen, wat leidt tot tumorrecidief. Om de beperkte penetratie van biologische barrières te overwinnen, zijn celdoordringende peptiden (CPP's) ontdekt met een uitstekend membraantranslocatievermogen en zijn ze naar voren gekomen als nuttige moleculaire transporters voor het afleveren van verschillende ladingen in cellen. Conventionele lineaire CPP's vertonen echter over het algemeen een gecompromitteerde proteolytische stabiliteit, wat hun permeabiliteit over biologische barrières beperkt. De ontwikkeling van nieuwe moleculaire transporters die biologische barrières kunnen binnendringen en een verbeterde proteolytische stabiliteit vertonen, is dus zeer gewenst om de efficiëntie van de toediening van geneesmiddelen in biomedische toepassingen te bevorderen. We hebben eerder een panel van korte cyclische CPP's gesynthetiseerd met aromatische crosslinks, die een superieure permeabiliteit in kankercellen en weefsels vertoonden in vergelijking met hun lineaire tegenhangers. Hier wordt een beknopt protocol beschreven voor de synthese van het fluorescerend gelabelde cyclische polyarginine R8-peptide en zijn lineaire tegenhanger, evenals belangrijke stappen voor het onderzoeken van hun celpermeabiliteit.

In dit protocol werd een synthetische procedure gepresenteerd om de lineaire polyarginine R8 in zijn cyclische vorm te beperken. De SPPS werd handmatig uitgevoerd met behulp van een eenvoudig apparaat (figuur 1). Het gedetailleerde synthetische proces van SPPS is weergegeven in figuur 2. Kortom, de hars was voldoende opgezwollen, gevolgd door deprotection van de N α-Fmoc beschermingsgroep. Vervolgens werd het N-α-Fmoc-beschermde ami...

Watch this Scientific Journal Video about Construction of Cyclic Cell-Penetrating Peptides for Enhanced Penetration of Biological Barriers at JoVE.com

Construction of Cyclic Cell-Penetrating Peptides for Enhanced Penetration of Biological Barriers

Dit protocol beschrijft de synthese van cyclische celdoordringende peptiden met aromatische dwarsverbanden en de evaluatie van hun permeabiliteit over biologische barrières heen.

Constructie van cyclische celdoordringende peptiden voor verbeterde penetratie van biologische barrières

Cancer has been a grand challenge in global health. However, the complex tumor microenvironment generally limits the access of therapeutics to deeper ...

