Name: construction of cyclic cell-penetrating peptides for enhanced penetration of biological barriers
Uploaded: 2022-09-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Construction of Cyclic Cell-Penetrating Peptides for Enhanced Penetration of Biological Barriers at JoVE.com

Ce travail est soutenu par la Fondation des sciences naturelles de Chine (21708031), la Fondation chinoise des sciences postdoctorales (BX20180264, 2018M643519) et les Fonds de recherche fondamentale pour les universités centrales (2682021ZTPY075).

1. Préparation de l’équipement
NOTE: Effectuez toutes les procédures dans une hotte de fonctionnement avec un équipement de protection individuelle approprié.
<ol><li>Assembler l’appareil manuel de synthèse peptidique dans la hotte (Figure 1). Placez les robinets d’arrêt à trois voies (voir Tableau des matériaux) sur le collecteur à vide (voir Tableau des matériaux) et connectez-les à l’azote...

<ol>
	<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-targeted+dual+site-selective+functionalized+poly(&#946;-amino+esters)+delivery+platform+for+nerve+regeneration.">Brain-targeted dual site-selective functionalized poly(&#946;-amino esters) delivery platform for nerve regeneration.</a> Nano Letters. 21 (7), 3007-3015 (2021).</li><li>Park, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+BBB+permeability+of+osmotically+active+poly(mannitol-co-PEI)+modified+with+rabies+virus+glycoprotein+via+selective+stimulation+of+caveolar+endocytosis+for+RNAi+therapeutics+in+Alzheimer's+disease.">Enhanced BBB permeability of osmotically active poly(mannitol-co-PEI) modified with rabies virus glycoprotein via selective stimulation of caveolar endocytosis for RNAi therapeutics in Alzheimer's disease.</a> Biomaterials. 38, 61-71 (2015).</li><li>Bian, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+cell-based+intercellular+delivery+of+transcription+factor+GATA4+on+ischemic+cardiomyopathy.">Effect of cell-based intercellular delivery of transcription factor GATA4 on ischemic cardiomyopathy.</a> Circulation Research. 100 (11), 1626-1633 (2007).</li><li>He, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+low+molecular+weight+protamine+chemical+chimera+to+enhance+monomeric+insulin+intestinal+absorption.">The use of low molecular weight protamine chemical chimera to enhance monomeric insulin intestinal absorption.</a> Biomaterials. 34 (31), 7733-7743 (2013).</li><li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+specific+STAT3-binding+peptide+exerts+antiproliferative+effects+and+antitumor+activity+by+inhibiting+STAT3+phosphorylation+and+signaling.">A specific STAT3-binding peptide exerts antiproliferative effects and antitumor activity by inhibiting STAT3 phosphorylation and signaling.</a> Cancer Research. 74 (8), 2144-2151 (2014).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEGylated+liposomes+with+NGR+ligand+and+heat-activable+cell-penetrating+peptide-doxorubicin+conjugate+for+tumor-specific+therapy.">PEGylated liposomes with NGR ligand and heat-activable cell-penetrating peptide-doxorubicin conjugate for tumor-specific therapy.</a> Biomaterials. 35 (14), 4368-4381 (2014).</li><li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+paclitaxel+delivery+facilitated+by+a+dual-functional+CPP+with+a+hydrophobic+hairpin+tail.">Intracellular paclitaxel delivery facilitated by a dual-functional CPP with a hydrophobic hairpin tail.</a> ACS Applied Materials and Interfaces. 13 (4), 4853-4860 (2021).</li><li>Vasan, N., Baselga, J., Hyman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+view+on+drug+resistance+in+cancer.">A view on drug resistance in cancer.</a> Nature. 575 (7782), 299-309 (2019).</li><li>Cong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironment-induced+in+situ+self-assembly+of+polymer-peptide+conjugates+that+attack+solid+tumors+deeply.">Microenvironment-induced in situ self-assembly of polymer-peptide conjugates that attack solid tumors deeply.</a> Angewandte Chemie International Edition. 131 (14), 4680-4685 (2019).</li><li>Blanco, E., Shen, H., Ferrari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+nanoparticle+design+for+overcoming+biological+barriers+to+drug+delivery.">Principles of nanoparticle design for overcoming biological barriers to drug delivery.</a> Nature Biotechnology. 33 (9), 941-951 (2015).</li><li>Tian, Y., Zhou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+cell-penetrating+peptides+and+their+functionalization+of+polymeric+nanoplatforms+for+drug+delivery.">Advances in cell-penetrating peptides and their functionalization of polymeric nanoplatforms for drug delivery.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. Nanomedicine and Nanobiotechnology. 13 (2), 1-12 (2021).</li><li>Milletti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-penetrating+peptides:+Classes,+origin,+and+current+landscape.">Cell-penetrating peptides: Classes, origin, and current landscape.</a> Drug Discovery Today. 17 (15-16), 850-860 (2012).</li><li>Turner, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-penetrating+peptide+conjugates+of+peptide+nucleic+acids+(PNA)+as+inhibitors+of+HIV-1+Tat-dependent+trans-activation+in+cells.">Cell-penetrating peptide conjugates of peptide nucleic acids (PNA) as inhibitors of HIV-1 Tat-dependent trans-activation in cells.</a> Nucleic Acids Research. 33 (21), 6837-6849 (2005).</li><li>Tunnemann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+analysis+of+cell+penetration+ability+and+toxicity+of+oligo-arginines.">Live-cell analysis of cell penetration ability and toxicity of oligo-arginines.</a> Journal of Peptide Science. 14 (4), 469-476 (2008).</li><li>Shi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stapling+of+short+cell-penetrating+peptides+for+enhanced+tumor+cell-and-tissue+dual-penetration.">Stapling of short cell-penetrating peptides for enhanced tumor cell-and-tissue dual-penetration.</a> Chemical Communications. 58 (14), 2299-2302 (2022).</li><li>Komin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+peptide+for+transcellular+cargo+delivery:+Structure-function+relationship+and+mechanism+of+action.">A peptide for transcellular cargo delivery: Structure-function relationship and mechanism of action.</a> Journal of Controlled Release. 324, 633-643 (2020).</li><li>Dietrich, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+permeable+stapled+peptide+inhibitor+of+Wnt+signaling+that+targets+&#946;-catenin+protein-protein+interactions.">Cell permeable stapled peptide inhibitor of Wnt signaling that targets &#946;-catenin protein-protein interactions.</a> Cell Chemical Biology. 24 (8), 958-968 (2017).</li><li>Tian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stapling+of+unprotected+helical+peptides+via+photo-induced+intramolecular+thiol-yne+hydrothiolation.">Stapling of unprotected helical peptides via photo-induced intramolecular thiol-yne hydrothiolation.</a> Chemical Science. 7 (5), 3325-3330 (2016).</li><li>De Araujo, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+&#945;-helicity+of+cyclic+pentapeptides+in+water.">Comparative &#945;-helicity of cyclic pentapeptides in water.</a> Angewandte Chemie International Edition. 53 (27), 6965-6969 (2014).</li><li>Chu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+understanding+cell+penetration+by+stapled+peptides.">Towards understanding cell penetration by stapled peptides.</a> Medicinal Chemistry Communications. 6 (1), 111-119 (2015).</li><li>Bock, J. E., Gavenonis, J., Kritzer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+in+shape:+Controlling+peptide+bioactivity+and+bioavailability+using+conformational+constraints.">Getting in shape: Controlling peptide bioactivity and bioavailability using conformational constraints.</a> ACS Chemical Biology. 8 (3), 488-499 (2013).</li><li>Tian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+stapling+architecture+on+physiochemical+properties+and+cell+permeability+of+stapled+&#945;-helical+peptides:+A+comparative+study.">Effect of stapling architecture on physiochemical properties and cell permeability of stapled &#945;-helical peptides: A comparative study.</a> ChemBioChem. 18 (21), 2087-2093 (2017).</li><li>White, C. J., Yudin, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contemporary+strategies+for+peptide+macrocyclization.">Contemporary strategies for peptide macrocyclization.</a> Nature Chemistry. 3 (7), 509-524 (2011).</li><li>Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalization+of+tumor+vasculature:+An+emerging+concept+in+antiangiogenic+therapy.">Normalization of tumor vasculature: An emerging concept in antiangiogenic therapy.</a> Science. 307 (5706), 58-62 (2005).</li><li>Patgiri, A., Menzenski, M. Z., Mahon, A. B., Arora, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-phase+synthesis+of+short+&#945;-helices+stabilized+by+the+hydrogen+bond+surrogate+approach.">Solid-phase synthesis of short &#945;-helices stabilized by the hydrogen bond surrogate approach.</a> Nature Protocols. 5 (11), 1857-1865 (2010).</li><li>Baek, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+stapled+p53+peptide+bound+to+Mdm2.">Structure of the stapled p53 peptide bound to Mdm2.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (1), 103-106 (2012).</li><li>Traboulsi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrocyclic+cell+penetrating+peptides:+A+study+of+structure-penetration+properties.">Macrocyclic cell penetrating peptides: A study of structure-penetration properties.</a> Bioconjugate Chemistry. 26 (3), 405-411 (2015).</li><li>Tian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proline-derived+transannular+N-cap+for+nucleation+of+short+&#945;-helical+peptides.">A proline-derived transannular N-cap for nucleation of short &#945;-helical peptides.</a> Chemical Communications. 52 (59), 9275-9278 (2016).</li><li>Muppidi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+proteolytically+stable,+cell-permeable+peptide-based+selective+Mcl-1+inhibitors.">Rational design of proteolytically stable, cell-permeable peptide-based selective Mcl-1 inhibitors.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (36), 14734-14737 (2012).</li><li>Wiradharma, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+cationic+amphiphilic+&#945;-helical+peptides+as+antimicrobial+agents.">Synthetic cationic amphiphilic &#945;-helical peptides as antimicrobial agents.</a> Biomaterials. 32 (8), 2204-2212 (2011).</li><li>Jones, A. T., Sayers, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+entry+of+cell+penetrating+peptides:+Tales+of+tails+wagging+dogs.">Cell entry of cell penetrating peptides: Tales of tails wagging dogs.</a> Journal of Controlled Release. 161 (2), 582-591 (2012).</li></ol>