Een ernstig obstakel voor de behandeling van kanker is de beperkte toegang van therapeutica tot diepere tumorcellen als gevolg van fysiologische barrières. De ontwikkeling van nieuwe moleculaire transporters die in staat zijn om biologische barrières te behandelen, is dus sterk gewenst om de efficiëntie van de medicijnafgifte te verbeteren. Het doel van deze procedure is om de cyclische celdoordringende peptiden te synthetiseren voor verbeterde cel-tot-cel penetratie.Het voordeel van deze methode is dat de peptidecyclisatie gemakkelijk kan worden bereikt door substitutiereacties met cysteïnes en hars zonder dat er metaalkatalysatoren nodig zijn. De opname van aromatische cross-links verbetert de algehele hydrofobiciteit van de peptiden in vergelijking met de hydrofiele lactam- of triazoolkruisverbindingen, waardoor hun permeabiliteit wordt verbeterd. Monteer om te beginnen het handmatige peptidesyntheseapparaat in de zuurkast.Plaats de driewegkranen op het vacuümspruitstuk en sluit ze aan op stikstof. Zorg ervoor dat u de ongebruikte inlaten afsluit. Bevestig een polypropyleenkolom van 10 milliliter op de driewegkranen en giet het reactiemengsel of de oplosmiddelen uit de polypropyleenkolom af met behulp van een rubberen pipetbol of een vacuüm via een afvalvanger.Om de hars voor te bereiden op peptidesynthese, voegt u 4 tot 5 milliliter DMF toe aan de vereiste hoeveelheid hars en brengt u deze over naar de polypropyleenkolom met zachte stikstof die gedurende 30 minuten borrelt om de hars voldoende op te zwellen. Giet de DMF af en voeg 4 tot 5 milliliter 50%morfoline/DMF toe aan de hars. Bor stikstof voorzichtig gedurende 30 minuten om de N-terminale Fmoc-groep te verwijderen en laat het mengsel vervolgens uitlekken.Was de hars drie keer grondig door 4 tot 5 milliliter DMF aan de kolom toe te voegen en elke keer minstens 1 minuut met stikstof te borrelen. Was de hars op dezelfde manier drie keer met dichloormethaan en drie keer met DMF. Los vervolgens 648,8 milligram Fmoc en PBF-beschermde arginine en 372,6 milligram HATU op in 5 milliliter DMF in een centrifugebuis.Voeg 348,4 microliter DIPEA toe om de koppelingsreactie te activeren en breng het reactiemengsel over naar de polypropyleenkolom met hars. Roer het mengsel voorzichtig met borrelende stikstof gedurende 1 tot 2 uur en herhaal de koppelingsreactie dan eenmaal. Giet het reactiemengsel af en was de hars achtereenvolgens met DMF, dichloormethaan en nogmaals DMF drie keer elk gedurende ten minste 1 minuut per keer.Verwijder de Fmoc-beschermende groep en was de hars volgens de eerder getoonde procedure voordat u doorgaat met het koppelen van het volgende aminozuur. Koppel vervolgens de bèta-alanine als een afstandhouder voor FITC-etikettering met behulp van hetzelfde proces dat wordt getoond voor aminozuurkoppeling en voeg vervolgens een mengsel van FITC, DIPEA en DMF toe aan de polypropyleenkolom in het donker om FITC-etikettering van peptiden op de hars uit te voeren. De reactie zou bijna 8 uur duren.Om de cyclisatie van het lineaire peptide uit te voeren, voegt u gedurende 2 minuten een mengsel van trifluorazijnzuur, triisopropylsilaan en dichloormethaan toe aan de polypropyleenkolom om selectief de trityl-beschermende groep cysteïne te verwijderen. Giet het mengsel af en herhaal de procedure totdat de gelige oplossing kleurloos wordt om de trityl-beschermende groep volledig te verwijderen. Voer opeenvolgende wasbeurten van de hars uit met DMF en dichloormethaan ten minste drie keer en los 4, 4'bis-broommethyl-bifenyl op in DMF met DIPEA.Voeg de oplossing toe aan de kolom en reageer gedurende 4 uur. Was de hars met 4 tot 5 milliliter methanol twee keer gedurende vijf minuten elk en droog het met een continue stroom stikstof. Voor peptiden die cysteïnes bevatten, behandel de hars met een effectieve splitsingscocktail van trifluorazijnzuur, triisopropylsilaan en water of trifluorazijnzuur, triisopropylsilaan, 1, 2-ethanedithiol en water.Behandel de peptidegebonden hars gedurende 2 tot 3 uur om het peptide te splitsen en verwijder vervolgens het trifluorazijnzuur voorzichtig met een stroom stikstof. Om de ruwe peptiden te verkrijgen, voegt u 4 tot 5 milliliter diethylether toe aan het gekloofde peptidepreparaat om de ruwe peptiden neer te slaan en centrifugeert u gedurende 4 minuten op 10.000 x g. Gooi het supernatant voorzichtig weg en droog het peptide gedurende 3 minuten aan de lucht in een effectieve zuurkast.Los het kleinschalige ruwe peptide op in 800 microliter acetonitril en analyseer het vervolgens met behulp van omgekeerde fase high-performance vloeistofchromatografie en vloeistofchromatografie-massaspectrometrie. Ent 100.000 HeLa-cellen in 2 milliliter DMEM in een 12-putkamer met een weefselkweekplaatinzet en incubeer gedurende 24 uur in een bevochtigde incubator van 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide. Verwijder het medium en incuber de cellen in de kamers met 1 milliliter 10 micromolaire FITC-R8 of FITC-sR8-4 in FBS-vrije DMEM gedurende 1 uur.Verwijder daarna het medium met de peptiden en was de cellen drie keer met 1 milliliter PBS. Voeg 1 milliliter verse FBS-vrije DMEM toe aan de kamers en co-incubeer vervolgens de HeLa-cellen in de kamer met de weefselkweekplaatinzet, met de HeLa-cellen op de ronde coverslips aan de onderkant gedurende 2 uur. Bevestig de HeLa-cellen op de ronde coverslips met 2,5% glutaaraldehyde gedurende 15 minuten en kleurt de cellen vervolgens gedurende 15 minuten met DAPI.Observeer ten slotte de HeLa-cellen op de coverslips onder een fluorescentiemicroscoop. Een schematisch diagram van de synthese van FITC-gelabeld lineair R8-peptide en FITC-gelabeld genietbaar R8-peptide wordt hier gepresenteerd. De HPLC- en MS-spectra van het lineaire R8-peptide en het nietje R8-peptide zijn in deze figuur weergegeven.De retentietijd van het geniete peptide was aanzienlijk langer dan die van het lineaire analoog, wat wijst op een verhoogde algehele hydrofobiciteit van het peptide na cyclisatie met de hydrofobe crosslink. Deze grafische afbeelding toont de stabiliteit van het lineaire peptide en het geniete peptide in aanwezigheid van 25% FBS. De cyclische R8 blijft 77,3% intact na incubatie met FBS gedurende 4 uur, terwijl zijn lineaire tegenhanger grotendeels werd afgebroken, wat wijst op een verbeterde proteolytische stabiliteit van het cyclische R8-peptide.Live-cell fluorescentiemicroscopiebeelden van HeLa-cellen en 4T1-cellen na 1 uur incubatie met 3 micromolair FITC-gelabeld lineair R8-peptide en FITC-gelabeld genietbaar R8-peptide worden hier getoond. Het is te zien dat de cellen behandeld met cyclisch R8 met aromatische cross-link een hogere intracellulaire fluorescentie vertoonden dan die behandeld met hun lineaire tegenhanger. Vergelijkbare resultaten werden verkregen met flowcytometrie-analyse.Om verder te onderzoeken of cyclisch R8 een verbeterde cel-tot-cel penetratie verleent, werden transwell-modellen gebruikt om de barrièrepermeabiliteit van de peptiden van de ene cellaag naar de andere te simuleren. De cyclische R8 vertoonde duidelijk een hogere trans-barrièrepenetratie dan het lineaire R8-peptide, zoals aangegeven door een significante toename van intracellulaire fluorescentie. Volledige deprotectie van de tritylgroep van cysteïne en hars is belangrijk voor de volgende cyclisatiestap.Bovendien hangt de cyclisatie-efficiëntie ook af van de specifieke sequenties en de lengtes van de peptiden als gevolg van sterische effecten. In een dergelijk geval zou het nuttig zijn om een hars met een lager laadvermogen of cyclisatie van de peptiden onder verdunde concentraties in de oplossingsfase te gebruiken. Deze cyclische peptiden vertoonden een verbeterde cel-tot-cel permeabiliteit in vergelijking met hun lineaire tegenhangers.Wij geloven dat ze een grote belofte inhouden voor het overwinnen van biologische barrières en zullen worden gebruikt voor een moleculaire voor verdere toepassingen op het gebied van medicijnafgifte.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Microwave-assisted Functionalization of Poly(ethylene glycol) and On-resin Peptides for Use in Chain Polymerizations and Hydrogel Formation