La stabilisation chimique des peptides par l’incorporation de contraintes conformationnelles s’est avérée être une stratégie efficace pour améliorer la stabilité et la perméabilité cellulaire du peptide26. Dans ce protocole, une procédure étape par étape est décrite pour la synthèse de CPP cycliques avec des réticulations aromatiques et l’évaluation de leur perméabilité à travers les barrières biologiques. Par rapport aux réticulations hydrophiles lactamines ou triazoles<...

Les dernières décennies ont vu des progrès rapides dans le développement de peptides pénétrant dans les cellules (CPP) pour l’administration de médicaments. Les CPP ont été largement utilisés comme transporteurs moléculaires pour le traitement d’une gamme de maladies potentiellement mortelles, notamment les troubles neurologiques1,2, les maladies cardiaques3, le diabète4, la dermatose5 et le cancer 6,7. Le cancer reste un fardeau sanitaire mondial accompagné d’un taux élevé de morbidité et de mortalité malgré les efforts de recherche généralisés8. Un obstacle sérieux au traitement du cancer est l’accès limité des thérapies aux cellules tumorales plus profondes en raison de barrières physiologiques telles que la matrice extracellulaire compacte (ECM), le système vasculaire tumoral anormal, les barrières membranaires multiples et la pression élevée du liquide interstitiel (IFP)9. Ainsi, le développement de nouveaux CPP ayant une capacité supérieure à livrer des cargaisons à travers les barrières biologiques est considéré comme une stratégie essentielle pour le traitement du cancer10,11.
Les CPP peuvent être classés en CPP cationiques, amphipathiques et hydrophobes en termes de propriétés physico-chimiques12. Parmi ceux-ci, le peptide VIH-TAT chargé positivement et la polyarginine synthétique sont d’une importance considérable dans la recherche biomédicale et ont été largement étudiés pour faciliter l’administration intracellulairede médicaments 13. Tunnemann et al. ont rapporté qu’une longueur minimale de huit arginines est essentielle pour une pénétration cellulaire efficace des peptides synthétiques de polyarginine, sur la base d’une étude de perméabilité cellulaire menée à l’aide de peptides R3 à R1214. Cependant, ces CPP ont généralement des demi-vies plasmatiques courtes en raison de leur hydrolyse rapide in vivo. En outre, on sait peu de choses sur l’optimisation de la structure chimique des CPP afin d’augmenter leur capacité de trans-barrière, car il est difficile de pénétrer dans plusieurs membranes cellulaires15. Ainsi, le développement de nouveaux transporteurs moléculaires capables de pénétrer les barrières biologiques est fortement souhaité pour améliorer l’efficacité de l’administration des médicaments. En 2020, Komin et al.16 ont découvert un CPP appelé peptide CL, qui contient un motif hélicoïdal (RLLRLLR) et une queue de polyarginine (R7) pour traverser la monocouche épithéliale. Un ensemble de variantes peptidiques CL ont également été synthétisées en modifiant le motif hélicoïdal. Cette exploration pourrait être un guide important pour le développement de nouveaux CPP pour la livraison de cargaisons à travers les barrières biologiques. De plus, Dietrich et al. ont optimisé la perméabilité cellulaire du peptide StAX, inhibant la voie de signalisation Wnt / β-caténine en augmentant l’hydrophobicité globale des peptides17.
La restriction conformationnelle des peptides linéaires non structurés par cyclisation est un moyen efficace d’améliorer leur stabilité protéolytique et leur perméabilité18,19,20. Le renforcement structurel augmente la résistance à la protéase des peptides cycliques, les rendant plus stables in vivo par rapport à leurs homologues linéaires. De plus, la cyclisation des peptides peut potentiellement masquer le squelette peptidique polaire en favorisant la liaison hydrogène intramoléculaire, augmentant ainsi la perméabilité membranaire des peptides21. Au cours des deux dernières décennies, les méthodes de cyclisation chimiosélective sont devenues des stratégies efficaces pour la construction de peptides cycliques avec différentes architectures, telles que tous les hydrocarbures, lactamines, triazoles, m-xylène, perfluoroaryl et autres réticulationscroisées 22,23. La barrière biologique imposée par le microenvironnement tumoral sophistiqué pourrait réduire la pénétration des médicaments dans les tumeurs solides24. Nous avons déjà constaté que les CPP cycliques présentaient une résistance supérieure à la digestion enzymatique par rapport à leurs homologues linéaires20. De plus, l’hydrophobicité globale des peptides est essentielle pour améliorer leur perméabilité cellulaire22. D’après les études mentionnées ci-dessus, on peut émettre l’hypothèse que la combinaison d’un profil chargé positivement, d’une hydrophobicité globale élevée et d’une stabilité accrue de la protéolyse augmente la perméabilité des CPP à travers les barrières biologiques. Dans une étude récente, nous avons identifié deux CPP cycliques avec des réticulations aromatiques aux positions i et i+7 qui présentent une perméabilité améliorée dans les cellules et les tissus tumoraux par rapport à leurs homologues linéaires15. Ici, un protocole synthétique concis pour la synthèse de CPP cycliques marqués par fluorescence et les étapes clés pour étudier leur perméabilité sont présentés.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-ethanedithiol</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>K1722093</td>
			<td>stench</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(7-Azobenzotriazole)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU)</td>
			<td>HEOWNS</td>
			<td>A-0443697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4,4&#39;-bis(bromomethyl)biphenyl</td>
			<td>TCI</td>
			<td>B1921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4T1 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>4T1 cells were cultured in DMEM medium supplemented with 10% FBS (Hyclone) in a 37 &#176;C humidified incubator containing 5% CO2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile&#160;</td>
			<td>Adamas</td>
			<td>1484971</td>
			<td>toxicity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Energy</td>
			<td>W330229</td>
			<td>skin harmful</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl ether</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>673811</td>
			<td>flammable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST038</td>
			<td>skin harmful</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrospray Ionization Mass Spectrometer</td>
			<td>Waters</td>
			<td>G2-S Tof</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA)</td>
			<td>BioFroxx</td>
			<td>1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>CytoFLEX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein isothiocyanate isomer (FITC)</td>
			<td>Energy</td>
			<td>E0801812500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Axio Observer 7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fmoc-Arg(Pbf)-OH</td>
			<td>HEOWNS</td>
			<td>F-81070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fmoc-Cys(Trt)-OH</td>
			<td>GL Biochem</td>
			<td>GLS201115-35202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fmoc-&#946;Ala-OH</td>
			<td>Adamas</td>
			<td>51341C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>HeLa cells were cultured in DMEM supplemented with 10% FBS (Hyclone) in a 37 &#176;C humidified incubator containing 5% CO2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Performance Liquid Chromatography</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Agilent 1260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Performance Liquid Chromatography column</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Poroshell EC-C18 120, 4.6 &#215; 150 mm (pore size 120 &#197;, particle size 4 &#956;m)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer</td>
			<td>SP Scientific</td>
			<td>Vir Tis</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>9758</td>
			<td>toxicity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtiter plate</td>
			<td>Thermo &#956;drop plate</td>
			<td>N12391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Morpholine</td>
			<td>HEOWNS</td>
			<td>M99040</td>
			<td>irritant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-technology microplate reader</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>VARIOSKAN LUX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-Diisopropylethylamine</td>
			<td>HEOWNS</td>
			<td>E-81416</td>
			<td>irritant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-Dimethyl formamide</td>
			<td>Energy</td>
			<td>B020051</td>
			<td>harmful to skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-Prep column</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7321010</td>
			<td>polypropylene chromatography columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rink Amide MBHA resin (0.572 mmol/g)</td>
			<td>GL Biochem</td>
			<td>GLS180301-49101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Three-way stopcocks</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7328107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plate insert</td>
			<td>LABSELECT</td>
			<td>14211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>HEOWNS</td>
			<td>T63278</td>
			<td>corrosive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triisopropylsilane</td>
			<td>HEOWNS</td>
			<td>T-0284475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>BioFroxx</td>
			<td>1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum manifold</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A7231</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