Microwave-assisted Functionalization of Polyethylene glycol and On-resin Peptides for Use in Chain Polymerizations and Hydrogel Formation

Microgolven Functionalisering van poly (ethyleenglycol) en On-hars Peptiden voor gebruik in Chain Polymerisaties en Hydrogel Vorming

One of the main benefits to using poly(ethylene glycol) (PEG) macromers in hydrogel formation is synthetic versatility. The ability to draw from a large ...

Formation of Ordered Biomolecular Structures by the Self-assembly of Short Peptides

Vorming van Bestelde Biomoleculaire structuren door de zelf-assemblage van korte peptiden

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control ...

Preparation of Hydrophobic Metal-Organic Frameworks via Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition of Perfluoroalkanes for the Removal of Ammonia

Voorbereiding van hydrofobe Metal-Organic Frameworks via Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition van perfluoralkanen voor de verwijdering van ammoniak

Plasma enhanced chemical vapor deposition (PECVD) of perfluoroalkanes has long been studied for tuning the wetting properties of surfaces. For high ...

Preparation of Highly Porous Coordination Polymer Coatings on Macroporous Polymer Monoliths for Enhanced Enrichment of Phosphopeptides

Voorbereiding van de zeer poreuze Coordination Polymer Coatings op Macroporeuze Polymer Monoliths voor Enhanced Verrijking van fosfopeptiden

We describe a protocol for the preparation of hybrid materials based on highly porous coordination polymer coatings on the internal surface of macroporous ...

A Filter-based Surface Enhanced Raman Spectroscopic Assay for Rapid Detection of Chemical Contaminants

A-filter op basis Surface Enhanced Raman spectroscopische test voor snelle opsporing van chemische verontreinigingen

We demonstrate a method to fabricate highly sensitive surface-enhanced Raman spectroscopic (SERS) substrates using a filter syringe system that can be ...

Construction of Models for Nondestructive Prediction of Ingredient Contents in Blueberries by Near-infrared Spectroscopy Based on HPLC Measurements

Bouw van modellen voor destructieve Voorspelling van Ingredient Inhoud in Bosbessen door Near-Infrared Spectroscopy Op basis van HPLC Metingen

Nondestructive prediction of ingredient contents of farm products is useful to ship and sell the products with guaranteed qualities. Here, near-infrared ...

Synthesis of Cyclic Polymers and Characterization of Their Diffusive Motion in the Melt State at the Single Molecule Level

Synthese van cyclische polymeren en karakterisering van hun Diffusive Motion in de Smelt staat bij de Single Molecule niveau

We demonstrate a method for the synthesis of cyclic polymers and a protocol for characterizing their diffusive motion in a melt state at the single ...

Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy

Inzicht in de interacties van aminozuren en peptiden met anorganische materialen met behulp van enkel-molecuul Force Spectroscopie

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals ...

Observation and Analysis of Blinking Surface-enhanced Raman Scattering

Observatie en analyse van de blinkende oppervlakte-enhanced Raman verstrooiing

From a single molecule at a silver nanoaggregate junction, blinking surface-enhanced Raman scattering (SERS) is observed. Here, a protocol is presented on ...