construction of cyclic cell-penetrating peptides for enhanced penetration of biological barriers

Le cancer a été un grand défi pour la santé mondiale. Cependant, le microenvironnement tumoral complexe limite généralement l’accès des thérapies aux cellules tumorales plus profondes, conduisant à une récidive tumorale. Pour vaincre la pénétration limitée des barrières biologiques, des peptides pénétrant dans les cellules (CPP) ont été découverts avec une excellente capacité de translocation membranaire et sont apparus comme des transporteurs moléculaires utiles pour délivrer diverses cargaisons dans les cellules. Cependant, les CPP linéaires conventionnels présentent généralement une stabilité protéolytique compromise, ce qui limite leur perméabilité à travers les barrières biologiques. Ainsi, le développement de nouveaux transporteurs moléculaires capables de pénétrer les barrières biologiques et de présenter une stabilité protéolytique améliorée est fortement souhaité pour promouvoir l’efficacité de l’administration de médicaments dans des applications biomédicales. Nous avons déjà synthétisé un panel de CPP cycliques courts avec des réticulations aromatiques, qui ont montré une perméabilité supérieure dans les cellules et les tissus cancéreux par rapport à leurs homologues linéaires. Ici, un protocole concis est décrit pour la synthèse du peptide cyclique polyarginine R8 marqué par fluorescence et de son homologue linéaire, ainsi que des étapes clés pour étudier leur perméabilité cellulaire.

Dans ce protocole, une procédure synthétique pour contraindre la polyarginine linéaire R8 dans sa forme cyclique a été présentée. Le SPPS a été effectué manuellement à l’aide d’un appareil simple (figure 1). Le procédé synthétique détaillé de SPPS est illustré à la figure 2. Brièvement, la résine a été suffisamment gonflée, suivie d’une déprotection du groupe protecteur N α-FmoC. Ensuite, l’acide<...

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Construction of Cyclic Cell-Penetrating Peptides for Enhanced Penetration of Biological Barriers

Ce protocole décrit la synthèse de peptides cycliques pénétrant dans les cellules avec des réticulations aromatiques et l’évaluation de leur perméabilité à travers les barrières biologiques.

Construction de peptides cycliques pénétrant dans les cellules pour une pénétration accrue des barrières biologiques

Cancer has been a grand challenge in global health. However, the complex tumor microenvironment generally limits the access of therapeutics to deeper ...

Un obstacle sérieux pour le traitement du cancer est l’accès limité des thérapies aux cellules tumorales plus profondes en raison de barrières physiologiques. Ainsi, le développement de nouveaux transporteurs moléculaires capables de traiter les barrières biologiques est fortement souhaité pour améliorer l’efficacité de l’administration du médicament. Le but de cette procédure est de synthétiser les peptides cycliques pénétrant dans les cellules pour une pénétration accrue de cellule à cellule.L’avantage de cette méthode est que la cyclisation peptidique peut être facilement réalisée par des réactions de substitution avec des cystéines et de la résine sans nécessiter de catalyseurs métalliques. L’incorporation de réticulations aromatiques améliore l’hydrophobicité globale des peptides par rapport aux réticulations hydrophiles lactamines ou triazoles, améliorant ainsi leur perméabilité. Pour commencer, assemblez l’appareil manuel de synthèse peptidique dans la hotte.Placez les robinets d’arrêt à trois voies sur le collecteur à vide et reliez-les à l’azote. Assurez-vous de boucher les entrées inutilisées. Fixez une colonne en polypropylène de 10 millilitres sur les robinets d’arrêt à trois voies et vidangez le mélange réactionnel ou les solvants de la colonne en polypropylène à l’aide d’une ampoule à pipette en caoutchouc ou d’un vide via un piège à déchets.Pour préparer la résine à la synthèse peptidique, ajoutez 4 à 5 millilitres de DMF à la quantité requise de résine et transférez-la dans la colonne de polypropylène avec un léger bulle d’azote pendant 30 minutes pour gonfler la résine adéquatement. Vidangez le DMF et ajoutez 4 à 5 millilitres de morpholine/DMF à 50% à la résine. Faire verser doucement de l’azote pendant 30 minutes pour éliminer le groupe Fmoc N-terminal, puis égoutter le mélange.Lavez soigneusement la résine trois fois en ajoutant 4 à 5 millilitres de DMF à la colonne et en faisant bouillonner d’azote pendant au moins 1 minute à chaque fois. De la même manière, lavez la résine avec du dichlorométhane trois fois et du DMF trois fois. Ensuite, dissoudre 648,8 milligrammes de Fmoc et d’arginine protégée par PBF et 372,6 milligrammes de HATU dans 5 millilitres de DMF dans un tube à centrifuger.Ajouter 348,4 microlitres de DIPEA pour activer la réaction de couplage et transférer le mélange réactionnel dans la colonne de polypropylène avec de la résine. Agiter doucement le mélange avec de l’azote bouillonnant pendant 1 à 2 heures, puis répéter la réaction de couplage une fois. Égoutter le mélange réactionnel et laver la résine séquentiellement avec du DMF, du dichlorométhane et de nouveau du DMF trois fois chacun pendant au moins 1 minute à chaque fois.Retirez le groupe protecteur Fmoc et lavez la résine en suivant la procédure décrite précédemment avant de procéder au couplage de l’acide aminé suivant. Ensuite, couplez la bêta-alanine comme espaceur pour le marquage FITC en utilisant le même processus que celui montré pour le couplage d’acides aminés, puis ajoutez un mélange de FITC, DIPEA et DMF à la colonne de polypropylène dans l’obscurité pour effectuer le marquage FITC des peptides sur la résine. La réaction prendrait près de 8 heures.Pour effectuer la cyclisation du peptide linéaire, ajoutez un mélange d’acide trifluoroacétique, de triisopropylsilane et de dichlorométhane à la colonne de polypropylène pendant 2 minutes pour éliminer sélectivement le groupe trityl-protecteur de la cystéine. Égoutter le mélange et répéter la procédure jusqu’à ce que la solution jaunâtre devienne incolore pour éliminer complètement le groupe protecteur des trityles. Effectuer des lavages séquentiels de la résine avec du DMF et du dichlorométhane au moins trois fois et dissoudre le 4,4'bis-bromométhyl-biphényle dans le DMF avec le DIPEA.Ajouter la solution à la colonne et réagir pendant 4 heures. Lavez la résine avec 4 à 5 millilitres de méthanol deux fois pendant cinq minutes chacune, et séchez-la avec un flux continu d’azote. Pour les peptides contenant des cystéines, traiter la résine avec un cocktail de clivage efficace d’acide trifluoroacétique, de triisopropylsilane et d’eau ou d’acide trifluoroacétique, de triisopropylsilane, de 1 ,2-éthanedithiol et d’eau.Traitez la résine liée au peptide pendant 2 à 3 heures pour clivé le peptide, puis retirez soigneusement l’acide trifluoroacétique avec un jet d’azote. Pour obtenir les peptides bruts, ajouter 4 à 5 millilitres d’éther diéthylique à la préparation peptidique clivée pour précipiter les peptides bruts, et centrifuger à 10 000 x g pendant 4 minutes. Jetez soigneusement le surnageant et séchez le peptide à l’air libre pendant 3 minutes dans une hotte efficace.Dissoudre le peptide brut à petite échelle dans 800 microlitres d’acétonitrile, puis l’analyser en utilisant la chromatographie liquide haute performance en phase inverse et la chromatographie liquide-spectrométrie de masse. Inoculer 100 000 cellules HeLa dans 2 millilitres de DMEM dans une chambre de 12 puits avec un insert de plaque de culture tissulaire et incuber pendant 24 heures dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius contenant 5% de dioxyde de carbone. Retirez le milieu et incuber les cellules dans les chambres avec 1 millilitre de 10 micromolaires FITC-R8 ou FITC-sR8-4 dans du DMEM sans FBS pendant 1 heure.Après cela, retirez le milieu contenant les peptides et lavez les cellules trois fois avec 1 millilitre de PBS. Ajouter 1 millilitre de DMEM frais sans FBS dans les chambres, puis co-incuber les cellules HeLa dans la chambre avec l’insert de plaque de culture tissulaire, avec les cellules HeLa sur les lamelles rondes au fond pendant 2 heures. Fixez les cellules HeLa sur les lamelles rondes avec 2,5% de glutaraldéhyde pendant 15 minutes, puis colorez les cellules avec DAPI pendant 15 minutes.Enfin, observez les cellules HeLa sur les lames de couverture sous un microscope à fluorescence. Un diagramme schématique de la synthèse du peptide R8 linéaire marqué FITC et du peptide R8 agrafé marqué FITC est présenté ici. Les spectres HPLC et MS du peptide linéaire R8 et du peptide R8 agrafé sont représentés sur cette figure.Le temps de rétention du peptide agrafé était sensiblement plus long que celui de l’analogue linéaire, indiquant une hydrophobicité globale accrue du peptide après cyclisation avec la réticulation hydrophobe. Cette image graphique représente la stabilité du peptide linéaire et du peptide agrafé en présence de 25%FBS. Le R8 cyclique reste intact à 77,3% après incubation avec FBS pendant 4 heures, tandis que son homologue linéaire a été principalement dégradé, suggérant une stabilité protéolytique améliorée du peptide cyclique R8.Les images de microscopie à fluorescence de cellules vivantes de cellules HeLa et de cellules 4T1 après 1 heure d’incubation avec 3 peptides R8 linéaires marqués FITC micromolaires et peptide R8 agrafé marqué FITC sont présentées ici. On peut voir que les cellules traitées avec R8 cyclique avec réticulation aromatique présentaient une fluorescence intracellulaire plus élevée que celles traitées avec leur homologue linéaire. Des résultats similaires ont été obtenus avec l’analyse par cytométrie en flux.Pour étudier plus en détail si la R8 cyclique confère une pénétration accrue de cellule à cellule, des modèles transwell ont été utilisés pour simuler la perméabilité de la barrière des peptides d’une couche cellulaire à l’autre. Le R8 cyclique a clairement montré une pénétration trans-barrière plus élevée que le peptide linéaire R8, comme indiqué par une augmentation significative de la fluorescence intracellulaire. Une déprotection complète du groupe trityle de cystéine et de résine est importante pour l’étape de cyclisation suivante.En outre, l’efficacité de cyclisation dépend également des séquences spécifiques et des longueurs des peptides dues aux effets stériques. Dans un tel cas, l’utilisation d’une résine à faible capacité de charge ou de cyclisation des peptides sous des concentrations diluées en phase de solution serait utile. Ces peptides cycliques ont montré une perméabilité intercellulaire améliorée par rapport à leurs homologues linéaires.Nous pensons qu’ils sont très prometteurs pour vaincre les barrières biologiques et seront utilisés pour d’autres applications moléculaires dans le domaine de l’administration de médicaments.

Research

JoVE Journal

Chemistry

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One of the main benefits to using poly(ethylene glycol) (PEG) macromers in hydrogel formation is synthetic versatility. The ability to draw from a large ...

Recherche

Chimie

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Préparation de la grande porosité de coordination Polymer Coatings sur macroporeuses Polymer monolithes pour enrichissement accrue des Phosphopeptides

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Synthèse des polymères cycliques et caractérisation de leur mouvement Diffusive dans l&#39;État Melt à la molécule unique Level

We demonstrate a method for the synthesis of cyclic polymers and a protocol for characterizing their diffusive motion in a melt state at the single ...

Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy

Regards sur les interactions des acides aminés et Peptides avec matériaux inorganiques à l&#39;aide d&#39;une seule molécule de travail Spectroscopy

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